鄒俊杰， 徐妙云， 張?zhí)m， 鄭紅艷， 王磊，2*

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)業(yè)基因組學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（北京），北京 100081；2.三亞中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院國家南繁研究院，海南 三亞 572024）

通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)可以獲得具有抗蟲、耐除草劑、抗病、抗逆性、適應(yīng)性、高產(chǎn)、高營養(yǎng)價(jià)值等新性狀的作物品種［1］。轉(zhuǎn)基因作物的應(yīng)用能夠有效提高農(nóng)業(yè)生產(chǎn)力，降低干旱、洪澇和病蟲害等對(duì)作物生產(chǎn)的不利影響，提高單位面積產(chǎn)量，減少農(nóng)藥化肥的使用及其對(duì)環(huán)境的污染［2］。國際農(nóng)業(yè)生物技術(shù)應(yīng)用服務(wù)組織（International Service for the Acquisition of Agri-biotech Applications，ISAAA）2018年報(bào)告中指出，自1996年轉(zhuǎn)基因作物開始商業(yè)化種植以來，全球轉(zhuǎn)基因作物的種植面積增長(zhǎng)了約113倍，累計(jì)達(dá)到了25億hm2，轉(zhuǎn)基因作物為消費(fèi)者提供了多樣性的選擇，在糧食安全、可持續(xù)發(fā)展及氣候變化等方面作出了貢獻(xiàn)［3］。

轉(zhuǎn)基因作物的研究呈現(xiàn)多基因、多性狀疊加趨勢(shì)，即由轉(zhuǎn)化單一基因向多基因發(fā)展，表現(xiàn)的性狀由單一性狀向復(fù)合性狀發(fā)展［4］。復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因植物能夠同時(shí)表達(dá)2個(gè)或多個(gè)外源基因，聚合多個(gè)優(yōu)良性狀，能夠有效提高資源利用效率，帶來多重收益。國際上已有約120個(gè)復(fù)合轉(zhuǎn)化體批準(zhǔn)商業(yè)應(yīng)用，復(fù)合的性狀以抗蟲抗除草劑、多基因抗蟲復(fù)合為主，涉及的作物主要包括棉花、玉米、大豆和油菜等［5］。聚合抗蟲、耐除草劑、耐干旱脅迫，加上營養(yǎng)改良等性狀的復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品是未來轉(zhuǎn)基因作物育種的重要發(fā)展方向［6］。2018年，具有復(fù)合性狀的轉(zhuǎn)基因作物種植面積占轉(zhuǎn)基因作物總面積的42%［3］。

玉米是我國主要糧食作物之一，玉米螟等蟲害和雜草嚴(yán)重影響玉米的生長(zhǎng)、產(chǎn)量和品質(zhì)。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育具有抗蟲、耐除草劑性狀的玉米是控制害蟲和防除雜草的有效途徑。蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis，Bt）是一種革蘭氏陽性昆蟲病原體，對(duì)哺乳動(dòng)物等非靶標(biāo)生物安全無害，cry、cyt和vip基因編碼的殺蟲蛋白是主要活性物質(zhì)，表達(dá)Bt殺蟲蛋白的轉(zhuǎn)基因植物已被廣泛應(yīng)用于害蟲的防治［7］。草甘膦（glyphosate）可有效地清除雜草，cp4epsps來源于土壤根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）CP4株系，其編碼蛋白CP4EPSPS（5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶）對(duì)草甘膦不敏感，導(dǎo)入cp4epsps能使轉(zhuǎn)化體耐受草甘膦，在耐除草劑轉(zhuǎn)基因育種中被廣泛應(yīng)用［5］。我國自2008年啟動(dòng)轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項(xiàng)以來，已獲得了眾多具有知識(shí)產(chǎn)權(quán)的轉(zhuǎn)基因抗蟲和耐除草劑玉米優(yōu)良轉(zhuǎn)化體，這為培育具有突破性的玉米新品種創(chuàng)造了條件［2］。這些具有抗蟲耐除草劑復(fù)合性狀的轉(zhuǎn)基因玉米材料進(jìn)入到環(huán)境釋放、生產(chǎn)性實(shí)驗(yàn)和安全證書申報(bào)等不同階段。2019年12月，大北農(nóng)DBN9936以及杭州瑞豐生物科技有限公司和浙江大學(xué)申報(bào)的雙抗12-5抗蟲耐除草劑玉米獲得農(nóng)業(yè)農(nóng)村部頒發(fā)的農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全證書，轉(zhuǎn)基因玉米品種審批有望加快推進(jìn)。本課題組前期研究構(gòu)建了cry1Ab、cry1F和cp4epsps基因串聯(lián)表達(dá)載體，并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)入玉米中，經(jīng)過篩選獲得具有抗蟲、耐草甘膦復(fù)合抗性的轉(zhuǎn)基因玉米材料BFL4-1。本研究利用全基因組測(cè)序和側(cè)翼序列測(cè)序?qū)ν庠雌尾迦胛恢眠M(jìn)行了分析，對(duì)cry1Ab、cry1F、cp4epsps基因在BFL4-1轉(zhuǎn)基因材料的分子特征和遺傳穩(wěn)定性進(jìn)行了分析，同時(shí)對(duì)轉(zhuǎn)基因玉米的抗蟲和耐除草劑性能進(jìn)行了評(píng)價(jià)，旨在為培育具有抗蟲和耐除草劑復(fù)合性狀的玉米新品系奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

轉(zhuǎn)基因抗蟲耐除草劑玉米BFL4-1由本課題組創(chuàng)制，BC4F1、BC5F1和 BC6F1為 BFL4-1 不同回交世代材料。非轉(zhuǎn)基因?qū)φ詹牧蠟橛衩鬃越幌掂?8（Zheng 58）由本課題組保存。試驗(yàn)在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所溫室和位于海南省三亞市樂東縣尖峰鎮(zhèn)的中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所試驗(yàn)基地進(jìn)行，轉(zhuǎn)基因材料種植管理嚴(yán)格按照《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全評(píng)價(jià)管理辦法》執(zhí)行，并已備案（農(nóng)基安辦報(bào)告字〔2014〕第595號(hào)）。每個(gè)小區(qū)面積為6 m2（2 m×3 m），行距50 cm，株距20 cm，3次重復(fù)，播種后按正常栽培管理。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 BFL4-1轉(zhuǎn)基因材料的獲得 根據(jù)玉米的密碼子使用頻率對(duì)抗蟲基因cry1Ab、cry1F和抗草甘膦基因cp4epsps的密碼子進(jìn)行了優(yōu)化，將cry1Ab、cry1F和cp4epsps3個(gè)基因表達(dá)框構(gòu)建到植物表達(dá)載體pCAMBIA1300上（圖1）。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)玉米幼胚轉(zhuǎn)化方法［8］將外源基因表達(dá)框（大小約11 kb）導(dǎo)入受體玉米材料Hi?II中，經(jīng)過篩選獲得多個(gè)T1代陽性植株。利用回交轉(zhuǎn)育的方法將外源插入片段導(dǎo)入自交系鄭58中，經(jīng)過6代回交再自交篩選后獲得BFL4多個(gè)獨(dú)立轉(zhuǎn)基因株系，本試驗(yàn)用到的轉(zhuǎn)基因株系為BFL4-1。

圖1 cry1Ab、cry1F和cp4epsps插入表達(dá)框的結(jié)構(gòu)Fig.1 Structure of T-DNA region containing cry1Ab，cry1F and cp4epsps expression cassettes

1.2.2 PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植株 取玉米幼苗期的葉片，利用植物基因組DNA提取試劑盒（DP302-03，全式金公司）提取基因組DNA。用全基因組重測(cè)序方法結(jié)合生物信息學(xué)分析方法［9］確定BFL4-1的插入位置和序列。根據(jù)表達(dá)框序列及外源序列插入玉米基因組的位置，設(shè)計(jì)了cry1Ab、cry1F和cp4epsps特異性擴(kuò)增引物以及BFL4-1外源片段插入基因組特異性檢測(cè)引物，如表1所示。

表1 本研究中引物序列Table 1 Primers used in this study

PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）體系：2×TSINGKE Master Mix 10 μL；正反向引物（10 μmol·L?1）各0.4μL；ddH2O 8.2μL；DNA模板，1μL。PCR擴(kuò)增條件為：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃，10 min。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR） 分別提取BFL4-1拔節(jié)期根、莖和葉片的RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，參照試劑盒SV Total RNA Isolation System（Promegam，USA）和反轉(zhuǎn)錄參照試劑盒A3500-Reverse Transcription System（Promega，USA）說明書進(jìn)行。qRT-PCR反應(yīng)體系按照SYBR PremixExTaqTM（Code DRR041A，TaKaRa公司）熒光定量試劑盒進(jìn)行，采用ABI 7500熒光定量PCR儀系統(tǒng)（Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR Systems，美國）進(jìn)行熒光定量PCR。實(shí)時(shí)熒光定量用的引物序列如表1所示，zSSIIb為參照基因，試驗(yàn)結(jié)果為3次數(shù)據(jù)平均值。

1.2.4 外源蛋白免疫試紙條檢測(cè) 采用美國Agdia公司的Cry1Ab/1Ac、Cry1F和CP4EPSPS試紙條檢測(cè)BFL4-1轉(zhuǎn)基因材料中的Cry1Ab、Cry1F和CP4 EPSPS蛋白，具體方法參照試劑盒說明書。

1.2.5 農(nóng)藝性狀調(diào)查 生長(zhǎng)期間調(diào)查出苗期、抽雄期和吐絲期，吐絲后測(cè)量株高和穗位高。果穗收獲后進(jìn)行考種，測(cè)量穗行數(shù)和行粒數(shù)等農(nóng)藝性狀指標(biāo)。種子萌發(fā)率參照梁海生等［10］方法進(jìn)行計(jì)算。

1.2.6 玉米螟田間抗蟲性鑒定 轉(zhuǎn)基因材料及非轉(zhuǎn)基因?qū)φ詹牧仙L(zhǎng)到大喇叭口期，開始接種亞洲玉米螟，將玉米螟初孵幼蟲接于心葉中，每株接蟲20～30頭，定期觀察蟲害發(fā)生情況。抗蟲性標(biāo)準(zhǔn)采用國際玉米螟協(xié)作組制定的9級(jí)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)［11］。亞洲玉米螟初孵幼蟲購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所。

1.2.7 抗草甘膦性能評(píng)價(jià) 在轉(zhuǎn)基因材料及非轉(zhuǎn)基因的野生型對(duì)照材料生長(zhǎng)到4～5片葉時(shí)，噴施41%的草甘膦異丙胺鹽（農(nóng)達(dá)，美國孟山都公司），噴施時(shí)按15 mL·L?1藥量進(jìn)行，約為正常用藥的5倍。噴施1周后，調(diào)查幼苗死亡率。

2 結(jié)果與分析

2.1 BFL4-1轉(zhuǎn)基因材料的遺傳穩(wěn)定性檢測(cè)

將cry1Ab、cp4epsps和cry1F3個(gè)基因串聯(lián)表達(dá)，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法導(dǎo)入玉米中，經(jīng)過與鄭58回交轉(zhuǎn)育，獲得了多個(gè)獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因株系，其中包括BFL4-1和BFL4-2。提取BFL4-1和BFL4-2株系不同世代（BC4F1、BC5F1、BC6F1）陽性植株DNA，采用cry1Ab、cry1F和cp4epsps表達(dá)框片段特異引物進(jìn)行目的基因片段擴(kuò)增，利用BFL4-1外源基因片段特異性PCR對(duì)BFL4-1回交轉(zhuǎn)育后代進(jìn)行了連續(xù)3代的跟蹤檢測(cè)，在不同世代均能檢測(cè)到3個(gè)目的基因的特異片段（圖2）。這些結(jié)果說明，cry1Ab、cry1F和cp4epsps3個(gè)基因均已整合到玉米基因組中，并且能夠穩(wěn)定遺傳。

圖2 在BFL4株系不同世代中cry1Ab、cry1F和cp4epsps片段PCR檢測(cè)Fig.2 PCR detection of cry1Ab，cry1F and cp4eps expression cassettes in different generations of BFL4 line

2.2 BFL4-1外源片段插入位置鑒定

BFL4-1回交后代PCR檢測(cè)的陽性植株與陰性植株比例接近1∶1，與單個(gè)外源片段插入回交株系理論分離比接近，符合孟德爾遺傳規(guī)律，說明BFL4-1中外源基因片段插入在玉米染色體基因組上，且為單拷貝插入。

利用新一代的測(cè)序技術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)基因植株的插入位置、插入拷貝數(shù)、外源基因的完整性和遺傳穩(wěn)定性進(jìn)行分子特征檢測(cè)［9］。對(duì)獲得的BFL4-1進(jìn)行了高通量全基因組測(cè)序和側(cè)翼序列PCR測(cè)序分析，并與玉米基因組序列B73 RefGen_v4（http：//ensembl.gramene.org/Zea_mays/Info/Index）進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)外源插入片段5’端位于第3號(hào)染色體66 921 452 bp附近，外源插入片段位于基因間區(qū)。對(duì)BFL4-1材料5’端側(cè)翼序列進(jìn)行特異性PCR檢測(cè)和測(cè)序，擴(kuò)增片段大小在550 bp左右，與理論片段大小符合，對(duì)PCR擴(kuò)增片段進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果能夠比對(duì)上玉米基因組序列和插入片段序列，說明BFL4-1特異性引物對(duì)可以用于BFL4-1轉(zhuǎn)基因株系的特異性檢測(cè)。

2.3 BFL4-1材料中cry1Ab、cry1F和cp4epsps基因相對(duì)表達(dá)量和蛋白表達(dá)檢測(cè)

cry1Ab、cry1F和cp4epsps3個(gè)基因整合在BFL4-1基因組中且能夠穩(wěn)定遺傳，為了檢測(cè)這3個(gè)基因在不同組織中相對(duì)表達(dá)水平，利用qRT-PCR對(duì)3個(gè)基因在BFL4-1拔節(jié)期不同組織的表達(dá)量進(jìn)行了檢測(cè)。cry1Ab、cry1F和cp4epsps在BFL4-1不同組織中表達(dá)量相對(duì)穩(wěn)定（圖3）。在成熟期利用Cry1Ab、Cry1F和CP4EPSPS蛋白特異的免疫試紙條定性檢測(cè)BFL4-1材料中這3個(gè)蛋白的表達(dá)情況，檢測(cè)結(jié)果顯示在BFL4-1的根、莖、葉和種子中均能檢測(cè)Cry1Ab、Cry1F、CP4EPSPS蛋白（圖3）。這些結(jié)果說明，在BFL4-1材料中，cry1Ab、cry1F和cp4epsps在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上均能夠穩(wěn)定表達(dá)。

圖3 cry1Ab、cry1F和cp4pesps相對(duì)表達(dá)量和免疫試紙條檢測(cè)Fig.3 Relative expression level of cry1Ab，cry1F，cp4pesps and immunostrip tests

2.4 BFL4-1株系田間抗蟲和抗除草劑性能鑒定

cry1Ab、cry1F和cp4epsps在BFL4-1株系中高效地轉(zhuǎn)錄，并且在植物各個(gè)組織部位均有蛋白表達(dá)。為了檢測(cè)BFL4-1是否具有高效抗蟲和耐除草劑的性狀，對(duì)BFL4-1轉(zhuǎn)基因株系的抗蟲和耐除草劑性能進(jìn)行了鑒定。草甘膦噴施一周后，非轉(zhuǎn)基因植株全部死亡，而轉(zhuǎn)基因植株存活率為100%，說明獲得BFL4-1為高耐草甘膦的轉(zhuǎn)基因玉米（圖4A）。在玉米大喇叭口期進(jìn)行田間接蟲鑒定，結(jié)果表明，接蟲后非轉(zhuǎn)基因植株葉片蟲害嚴(yán)重，而BFL4-1具有較好的抗蟲性，根據(jù)國際玉米螟協(xié)作組制定的抗蟲標(biāo)準(zhǔn)分級(jí)對(duì)BFL4-1的抗蟲性進(jìn)行分級(jí)，BFL4-1為高抗玉米螟轉(zhuǎn)基因材料（圖4B）。

圖4 BFL4-1材料田間耐除草劑和抗蟲性能評(píng)價(jià)Fig.4 Evaluation of herbicide tolerance and insect resistance of BFL4-1 plants in the field

2.5 BFL4-1農(nóng)藝性狀與對(duì)照比較

為了研究外源基因片段插入后是否影響玉米農(nóng)藝性狀，對(duì)BFL4-1與鄭58的生育期、株高、穗位高、穗行數(shù)、行粒數(shù)和百粒重等農(nóng)藝性狀進(jìn)行了觀察和比較，結(jié)果表明，在正常種植條件下，轉(zhuǎn)基因BFL4-1植株與對(duì)照鄭58在株高、穗位高、生育期、抽雄期、穗行數(shù)、行粒數(shù)、百粒重以及萌發(fā)率無差別，適應(yīng)性與對(duì)照鄭58相當(dāng)，說明BFL4-1與鄭58在生存競(jìng)爭(zhēng)力方面均無明顯差異（P＞0.05，表2）。這些結(jié)果說明，在正常條件下轉(zhuǎn)基因BFL4-1農(nóng)藝性狀與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ詹牧相?8相比未發(fā)生變化，沒有增加或減少適應(yīng)性的優(yōu)勢(shì)或趨勢(shì)。在田間農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程中，因BFL4-1可以耐受草甘膦除草劑，同時(shí)含有抗蟲基因，在玉米螟蟲害嚴(yán)重時(shí)，其生長(zhǎng)性能要優(yōu)于對(duì)照鄭58。

表2 BFL4-1與對(duì)照鄭58農(nóng)藝性狀比較Table 2 Comparison of agronomic traits between BFL4-1 and Zheng 58

3 討論

來源于蘇云金芽孢桿菌的Bt基因需要進(jìn)行密碼子優(yōu)化才能在玉米中穩(wěn)定表達(dá)，通過提高蛋白表達(dá)量來提高轉(zhuǎn)基因玉米的抗蟲性能。已有研究報(bào)道，根據(jù)玉米密碼子的偏好性對(duì)來自蘇云金芽孢桿菌BT8的cry1Ah進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化后cry1Ah的GC含量提高，并且細(xì)菌基因中16處易引起mRNA不穩(wěn)定的ATTA序列也得到了改造，優(yōu)化后的cry1Ah與Btcry1Ah基因序列相似性為70%左右［12］。cry1Ab在轉(zhuǎn)基因玉米中存在表達(dá)量低、表達(dá)產(chǎn)物不穩(wěn)定和抗蟲效果差等問題，通過對(duì)cry1Ab基因原始核苷酸序列改造，去掉引起mRNA不穩(wěn)定及富含AT的序列，并經(jīng)過密碼子優(yōu)化，能夠獲得新型的抗蟲基因cry1Ab-Ma，并具有很強(qiáng)的殺蟲性［13］。通過對(duì)Btcry1Ah和G2-epsps基因進(jìn)行植物密碼子優(yōu)化改造，能夠提高轉(zhuǎn)基因玉米的抗蟲和耐除草劑性能［11］。本研究獲得的轉(zhuǎn)抗蟲耐除草劑玉米BFL4-1材料中cry1Ab、cry1F和CP4EPSPS均具有較高的表達(dá)，蛋白表達(dá)穩(wěn)定（圖3），田間抗蟲和耐除草劑試驗(yàn)結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因玉米材料BFL4-1為高抗玉米螟和耐除草劑的轉(zhuǎn)基因株系（圖4）。

具有復(fù)合性狀成為轉(zhuǎn)基因作物研發(fā)的趨勢(shì)，2018年，復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因作物的種植面積占全球轉(zhuǎn)基因作物種植面積的42%，越來越受到種植者的歡迎［3］。復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因植物可以通過共轉(zhuǎn)化、再轉(zhuǎn)化和育種復(fù)合3種途徑獲得，復(fù)合的性狀以抗蟲抗除草劑、多基因抗蟲復(fù)合為主［5］。目前，具有復(fù)合性狀的轉(zhuǎn)基因玉米主要通過親本雜交聚合法、多基因單載體共轉(zhuǎn)化聚合法和多基因多載體共轉(zhuǎn)化聚合法等來獲得［14］。國內(nèi)通過這些方法也獲得了具有復(fù)合性狀的轉(zhuǎn)基因玉米，包括一些抗蟲耐除草劑玉米品系［15］等。有些轉(zhuǎn)基因玉米除了抗蟲耐除草劑外，還兼具有耐旱性能［16］。通過將cry1Ab、cry1F和cp4epsps串聯(lián)表達(dá)并轉(zhuǎn)入玉米中，整合在染色體上并能夠穩(wěn)定表達(dá)，一方面縮短了轉(zhuǎn)基因復(fù)合育種的過程；另一方面多基因抗蟲，能夠延緩靶標(biāo)生物產(chǎn)生抗性，延長(zhǎng)轉(zhuǎn)基因玉米的使用壽命。

本研究獲得了具有抗蟲耐除草劑復(fù)合性狀的轉(zhuǎn)基因玉米材料BFL4-1，對(duì)其分子特征進(jìn)行了分析，cry1Ab、cry1F和cp4epsps基因的表達(dá)具有遺傳穩(wěn)定性，且在農(nóng)藝性狀上與對(duì)照無顯著差異。在今后田間抗蟲性鑒定方面，除了玉米螟外，還需要對(duì)其他鱗翅目害蟲，如棉鈴蟲、黏蟲以及桃蛀螟的抗性進(jìn)行鑒定，這些害蟲也嚴(yán)重影響玉米生長(zhǎng)發(fā)育［17］。復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因作物在營養(yǎng)成分含量上與非轉(zhuǎn)基因作物可能存在差異，這可能與轉(zhuǎn)基因作物中包含的多個(gè)基因間存在協(xié)同、抑制或非關(guān)聯(lián)相互作用有關(guān)［18］。后續(xù)還需要對(duì)轉(zhuǎn)基因玉米BFL4-1進(jìn)行毒性、過敏性分析及環(huán)境安全評(píng)價(jià)和營養(yǎng)成分分析，為轉(zhuǎn)基因玉米BFL4-1的安全評(píng)價(jià)申報(bào)和培育奠定基礎(chǔ)。