王琴琴， 陳修貴， 陸許可， 王帥， 張悅新，范亞朋， 陳全家， 葉武威*

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，教育部棉花工程研究中心，烏魯木齊 830052；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所，棉花生物學(xué)國家重點實驗室，河南 安陽 455000）

土壤鹽漬化和重金屬毒性已成為作物可持續(xù)生產(chǎn)的主要威脅［1］。在眾多農(nóng)作物中，棉花是開發(fā)和利用鹽漬化土地的理想作物之一［2］，也是適合種植在工業(yè)污染地區(qū)的作物之一［3］，但是棉花中與重金屬脅迫相關(guān)基因的研究較少。

Fe、Cu、Zn、Co、Mn、Mo、Ni是植物生長所必需的微量元素，過量則具有毒性；而一些重金屬元素，如Ag+、Cd2+、Pb2+、Hg2+等，即使在低劑量下也具有高度毒性［4-5］。重金屬不僅對植物生長具有顯著影響，而且對土壤微生物群落的結(jié)構(gòu)和功能也具有顯著影響［6］。重金屬相關(guān)結(jié)構(gòu)域（heavy metal-associated domain，HMAD）在植物重金屬響應(yīng)中起著重要作用。植物和微生物對重金屬脅迫響應(yīng)的信號網(wǎng)絡(luò)主要包括鈣信號通路、激素信號網(wǎng)絡(luò)、絲裂原活化蛋白激酶信號（mitogenactivated protein kinase，MAPK）和過氧化物信號網(wǎng)絡(luò)，其中以離子解毒和轉(zhuǎn)運為主［7-8］。金屬螯合物在離子解毒和轉(zhuǎn)運過程中起重要作用［7-8］，其主要包括植物螯合素（phytochelatin synthase，PCs）和金屬硫蛋白（metallothioneins，MTs），MTs通過清除活性氧和螯合作用保護植物免受重金屬的侵害，甚至對冷、熱、鹽、干旱等非生物脅迫抗性也具有重要作用［9-10］。與金屬螯合物相比，重金屬離子轉(zhuǎn)運家族包括p型ATP酶和陽離子轉(zhuǎn)運載體，例如，重金屬腺苷三磷酸酶（heavy metal association，HMA）、ABC膜轉(zhuǎn)運蛋白、自然抗性相關(guān)巨噬細胞蛋 白（naturalresistance-associated macrophage protein，NRAMP）、陽離子擴散促進子家族蛋白（cation diffusion facilitator family，CDF）、黃色條紋轉(zhuǎn)運蛋白（yellow stripe-like YSL transporter）、鋅鐵調(diào)控蛋白（ZRT，IRT-like protein，ZIP）、陽離子交換劑（cation-exchanger，CAX）、銅轉(zhuǎn)運蛋白（copper transporter，CTR）、多向耐藥性蛋白（pleiotropic drug resistance，PDR）、金 屬 響 應(yīng) 轉(zhuǎn) 錄 因 子（metallic responsive transcription factors，MTF-1）［11-12］。對于重金屬腺苷三磷酸酶超富集因子，液泡區(qū)隔化和重金屬離子長距離易位依賴于p型離子泵（ATPases）和一組液泡質(zhì)體轉(zhuǎn)運蛋白在重金屬穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用［13］。

Li等［14］從 野 生 番 茄（Solanum pennellii，LA0716）中分離到一個富含脯氨酸、賴氨酸和谷氨酸的基因SpPKE1，研究表明，PKE1具有脯氨酸、賴氨酸和谷氨酸的某些特征，而富含脯氨酸和富含賴氨酸的蛋白在非生物脅迫中發(fā)揮重要作用［15-16］，由此推測PKE1可能參與植物的非生物脅迫響應(yīng)［14］。因此，本研究從陸地棉中9835克隆了GhPKE1，對其展開生物信息學(xué)分析，并進一步構(gòu)建pYL156：GhPKE1沉默載體，對其在棉花中的功能進行驗證，為進一步研究棉花的抗逆機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 種質(zhì)材料 以陸地棉中9835為供試材料，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所抗逆鑒定實驗室提供。

1.1.2 菌種和質(zhì)粒 大腸桿菌（E.coli）DH5α和農(nóng)桿菌（LB4404、GV3101）均購于上海唯地生物技術(shù)有限公司，pYL156、pYL192（輔助載體）和陽性對照PDS（phytoene desaturase）、pBI121載體等均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所抗逆鑒定實驗室提供。

1.1.3 主要試劑和引物 棉花總RNA提取試劑盒購于北京天根生化科技有限公司；用于基因克隆和定量分析的反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒購于北京全式金生物技術(shù)有限公司；基因克隆高保真酶、基因克隆試劑盒、普通PCR酶均購自諾維贊生物公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒購于上海創(chuàng)賽科技有限公司；限制性內(nèi)切酶購于NEB有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；所用CaCl2、亞精胺、MS鹽、培養(yǎng)基、卡那霉素、利福平等實驗用品均購于北京Solarbio有限公司；其他常規(guī)試劑都為國產(chǎn)分析純。引物合成和基因測序均由上海生工生物工程有限公司完成。

1.1.4 儀器設(shè)備 試驗儀器主要包括人工培養(yǎng)箱、PCR儀、電泳儀、全自動凝膠成像系統(tǒng)、Nanodrop2000、水浴鍋、純水/超純水儀、制冰機、白光紫外照膠儀、超凈工作臺、紫外分光光度儀、恒溫搖床、?20/?80℃低溫冰箱、常溫離心機、冷凍離心機、Bio-Rad CFX96實時熒光定量PCR儀、高壓滅菌鍋、烘箱、移液槍等。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗材料處理方法 將中9835種子進行濃硫酸脫絨后。挑選顆粒飽滿的種子，依次用20%～30%雙氧水浸泡3 h消毒滅菌，再用蒸餾水反復(fù)清洗6次（每次1 min），最后用無菌水浸種催芽12 h。將露白的種子播種于滅過菌的沙土，在人工培養(yǎng)箱培育至三葉期移到300 mmol·L?1Na2SO4溶液中脅迫處理12 h，分別取棉花的根、莖和葉組織各3份，同時取其第2片真葉放入液氮中速凍，置于?80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 試驗菌液準(zhǔn)備 分別將試驗用到的4種菌液（pYL156：GhPKE1、pYL156、pYL192和PDS）活化12h，進行擴搖，培養(yǎng)基為高溫滅菌的液體LB培養(yǎng)基（50℃，加卡那霉素和利福平），搖床中培養(yǎng)（28℃，黑暗培養(yǎng)），培養(yǎng)時長為16h左右，OD值（600 nm）達到1.5左右，5 580 r·min?1離心20 min，收集菌體。加入等體積已配制好的無菌重懸液（MES 10 mmol·L?1，AS 200 μmol·L?1，MgCl210 mmol·L?1，pH 5.6）震蕩，重懸菌體，保證沒有菌塊存在，將菌液室溫避光靜置4 h，準(zhǔn)備侵染。

1.2.3 qRT-PCR 實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）采用TransStart Top Green qPCR SuperMix熒光定量試劑盒。每個反應(yīng)包含100 ng cDNA，上下游引物各0.4μL，SuperMix 10μL，加水至20μL。擴增程序：95℃ 5 min；95℃ 15 s，58℃20 s，72℃30 s，40個循環(huán)。3個生物學(xué)重復(fù)，3個技術(shù)重復(fù)，內(nèi)參基因為GhHistone3。

1.2.4GhPKE1的克隆 用Premier 5軟件設(shè)計GhPKE1引物（表1），以cDNA為模板進行擴增，PCR擴增程序：95℃ 3 min；95℃ 15 s，56℃ 15 s，72℃ 50 s，35個循環(huán)；72℃ 5 min；4℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后回收和純化。采用一步克隆法將連接載體進行線性化處理后與PCR純化產(chǎn)物混合，將純化后的PCR產(chǎn)物連接至pBI121載體。然后將一步克隆產(chǎn)物轉(zhuǎn)入E.coliDH5α，試驗步驟參照試劑盒使用說明書。最后進行藍白斑篩選挑取陽性克隆進行測序，獲取正確的克隆載體GhPKE1-t，置于?20℃保存。

表1 GhPKE1的引物序列Table 1 Primer sequence of GhPKE1

1.2.5 構(gòu)建pYL156：GhPKE1的VIGS載體 選擇KpnⅠ和BamHⅠ作為pYL156的酶切位點，獲得線性pYL156載體，雙酶切線性化載體反應(yīng)體系總體積 30 μL：10×Tango Buffer 5 μL、載體質(zhì)粒pYL156 10μL、KpnⅠ 1μL、BamHⅠ 1μL、ddH2O 13μL。37℃水浴過夜。采用一步克隆法，將線性化處理后的載體與PCR純化產(chǎn)物混合構(gòu)建pYL156：GhPKE1載體，一步克隆反應(yīng)體系總體積10μL，包含雙酶切線性化載體pYL156 3 μL、5×CE Ⅱ Buffer 2μL、PCR純化產(chǎn)物 4μL、ExnaseⅡ1μL。37℃水浴30 min。然后將一步克隆產(chǎn)物轉(zhuǎn)入E.coliDH5α，轉(zhuǎn)化步驟按照 pEASY-Blunt Clonging Kit使用說明書。最后進行藍白斑篩選挑取陽性克隆，于LB液體培養(yǎng)基（含50 mg·L?1卡那 霉 素）200 r·min?1、37 ℃ 培 養(yǎng) 6 h，再 用V-GhPKE1上下游引物進行PCR擴增驗證后，將陽性菌液送至生工生物工程股份有限公司進行測序。對測序結(jié)果正確的菌液用TianGen的HiPure BAC DNA小量提取試劑盒提取質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌。

1.3 VIGS侵染棉花及目的基因表達量檢測

采用1.2.1的方法育苗，待中9835植株兩片子葉平展時，用一次性的醫(yī)用5 mL注射器吸取事先準(zhǔn)備好的菌液，在葉片背面進行注射，當(dāng)菌液面積達葉片總面積85%時停止注射。然后將植株置于25℃黑暗培養(yǎng)24 h后，在適宜的溫度（光照26℃16 h；黑暗24℃8 h）下繼續(xù)培養(yǎng)以保證幼苗正常生長。當(dāng)注射了PDS（PDS轉(zhuǎn)化植株葉片變白，說明試驗系統(tǒng)構(gòu)建成功）的植株葉片出現(xiàn)白化后，再對VIGS侵染植株和未侵染植株分別進行Na2SO4和CdCl2脅迫處理，當(dāng)VIGS侵染的植株出現(xiàn)變化時，采用1.2.1的取樣方法進行取樣，通過qRT-PCR測定GhPKE1的相對表達量。

2 結(jié)果與分析

2.1 GhPKE1蛋白的理化性質(zhì)

GhPKE1基因全長1 048 bp，編碼區(qū)753 bp，該基因存在2個內(nèi)含子。通過ExPASY網(wǎng)站（https://web.expasy.org/protparam/）的 ProtParam 程序?qū)hPKE1編碼的蛋白進行分析，該基因編碼蛋白質(zhì)分子式為C1224H1939N321O369S15，共計3 868個原子，相對分子質(zhì)量27.54 kD，等電點9.3；編碼250個氨基酸，其中50個帶正電的氨基酸（Arg+Lys），37個帶負電的氨基酸（Asp+Glu），不穩(wěn)定系數(shù)為35.56，脂肪系數(shù)為41.84，總平均親水性為?1.114；預(yù)測該蛋白為堿性蛋白，不含有吡咯賴氨酸、硒半胱氨酸和組氨酸，色氨酸含量最低，為0.4%，賴氨酸含量最高，為18.0%，其次是脯氨酸12.8%和谷氨酸11.6%。

2.2 GhPKE1蛋白質(zhì)的親水性//疏水性

利用ProtScale網(wǎng)站（https://web.expasy.org/protscale/）對GhPKE1蛋白的親疏水性進行預(yù)測，結(jié)果（圖1）表明，親水性總平均值為?1.60，其中85位的K，88位和151位的D，98位、108位、119位、129位、139位的E，親水性最強，分值均為?3.256；48位的T疏水性最強，分值為2.222。整體來看，該蛋白中親水性氨基酸多于疏水性氨基酸，因此該蛋白為親水性蛋白，具有一定的親水能力。

圖1 GhPKE1蛋白的疏水性/親水性Fig.1 Hydrophilicity/hydrophilicity analysis of GhPKE1protein

2.3 GhPKE1蛋白的亞細胞定位與跨膜分析

通 過 WOLF PSORT 網(wǎng)站（https：//wolfpsort.hgc.jp/）對GhPKE1蛋白亞細胞定位進行預(yù)測，該蛋白在植物細胞細胞核的可能性最大。通過TMHMM網(wǎng) 站（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）對GhPKE1蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域進行分析（圖2A）表明，該蛋白不存在跨膜結(jié)構(gòu)域，屬于非跨膜蛋白，與其疏水性區(qū)域分析結(jié)果相一致。利用SignalP-4.0網(wǎng)站對GhPKE1蛋白的信號肽進行預(yù)測（圖2B），結(jié)果表明，C值（剪切位點）為0.118，S值（信號肽）為0.171，Y值（綜合剪切點）為0.131。綜上所述，GhPKE1蛋白不是分泌型蛋白，不能在細胞中發(fā)生遷移。

圖2 GhPKE1蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域分析和信號肽預(yù)測Fig.2 Prediction of transmembrane domain and signal peptide in GhPKE1 protein

2.4 GhPKE1蛋白的二級結(jié)構(gòu)分析

通過SOPMA網(wǎng)站（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？ page=npsa_sopma.html）對GhPKE1蛋白的二級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測，結(jié)果（圖3A）表明，無規(guī)則卷曲包含135個氨基酸，占54.00%；α螺旋包含48個氨基酸，占19.20%；β-轉(zhuǎn)角包含19個氨基酸，占7.60%；延伸鏈包含48個氨基酸，占19.20%。通過GlobPlot 2.3網(wǎng)站（http：//globplot.embl.de/）對 GhPKE1蛋白序列中的紊亂區(qū)、球蛋白區(qū)進行預(yù)測，結(jié)果（圖3B）顯示，該蛋白存在3個不穩(wěn)定區(qū)，分別位于78～95、123～139和184～247氨基酸位置，在1～77位處形成一個較大的潛在球形蛋白區(qū)。以上結(jié)果與在PSIPRED 網(wǎng)站（http：//bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/）預(yù)測的GhPKE1蛋白二級結(jié)構(gòu)（圖3C）相一致。

圖3 GhPKE1生物信息學(xué)分析Fig.3 GhPKE1 bioinformatics analysis

2.5 GhPKE1蛋白的互作網(wǎng)絡(luò)分析

通 過 InterPro（http：//www.ebi.ac.uk/interpro/）網(wǎng) 站 和 STRING 網(wǎng) 站（https：//string-db.org）對PKE1蛋白互作網(wǎng)絡(luò)預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)（圖3D），含有HMAD功能結(jié)構(gòu)域的GhPKE1蛋白（IPR006121）與擬南芥中AT4G16380相似度高達69.8%，與10個蛋白之間存在互作。

2.6 GhPKE1蛋白的作用位點分析

通過NetPhos3.1 Server網(wǎng)站（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）對 GhPKE1 蛋白進行磷酸化位點分析（圖4A），發(fā)現(xiàn)有15個位點磷酸化；結(jié)合 PROSITE（https：//prosite.expasy.org/）分析表明，GhPKE1中LYS_RICH結(jié)構(gòu)域（18～154 aa）中含有1個磷酸化位點。對所預(yù)測的15個磷酸化位點進一步地分析鑒定（圖4B），推測GhPKE1蛋白有4個重要位點，分別是56～63位的酪氨酸激酶磷酸化位點（tyrosine kinase phosphorylation site）、68～70位的蛋白激酶C磷酸化位點（protein kinase C phosphorylation site）、183～186位的酪蛋白激酶2磷酸化位點（Casein kinaseⅡphosphorylation site）和C端247～250位的 Prenyl group結(jié)合位點（CAAX box）。

2.7 VIGS侵染后棉花的表型和GhPKE1的表達量分析

根據(jù)生物信息學(xué)分析結(jié)果，針對GhPKE1的N端設(shè)計VIGS引物，以沒有進行VIGS侵染的棉苗作為對照（CK），當(dāng)侵染了PDS植株在三葉期葉片出現(xiàn)白化后，再對 CK、pYL156和 pYL156：GhPKE1侵染的植株分別進行Na2SO4和CdCl2脅迫處理。用 300 mmol·L?1的 Na2SO4處理 12 h 后（圖5A），pYL156：GhPKE1侵染植株莖稈彎曲、真葉明顯萎蔫，而CK和pYL156侵染植株僅真葉輕微萎蔫。用 20 mmol·L?1的 CdCl2溶液處理 VIGS植株12 h后（圖5B），與CK和pYL156侵染植株相比，pYL156：GhPKE1侵染植株的真葉變?yōu)楹稚覈乐匚?，子葉枯萎凋落，莖部變?yōu)楹稚?。檢測VIGS侵染植株中GhPKE1的相對表達量，結(jié)果（圖5C和5D）表明，用pYL156：GhPKE1侵染過的植株中GhPKE1轉(zhuǎn)錄水平與CK組相比，葉片中表達量顯著降低。

圖5 VIGS侵染后的棉花表型及GhPKE1基因相對表達量Fig.5 Cotton phenotype and the relative expression level of GhPKE1 after VIGS infection

3 討論

含有HMAD的基因一方面可以選擇性地吸收和運輸金屬離子［17］，另一方面與逆境脅迫存在交叉作用［18］。首先，液泡不僅作為Na+區(qū)隔化［19］，也可以作為重金屬區(qū)隔化，其中重金屬腺苷三磷酸酶起到重要作用［18，20］。重金屬腺苷三磷酸酶屬于1b型離子泵，也稱為CPx離子泵，負責(zé)離子解毒/轉(zhuǎn)運［21-22］和液泡區(qū)隔［23］。在雙突變體中，重金屬腺苷三磷酸酶不僅影響重金屬的轉(zhuǎn)運［24］，還影響植物的生長發(fā)育［25］。鹽脅迫與重金屬毒性在一定程度上存在重疊，多種綜合的因素和化學(xué)信號參與了脅迫相關(guān)反應(yīng)［26］。通過序列相似性搜索，本研究發(fā)現(xiàn)棉花中含有HMAD功能結(jié)構(gòu)域的基因GhPKE1，其富含賴氨酸（18.0%）、脯氨酸（12.8%）和谷氨酸（11.6%），該基因的編碼蛋白穩(wěn)定且具有一定的親水能力。GhPKE1蛋白不是分泌型蛋白，不具有跨膜結(jié)構(gòu)域，在細胞中不發(fā)生遷移，二級結(jié)構(gòu)以無規(guī)則卷曲和α螺旋為主。定位于細胞核的GhPKE1蛋白有4個重要的磷酸化位點，與其他蛋白間存在互作，這些生物信息學(xué)分析為GhPKE1蛋白的VIGS片段選擇和未來的分子機制研究奠定了基礎(chǔ)。

有研究顯示，番茄中MYB或MYC轉(zhuǎn)錄因子可以直接調(diào)控PKE1，從而抵抗非生物脅迫［14］。PKE1在葉片中存在高甲基化，但在生殖器官中不存在，表明PKE1不僅在幼苗時期發(fā)揮作用，在生殖階段也具有耐鹽性［14］。PKE1可以與F-box蛋白結(jié)合［27］，表明PKE1在轉(zhuǎn)錄后水平對耐鹽基因起調(diào)控作用［14］。在番茄中過表達SpPKE1能增強轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性［14］，在煙草中過表達SpPKE1能增強植株的耐旱性［27］。本研究在棉花植株中沉默GhPKE1基因，發(fā)現(xiàn)沉默后植株中GhPKE1轉(zhuǎn)錄水平較CK顯著降低；鹽或重金屬脅迫后，植株更容易枯萎死亡，抗逆性顯著降低。因此，推測GhPKE1基因不僅與耐CdCl2相關(guān)，而且也與耐Na2SO4相關(guān)，它們之間存在交叉作用，但該基因的具體功能還需要進一步研究。