馬小倩， 楊濤， 張全， 張洪亮*

（1.河南科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院，河南 洛陽 471023；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，北京 10019）

遺傳、變異和選擇是作物育種的3個(gè)核心：遺傳是育種的本質(zhì)，變異是育種的基礎(chǔ)，而選擇則是育種的關(guān)鍵。育種即是通過解析性狀的調(diào)控基因，研究基因間的互作關(guān)系，并進(jìn)一步將不同品種中的優(yōu)良基因進(jìn)行聚合，從而選育綜合性狀優(yōu)異的新品種［1］。

遺傳學(xué)及生物技術(shù)的迅猛發(fā)展使作物育種的方法和技術(shù)也不斷得到改良和提高，從傳統(tǒng)的雜交育種到誘變育種、分子標(biāo)記輔助育種以及轉(zhuǎn)基因育種等［2］。近年來，隨著分子生物學(xué)、基因組學(xué)以及生物信息學(xué)等學(xué)科的飛速發(fā)展，逐步發(fā)展出一些新的育種方法，如基因編輯育種、分子設(shè)計(jì)育種等［3］。水稻是重要的糧食作物之一，2002年水稻基因組測(cè)序初步完成，大量的基因組數(shù)據(jù)和高密度的分子標(biāo)記遺傳圖譜為水稻新技術(shù)育種奠定了良好的基礎(chǔ)。本文著重總結(jié)了幾種新型育種技術(shù)在水稻中的應(yīng)用，并對(duì)其發(fā)展前景進(jìn)行了展望，以期為水稻種業(yè)發(fā)展奠定基礎(chǔ)。

1 分子標(biāo)記育種

分子標(biāo)記是指以核苷酸序列變異為基礎(chǔ)的遺傳標(biāo)記，其能夠直接反映個(gè)體基因組DNA的差異。經(jīng)典的分子標(biāo)記主要包括RFLP（restriction fragment length polymorphism）、CAPS（cleaved amplified polymorphic sequence）、SSR （simple sequence repeat）、STS （sequence-tagged sites）、RAPD（random amplified polymorphic DNA）、AFLP（amplified fragments length polymorphism）、SNP（single nucleotide polymorphisms）和 InDel（insert and deletion）等［4］。近年來，單倍型也發(fā)展成為一種新型的分子標(biāo)記，單倍型為來自同一基因區(qū)段或單個(gè)染色體上多個(gè)標(biāo)記的組合或是來自不同染色體上控制同一目標(biāo)性狀的標(biāo)記組合［5］。Huang等［6］利用517份水稻品種大約360萬SNPs數(shù)據(jù)，構(gòu)建了單倍型圖譜。

利用分子標(biāo)記育種技術(shù)，水稻的產(chǎn)量、品質(zhì)及生物和非生物脅迫抗性等方面得到了改良。國家雜交水稻工程技術(shù)研究中心以馬來西亞普通野生稻為供體親本、以93-11為受體親本進(jìn)行雜交和回交，通過分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)育成了攜帶野生稻增產(chǎn)QTLyld1.1和yld2.1的新品系R163；然后利用R163與光溫敏不育系Y58S育成優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、廣適雜交稻新組合Y兩優(yōu)7號(hào)［7］。品質(zhì)方面，周屹峰等［8］以優(yōu)質(zhì)保持系宜香1B和協(xié)青早B為親本，以特異性分子標(biāo)記對(duì)直鏈淀粉含量進(jìn)行間接篩選，選育出不育系浙農(nóng)3A，其稻米品質(zhì)得到了極大的改良；王巖等［9］基于控制稻米糊化溫度的alk基因和控制香味的fgr基因編碼區(qū)，開發(fā)InDel標(biāo)記用于輔助選擇育種，經(jīng)回交聚合將alk和fgr片段導(dǎo)入明恢63，使稻米的外觀品質(zhì)和蒸煮食味品質(zhì)得到了顯著改善；劉巧泉等［10］通過向特青中導(dǎo)入Wx基因，選育出仍保持原有親本主要農(nóng)藝性狀的3個(gè)優(yōu)質(zhì)品系，改良品系的直鏈淀粉含量顯著降低，蒸煮食味品質(zhì)顯著提高?？共∠x方面，Liu等［11］利用與Pi1連鎖的分子標(biāo)記對(duì)珍汕97B進(jìn)行稻瘟病抗性改良，共得到17個(gè)含有抗性基因Pi1的改良珍汕97B株系；楊子賢等［12］利用分子標(biāo)記輔助選擇將Xa21基因和Bt基因同時(shí)導(dǎo)入93-11，使93-11對(duì)白葉枯病和螟蟲的抗性明顯提高；陳學(xué)偉等［13］利用分子標(biāo)記選擇將抗病基因Pi-d（t）1、Pi-b和Pi-ta2聚合到優(yōu)良保持系材料岡46B中，大大提高了水稻抗病育種的效率；倪大虎等［14］通過分子標(biāo)記輔助選擇和抗性鑒定，將抗白葉枯病基因Xa21和稻瘟病抗性基因Pi9（t）聚合到同一品系，獲得同時(shí)抗稻瘟病和白葉枯病的穩(wěn)定純合株系；官華忠等［15］通過分子標(biāo)記輔助選擇將抗稻瘟病基因Pi-9導(dǎo)入金山B-1，選育出5個(gè)稻瘟病抗性顯著高于金山B-1的近等基因系；董巍等［16］將稻瘟病抗性基因Pi-1、Pi-2從供體中回交聚合到培矮64S中，改良株系對(duì)稻瘟病抗性明顯增強(qiáng)；陳英之等［17］將來源于普通野生稻的5個(gè)抗稻飛虱（brown plant-hopper，BPH）基因通過雜交、回交和分子標(biāo)記輔助選擇導(dǎo)入雜交水稻親本中，其苗期和成株期都表現(xiàn)出對(duì)BPH的高抗性。通過分子標(biāo)記選擇育種，廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院選育出了一批優(yōu)良的不育系和恢復(fù)系品種，如吉豐A、廣泰A、廣恢508、廣恢501等［18］。

分子標(biāo)記育種對(duì)水稻產(chǎn)量、品質(zhì)和抗性育種具有重要意義，而QTL（quantitive trait locus）的精確定位是分子標(biāo)記育種的基礎(chǔ)。目前，精細(xì)定位并成功用于實(shí)際育種中的QTL大部分是主效QTL，許多微效QTL則較少被利用。此外，標(biāo)記性狀多集中于質(zhì)量性狀，數(shù)量性狀發(fā)展相對(duì)滯后。大量遺傳信息處于零散狀態(tài)以及育種群體較難達(dá)到精細(xì)定位作圖群體標(biāo)準(zhǔn)等問題制約著分子標(biāo)記育種的發(fā)展。未來，隨著生物技術(shù)的不斷進(jìn)步，分子標(biāo)記育種與基因編輯和轉(zhuǎn)基因技術(shù)相結(jié)合，將更加精準(zhǔn)、高效地促進(jìn)水稻的育種進(jìn)程。

2 轉(zhuǎn)基因育種

轉(zhuǎn)基因育種技術(shù)是利用植物基因工程技術(shù)將作物高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)和抗逆等相關(guān)基因?qū)胧荏w作物中以培育出具有特定優(yōu)良性狀的新品種。由于優(yōu)異基因可來源于任意物種，因此，轉(zhuǎn)基因育種可以打破種間隔離，解決物種間遠(yuǎn)緣雜交不親和問題［19］。我國的轉(zhuǎn)基因育種始于20世紀(jì)80年代，“863”計(jì)劃項(xiàng)目實(shí)施之后，轉(zhuǎn)基因育種研究發(fā)展迅猛。目前，水稻轉(zhuǎn)基因育種使用的轉(zhuǎn)基因方法主要包括：農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、基因槍法、PEG介導(dǎo)法、電擊導(dǎo)入法和花粉管通道法，其中農(nóng)桿菌介導(dǎo)法占主要地位。

目前，水稻應(yīng)用轉(zhuǎn)基因育種改良的性狀主要集中于抗蟲、抗病、品質(zhì)改良等。應(yīng)用于水稻抗蟲性改良的外源基因主要有蘇云金桿殺蟲結(jié)晶蛋白基因（Bt）、昆蟲蛋白酶抑制劑（基因PI）和植物凝集素基因、營養(yǎng)殺蟲蛋白基因、淀粉酶抑制劑基因、昆蟲毒素基因、幾丁質(zhì)酶基因等［20］。其中，Bt基因是目前應(yīng)用最為廣泛和成功的抗蟲基因。1995年，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)開始研發(fā)無標(biāo)記抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻，利用基因槍法將人工合成的Bt殺蟲基因（cry1Ab/cry1Ac）轉(zhuǎn)入明恢63，培育出抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻華恢1號(hào)；繼而以華恢1號(hào)為父本、珍汕97A為母本選育出雜交種Bt汕優(yōu)63，華恢1號(hào)和Bt汕優(yōu)63均表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗蟲性。應(yīng)用于水稻抗病性改良的基因主要包括抗病毒基因、抗真菌病毒基因和抗細(xì)菌病毒基因3類。幾丁質(zhì)酶是目前研究和應(yīng)用最為廣泛的一種病程相關(guān)蛋白，過量表達(dá)病程相關(guān)蛋白是抗真菌病害常用的策略。馮道榮等［21］將水稻堿性幾丁質(zhì)酶基因RC24、RCH10和酸性幾丁質(zhì)酶基因RAC22、β-1轉(zhuǎn)入秈稻品種七絲軟占，獲得抗稻瘟病和紋枯病的轉(zhuǎn)基因株系。白葉枯病是影響水稻產(chǎn)量最嚴(yán)重的細(xì)菌性病害之一，國家水稻數(shù)據(jù)中心統(tǒng)計(jì)，截止到2021年5月已經(jīng)鑒定了134個(gè)抗白葉枯病基因。翟文學(xué)等［22］利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將Xa21基因轉(zhuǎn)入5個(gè)水稻主栽品種，獲得了具有白葉枯病抗性的水稻株系。

我國轉(zhuǎn)基因水稻育種雖取得一定進(jìn)展，但多數(shù)仍處于實(shí)驗(yàn)室研究階段，離生產(chǎn)實(shí)踐還有很大距離。將轉(zhuǎn)基因技術(shù)應(yīng)用于作物育種，仍需與常規(guī)育種相結(jié)合。隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展，多基因聚合是轉(zhuǎn)基因育種發(fā)展的必然趨勢(shì)。雖然轉(zhuǎn)基因育種已經(jīng)在棉花和大豆等作物上實(shí)現(xiàn)商品化，但人們對(duì)轉(zhuǎn)基因作物的安全性依然存在較多顧慮，阻礙了轉(zhuǎn)基因水稻商品化的發(fā)展［23-24］。因此，需要建立科學(xué)、合理、公正的安全性評(píng)價(jià)體系，對(duì)轉(zhuǎn)基因水稻進(jìn)行正確的安全性評(píng)價(jià)，消除人們對(duì)轉(zhuǎn)基因作物安全性的憂慮，推動(dòng)作物轉(zhuǎn)基因育種的發(fā)展。

3 基因編輯育種

基因編輯技術(shù)是利用工程核酸酶誘導(dǎo)基因組產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂，激活細(xì)胞內(nèi)源修復(fù)機(jī)制，實(shí)現(xiàn)對(duì)基因組的精確修飾，如插入、缺失或替換等［25］。基因編輯系統(tǒng)主要有鋅指核酸酶（zinc finger nuclease，ZFN）系統(tǒng)、類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶（transcriptional activator-like effector nuclease，TALENs）系統(tǒng)和規(guī)律成簇的間隔短回文重復(fù)序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）系統(tǒng)［26］，3種編輯系統(tǒng)的比較詳見表1。與前兩種編輯系統(tǒng)相比，CRISPR/Cas9系統(tǒng)具有操作簡(jiǎn)單、效率高和成本低等優(yōu)點(diǎn)［27］。

表1 三種基因編輯系統(tǒng)的比較Table 1 Comparison of three gene-editing techniques

目前已有不少關(guān)于CRISPR/Cas9系統(tǒng)在水稻育種應(yīng)用中的研究［28-29］。目前，水稻利用基因編輯育種主要應(yīng)用于抗逆性、品質(zhì)、產(chǎn)量以及抽穗期等方面（表2）?？剐苑矫妫禊i等［30］利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)Pita、Pi21和ERF922基因同時(shí)進(jìn)行編輯，對(duì)獲得的三突變純合株系表型鑒定發(fā)現(xiàn)，突變株系較野生型稻瘟病抗性顯著提高；Li等［31］利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)稻瘟病廣譜抗性基因bsr-d1進(jìn)行編輯以抑制該基因的表達(dá)，突變體植株稻瘟病抗性得到顯著提高；Sun等［35］將ALS基因進(jìn)行基因編輯得到具有除草劑抗性的突變體植株。品質(zhì)方面，Li等［36］和范美英等［37］利用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)對(duì)Wx基因進(jìn)行編輯，突變體籽粒直鏈淀粉含量發(fā)生變化，但對(duì)產(chǎn)量無顯著影響；邵高能等［38］利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)中花11的香味基因Badh2進(jìn)行編輯，突變體籽粒中香味物質(zhì)含量顯著增加，且不影響稻米的蒸煮食味品質(zhì)；祁永斌等［39］對(duì)水稻品種嘉58和秀水134的香味基因Badh2進(jìn)行編輯，突變體籽粒中2-AP含量極顯著地高于野生型，其香味性狀得到明顯改良。高產(chǎn)方面，Shen等［41］利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)5個(gè)粳稻品種的GS3和GN1a基因同時(shí)進(jìn)行編輯，發(fā)現(xiàn)5個(gè)背景下gs3和gs3gn1a純合突變體的籽粒長(zhǎng)度均顯著增加，且gs3gn1a比gs3純合突變體具有更多的穗粒數(shù)；Li等［42］對(duì)穗粒數(shù)基因GN1a、穗型基因DEP1、粒型基因GS3和株型基因IPA1進(jìn)行編輯，發(fā)現(xiàn)T2代gn1a、dep1、gs3突變體分別出現(xiàn)穗粒數(shù)增多、直密穗和大粒的表型，在dep1和gs3突變體中還觀察到半矮桿和長(zhǎng)芒表型，而ipa1突變體表現(xiàn)出分蘗增多和分蘗減少兩種表型。抽穗期方面，Li等［51］設(shè)計(jì)雙元載體pYLCRISPR/Cas9Pubi-H，對(duì)7個(gè)水稻品種中抽穗期調(diào)控基因Hd2、Hd4和Hd5進(jìn)行編輯，發(fā)現(xiàn)3個(gè)基因同時(shí)突變的純合株系抽穗期與野生型相比均有不同程度的提前；進(jìn)一步研究表明，Hd2、Hd4、Hd5、Dth2和Hd18為主要的開花促進(jìn)因子［45］。

表2 水稻利用基因編輯育種涉及的部分基因Table 2 Related genes in rice breeding using gene editing

目前，CRISPR/Cas9已發(fā)展為主流的基因編輯系統(tǒng)?；蚓庉嬍峭ㄟ^定向敲除目標(biāo)靶基因，造成基因功能缺失從而實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)性狀的改良。作物育種過程中，育種家往往通過聚合一些優(yōu)良基因或者定點(diǎn)替換某些基因使得產(chǎn)量、品質(zhì)和抗性等得到提高，高效精準(zhǔn)的基因編輯系統(tǒng)極大地促進(jìn)了基因編輯育種在作物改良中的應(yīng)用，對(duì)未來水稻育種具有重要意義［52］。

4 分子設(shè)計(jì)育種

隨著分子生物學(xué)和測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，大量目標(biāo)性狀基因被克?。?3］、基因間互作網(wǎng)絡(luò)被解析，使得分子設(shè)計(jì)育種成為可能。科學(xué)家可以在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)提前模擬、篩選和優(yōu)化品種選育過程，實(shí)現(xiàn)從傳統(tǒng)“經(jīng)驗(yàn)”育種到設(shè)計(jì)“精準(zhǔn)”育種的轉(zhuǎn)變，極大地提高育種效率［54］。萬建民［54］和Wang等［55］提出分子設(shè)計(jì)育種，主要包括以下流程：①明確調(diào)控育種目標(biāo)性狀的基因或QTL；②根據(jù)基因的位置、遺傳效應(yīng)、基因間以及基因與環(huán)境間的互作等信息，模擬和預(yù)測(cè)可能出現(xiàn)的各種基因型組合形成的表現(xiàn)型，從中選擇符合預(yù)期表現(xiàn)型的基因型組合；③對(duì)選出的目標(biāo)基因型組合進(jìn)行育種途徑分析，制定合適的育種方案；④根據(jù)育種方案進(jìn)行實(shí)踐育種。綜上所述，分子設(shè)計(jì)育種是將分子標(biāo)記育種、轉(zhuǎn)基因育種和傳統(tǒng)育種相結(jié)合的一種新型育種模式［56-58］。Tian等［59］對(duì)水稻食味及蒸煮品質(zhì)相關(guān)基因及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行了研究，之后李家洋院士團(tuán)隊(duì)又經(jīng)過8年努力將控制產(chǎn)量、品質(zhì)、外觀等多個(gè)優(yōu)異基因聚合，成功培育出比LYP9高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)的水稻品種，該品種的成功培育對(duì)分子設(shè)計(jì)育種具有重要的指導(dǎo)意義［60］。

5 展望

近年來，在可利用耕地面積逐年減少和嚴(yán)峻的環(huán)境條件下，確保不斷增長(zhǎng)人口的糧食安全仍將是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)。為了迎接這個(gè)挑戰(zhàn)，水稻育種需要對(duì)大量基因資源進(jìn)行集中整合，結(jié)合作物高通量表型和生物技術(shù)方法（如分子標(biāo)記輔助選擇、基因組選擇和基因編輯）等對(duì)水稻生長(zhǎng)進(jìn)行剖析。針對(duì)新時(shí)期水稻產(chǎn)業(yè)發(fā)展戰(zhàn)略需求，強(qiáng)化水稻育種的基礎(chǔ)研究，綜合全基因組選擇、基因編輯、誘變育種、雜交育種等育種技術(shù)，以基因敲除、單堿基編輯等基因編輯手段，創(chuàng)新和優(yōu)化水稻基因編輯技術(shù)；完善多性狀基因聚合的轉(zhuǎn)基因技術(shù)；通過生物技術(shù)、基因組測(cè)序技術(shù)等，以全基因組選擇為主線，完善水稻分子設(shè)計(jì)育種技術(shù)，推動(dòng)水稻育種逐漸向高效、精準(zhǔn)、定向的方向轉(zhuǎn)變，加速水稻超級(jí)新品種的培育進(jìn)程。