王偉雄，胡少坤，古麗米熱·祖努納，黎進雪，王妍凌，呂澤，杜展成，張海軍，武運*

1(新疆農(nóng)業(yè)大學 食品科學與藥學學院，新疆 烏魯木齊，830052)2(新疆芳香莊園酒業(yè)股份有限公司，新疆 和碩，841200) 3(吐魯番樓蘭酒莊股份有限公司，新疆 吐魯番，838201)

非釀酒酵母廣泛存在于葡萄的種植環(huán)境和發(fā)酵環(huán)境中[1]，相關研究表明，采用控制接種釀酒酵母和非釀酒酵母混合發(fā)酵是提高葡萄酒復雜度和增強葡萄酒獨特性的有效方法[2-3]，非釀酒酵母中的某些代謝產(chǎn)物對葡萄酒的香氣具有重要貢獻[4]。由非釀酒酵母菌產(chǎn)生的天然抗菌劑可以有效抑制腐敗微生物，確保葡萄酒發(fā)酵進程平穩(wěn)進行，對于提升葡萄酒品質(zhì)具有重要貢獻[5-7]。但在葡萄酒釀造過程中由于非釀酒酵母發(fā)酵能力弱[8]、耐受性差[9]，導致其參與發(fā)酵周期短，對葡萄酒品質(zhì)影響較小，且商業(yè)酵母種類單一[10]，制約了葡萄酒風味的多樣性。

常壓室溫等離子體(atmospheric room temperature plasma，ARTP)原理是ARTP產(chǎn)生的高濃度活性粒子能夠使DNA單鏈或雙鏈發(fā)生斷裂，造成DNA損傷，進而誘發(fā)細胞啟動應急修復機制，引起微生物突變[11]。該項技術具有突變效率高、安全性高等特點[12]，目前ARTP誘變育種研究已日趨成熟，在食品、藥品、飼料等產(chǎn)業(yè)均有應用[13-14]。

從葡萄酒風味多樣性角度出發(fā)，結合非釀酒酵母耐受性方面存在的問題，本研究以從葡萄皮表面篩選的馬克斯克魯維酵母(Kluyveromycesmarxianus)YK為研究對象，采用ARTP誘變育種技術對出發(fā)菌株進行改良，以高耐受性為初篩標準對誘變菌株進行初篩，以高產(chǎn)酸、產(chǎn)酯為復篩標準對誘變菌株進行產(chǎn)香復篩，最終獲得高耐受性產(chǎn)香非釀酒酵母，并對遺傳穩(wěn)定性，發(fā)酵能力，產(chǎn)香能力進行驗證。后期將用篩選獲得的非釀酒酵母與釀酒酵母混合發(fā)酵，以期打破葡萄酒品質(zhì)單一性這一局面，為非釀酒酵母在葡萄酒發(fā)酵過程中的應用提供理論技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

馬克斯克魯維酵母(Kluyveromycesmarxianus)YK，新疆農(nóng)業(yè)大學食品科學與藥學學院食品生物發(fā)酵與質(zhì)量安全研究室。

1.1.2 化學試劑

無水乙醇、葡萄糖、氫氧化鈉、鹽酸，天津市致遠化學試劑有限公司；偏重亞硫酸鉀，名人生物科技有限公司；L(+)酒石酸，寧波金展生物科技有限公司；2,3,5-三苯基氯化四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride，TTC)，上海藍季生物科技發(fā)展有限公司；酚酞，天津市化學試劑三廠，以上實際均為分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

TTC上層培養(yǎng)基、TTC下層培養(yǎng)基配制方法見參考文獻[15]。

YPD培養(yǎng)基，青島高科技工業(yè)園海博生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

ⅡS型ARTP誘變儀，無錫源清天木生物科技有限公司；PTX-FA210型分析天平，福州華志科學儀器有限公司；LDZX-50KBS型立式高壓滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；HR40-A2型生物安全柜，青島海爾特種電器有限公司；MJX-100B-Z型生化培養(yǎng)箱，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；TU-1810型紫外可見光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；LE2002E電子天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 ARTP誘變試驗

試驗參數(shù)：參照文獻[16]中方法進行設置。

1.3.2 致死率計算

致死率計算如公式(1)所示：

(1)

1.3.3 高耐受性非釀酒酵母初篩

1.3.3.1 TTC培養(yǎng)基篩選

選取YPD固體培養(yǎng)基上生長的單菌落誘變菌株并重新接種到新的YPD固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)溫度為28 ℃，培養(yǎng)時間為48 h，48 h后將TTC上層培養(yǎng)基傾覆在TTC下層培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)3 h后觀察顯色情況，篩選出產(chǎn)酒精能力強的誘變菌株。

1.3.3.2 菌株發(fā)酵能力測試

采用杜氏小管發(fā)酵法, 將上步篩選的突變菌株, 以4%的接種量分別接種裝有杜氏小管和10 mL YPD液體培養(yǎng)基試管中，28 ℃條件下培養(yǎng), 測定菌株產(chǎn)氣能力,篩選發(fā)酵性能優(yōu)良的菌株。

1.3.3.3 菌株耐受性篩選

將上步篩選得到的突變菌株分別接種于不同葡萄糖質(zhì)量濃度(220、240、260、280 g/L)、SO2質(zhì)量濃度(40、50、60、70 mg/L)、乙醇體積分數(shù)(2%、4%、6%、8%)、pH值(2.5、3.0、3.5、4.0)的YPD液體培養(yǎng)基，接種量1×107CFU/mL，28 ℃培養(yǎng)24 h后在600 nm下測量吸光度，以不接種菌株的YPD液體培養(yǎng)基為空白對照。

1.3.4 產(chǎn)香非釀酒酵母復篩

總酯、總酸測定參考文獻[17]進行。

1.3.5 遺傳穩(wěn)定性試驗

將最終篩選得到的誘變菌株連續(xù)傳代培養(yǎng)5次，每一代菌株以4%的接種量接種于糖度為22.5 °Bx葡萄汁中28 ℃培養(yǎng)8 d，測誘變菌株產(chǎn)酒精能力和產(chǎn)酯產(chǎn)酸能力，驗證誘變菌株遺傳穩(wěn)定性。

1.3.6 發(fā)酵能力驗證

葡萄酒酒精度的測定參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》測定。

1.3.7 產(chǎn)香能力驗證

感官分析方法具體參照文獻[18]進行。品評小組由11名專業(yè)人員組成。在分析過程中，將酒樣隨機編號，每一個酒樣重復2次品評，對香氣特征進行標準描述，并進行量化。使用5分制對香氣強度進行打分，強度越高分值越高。

2 結果與分析

2.1 ARTP誘變時間的確定

原始菌株YK經(jīng)ARTP誘變后致死率曲線如圖1所示。隨著時間的增長，致死率也在隨之增大。當誘變時間為100 s時，致死率達到93.25%，誘變時間為120 s時，致死率達到100%，未發(fā)現(xiàn)有活菌存在。當致死率>90%時，菌株突變概率較高，突變幅度較大[19]。因此，選擇ARTP誘變時間100 s為本試驗的最佳誘變時間。

圖1 不同輻照下菌株YK致死率Fig.1 Lethality of YK strains after ARTP

2.2 高耐受性非釀酒酵母初篩

2.2.1 TTC培養(yǎng)基篩選

TTC作為一種顯色劑，在培養(yǎng)基上顏色的深淺反應菌株產(chǎn)酒精能力的強弱。產(chǎn)酒精能力越強的菌株，其呼吸酶的活力越旺盛，在顯色培養(yǎng)基上的顏色就越深。將通過ARTP誘變獲得的35株誘變菌株分別接種到YPD固體培養(yǎng)基上，以原始菌株YK作為對照，顯色情況如表1所示。原始菌株YK呈粉色，說明顯色為紅色的菌株YK-1，YK-8，YK-17，YK-24，YK-27，YK-28，以及深紅色的菌株YK-7，YK-12，YK-13，YK-14，YK-20，YK-21，YK-29產(chǎn)酒精能力較原始菌株均有所增強，將篩選得到的13株誘變菌株進行發(fā)酵能力篩選試驗。

表1 ARTP誘變菌株顯色結果Table 1 Colour result of ARTP mutagenesis strain

2.2.2 杜氏小管發(fā)酵能力篩選

將上步篩選得到的13株誘變菌株接種在裝有杜氏小管的試管中，產(chǎn)氣情況如表2所示。誘變菌株YK-1，YK-8，YK-12，YK-13，YK-24培養(yǎng)8 h就觀察到有氣體產(chǎn)生，說明誘變菌株起酵能力迅速，且YK-1，YK-8，YK-12起酵能力要優(yōu)于另外2株；培養(yǎng)12 h后誘變菌株YK-7，YK-21，YK-27未起酵，其余菌株均有氣體產(chǎn)生且YK-1，YK-29發(fā)酵能力強，已在杜氏小管中產(chǎn)生4/5氣體；培養(yǎng)24 h后誘變菌株YK-1，YK-29杜氏小管充滿氣體已完全浮在液面上；培養(yǎng)36 h原始菌株YK，誘變菌株YK-28杜氏小管充滿氣體，YK-8，YK-12，YK-13，YK-27發(fā)酵能力相同，已產(chǎn)生4/5氣體；48 h后除誘變菌株YK-7，YK-20，YK-24未能將杜氏小管中充滿氣體其余菌株均充滿氣體。綜合考慮誘變菌株YK-14，YK-17，YK-21，YK-27前期起酵速率慢發(fā)酵能力弱，因此選擇YK-1，YK-8，YK-12，YK-13，YK-28，YK-29起酵能力快，發(fā)酵能力強的菌株作為耐受性篩選出發(fā)菌株。

2.2.3 乙醇耐受性篩選

非釀酒酵母對乙醇具有較低的耐受性，參與葡萄酒發(fā)酵周期較短[20]。因此，篩選高酒精耐受性非釀酒酵母，提高非釀酒酵母存活時間，可以為葡萄酒貢獻更多的風味物質(zhì)。不同乙醇體積分數(shù)對菌株活性影響如圖2所示。乙醇體積分數(shù)在4%以內(nèi)，原始菌株YK表現(xiàn)出較高的乙醇耐受性，但當乙醇體積分數(shù)高于4%時，耐受性均低于其他誘變菌株；誘變菌株YK-1，YK-28，YK-29對乙醇的耐受性整體優(yōu)于誘變菌株YK-8，YK-12，YK-13；乙醇體積分數(shù)在6%以內(nèi)，誘變菌株均能正常代謝生長；當乙醇體積分數(shù)到8%時，6株誘變菌株生長代謝均受到了不同程度的抑制，其中菌株YK-8，YK-12，YK-13代謝緩慢，YPD液體培養(yǎng)基菌液輕微渾濁。

表2 杜氏小管產(chǎn)氣結果Table 2 Du′s tubule gas production result

圖2 不同乙醇體積分數(shù)對菌株代謝的影響Fig.2 Effect of different ethanol volume fraction on metabolism of strain

2.2.4 二氧化硫耐受性篩選

二氧化硫作為一種在葡萄酒中重要的食品添加劑被廣泛使用，在葡萄酒中具有殺菌增酸等多種作用[21]。將原始菌株及誘變菌株接種于YPD液體培養(yǎng)基中，生長情況如圖3所示。原始菌株YK及誘變菌株均表現(xiàn)較高的耐受性，代謝生長旺盛，菌液渾濁。二氧化硫質(zhì)量濃度在60 mg/L以內(nèi)時，菌株耐受性YK-28>YK-29>YK>YK-8>YK-12>YK-1>YK-13。

圖3 不同二氧化碳質(zhì)量濃度對菌株代謝的影響Fig.3 Effects of different SO2 mass concentration on metabolism of strains

2.2.5 糖度耐受性篩選

菌株對葡萄糖的耐受性如圖4所示。在葡萄糖質(zhì)量濃度<240 g/L時,原始菌株YK表現(xiàn)出高耐受性，當葡萄糖質(zhì)量濃度>240 g/L時，原始菌株YK生長代謝受到明顯抑制，發(fā)酵活力降低；誘變菌株YK-12表現(xiàn)出對葡萄糖的不耐受，在不同葡萄糖質(zhì)量濃度下，該菌株生長代謝緩慢，無法滿足葡萄酒的發(fā)酵條件；在葡萄糖質(zhì)量濃度達到280 g/L時，所有菌株均表現(xiàn)出不耐受。果酒酒精發(fā)酵時初始糖度一般<250 g/L[22]，所以在葡萄糖質(zhì)量濃度<250 g/L時除誘變菌株YK-12表現(xiàn)出不耐受，其余6株菌株均表現(xiàn)出一定的耐受性。

圖4 不同葡萄糖質(zhì)量濃度對菌株代謝的影響Fig.4 Effect of different glucose mass concentration on metabolism of strain

2.2.6 酸耐受性篩選

發(fā)酵過程中，葡萄汁酸度過高會直接影響酵母菌的活性，抑制其代謝生長甚至殺死酵母菌。因此，酵母要有一定的耐酸能力適應復雜的釀酒環(huán)境。不同酸度環(huán)境對菌株代謝影響如圖5所示。誘變菌株YK-12，YK-28在不同pH環(huán)境下具有較強的耐受性；誘變菌株YK-8對酸性環(huán)境敏感，在酸性環(huán)境下生長代謝緩慢；原始菌株YK，誘變菌株YK-1，YK-8，YK-13，YK-29在pH為2.5的高酸性環(huán)境中受到了嚴重抑制，隨著pH值的增高菌株生長代謝速率逐漸增強。葡萄酒在發(fā)酵過程中pH一般在3.3～3.5，此范圍內(nèi)雜菌會受到抑制，保證葡萄酒品質(zhì)。因此，原始菌株YK，誘變菌株YK-1，YK-12，YK-13，YK-28，YK-29在此酸度范圍內(nèi)能較好生長。

圖5 不同pH值對菌株代謝的影響Fig.5 Effect of different pH on metabolism of strain

綜上所述，結合菌株耐受性分析，選取誘變菌株YK-1，YK-12，YK-28，YK-29進行下一步產(chǎn)香復篩。

2.3 產(chǎn)香非釀酒酵母復篩

發(fā)酵衍生的酯類在很大程度上決定了葡萄酒的果味；有機酸影響發(fā)酵產(chǎn)品的風味與滋味，也是構成酵母揮發(fā)性風味的重要前體物質(zhì)[23]。采用皂化回流法對耐受性強的4株誘變菌株進行總酯、總酸含量測定，以原始菌株為對照，結果如表3所示。代謝生長72 h后，誘變菌株YK-29發(fā)酵液中總酯、總酸含量顯著高于其他各組菌株，分別為2.15 g/100mL、0.135%；誘變菌株YK-28產(chǎn)酯能力顯著低于對照組；誘變菌株YK-12與對照組產(chǎn)酯能力差異不顯著，分別為0.53、0.44 g/100mL。4株誘變菌株的產(chǎn)酸能力均高于對照組，產(chǎn)酸能力由高到低依次為YK-29>YK-12>YK-28>YK-1。

表3 菌株總酯、總酸含量Table 3 Total ester and total acid content of the strain

根據(jù)產(chǎn)酯、產(chǎn)酸能力測試，綜合分析篩選出產(chǎn)香能力最優(yōu)的誘變菌株YK-1、YK-29。

2.4 遺傳穩(wěn)定性測試

通過ARTP誘變選育的菌株仍然具有不穩(wěn)定性，會有回復性突變和隱性突變的可能，因此對誘變菌株進行傳代試驗是驗證菌株傳代穩(wěn)定性的有效方法[24]。將誘變菌株YK-1，YK-29連續(xù)傳代5次，測定產(chǎn)酸產(chǎn)酯能力，結果如表4所示。誘變菌株YK-1，YK-29產(chǎn)酯能力分別穩(wěn)定在1.55～1.7、2.02～2.21 g/100mL；產(chǎn)酸能力穩(wěn)定在0.051%～0.060%、0.131%～0.141%，各代菌株總酯、總酸含量差異不顯著，變化幅度小。因此，可以證明誘變菌株YK-1，YK-29產(chǎn)酯、產(chǎn)酸能力可以穩(wěn)定遺傳，發(fā)生回復性突變概率較小，可以應用到葡萄酒發(fā)酵中。

表4 菌株遺傳穩(wěn)定性測試結果Table 4 Genetic stability test results of the strain

2.5 發(fā)酵能力驗證

為驗證誘變菌株是否有良好的發(fā)酵性能，把誘變菌株接種到總糖含量為225 g/L的葡萄汁中進行發(fā)酵試驗，發(fā)酵溫度28 ℃，發(fā)酵周期為8 d，同時設原始菌株YK為對照組。發(fā)酵8 d后菌株產(chǎn)酒精能力如表5所示。誘變菌株YK-1，YK-29產(chǎn)酒精能力顯著高于對照組,分別為6.45%、7.31%，產(chǎn)酒精能力分別提高149%和169%，可以更長時間的參與葡萄酒的前期發(fā)酵，通過菌株的代謝為葡萄酒提供更多的風味物質(zhì)。因此，2株誘變菌株均有良好的發(fā)酵性能。

表5 菌株發(fā)酵能力驗證Table 5 Verification of fermentation ability of strain

2.6 產(chǎn)香能力驗證

由于非釀酒酵母發(fā)酵能力弱，無法獨自完成葡萄酒整個發(fā)酵過程，一般多采用與商業(yè)釀酒酵母混合發(fā)酵方式進行葡萄酒發(fā)酵[9]。因此，選擇將原始菌株YK，誘變菌株YK-1，YK-29與商業(yè)酵母以1∶1接種比例接種到葡萄汁進行發(fā)酵試驗。對3款葡萄酒進行定量描述分析，雷達圖如圖6所示。3款葡萄酒中主要的香氣是花香、水果味、生青味、漿果味、煙熏味、香料味。3款葡萄酒中漿果味、水果味香氣突出，2個特征香氣強度均高于對照組；花香強度3款酒基本一致；由于酒齡較輕的緣故，3款葡萄酒均帶有輕微生輕味，隨著酒齡的增長生青味會慢慢消失。整體來看，誘變菌株YK-1，YK-29接種增強了葡萄酒漿果味和水果味，與菌株產(chǎn)酯產(chǎn)酸能力相吻合。

圖6 香氣特征雷達圖Fig.6 Aroma characteristic radar map

3 結論

本研究通過從葡萄皮表面篩選分離的馬克斯克魯維酵母(Kluyveromycesmarxianus)YK經(jīng)過ARTP誘變后，利用TTC產(chǎn)酒精能力試驗，杜氏小管產(chǎn)氣試驗，耐受性試驗和產(chǎn)香試驗篩選獲得了2株耐受性高，產(chǎn)香能力強的誘變菌株YK-1和YK-29。將誘變菌株連續(xù)培養(yǎng)5代，分別接種于葡萄汁中，誘變菌株產(chǎn)酯產(chǎn)酸能力穩(wěn)定，具有良好的遺傳穩(wěn)定性。與出發(fā)菌株YK相比，誘變菌株YK-1，YK-29釀造的葡萄酒產(chǎn)酒精能力分別提高了149%和169%。通過定量描述分析，誘變菌株參與發(fā)酵的葡萄酒具有花香、水果味、生青味、漿果味、煙熏味、香料味，其中水果味和漿果香味強度均高于對照組。在葡萄酒發(fā)酵過程中誘變菌株的參與可以提高葡萄酒的香氣質(zhì)量，與本次試驗目的相符。

目前，對于非釀酒酵母的研究多數(shù)集中在其與釀酒酵母共發(fā)酵體系中菌種之間的相互作用，以及通過改變2種酵母菌的接種方式，接種比例探究混合發(fā)酵體系最佳發(fā)酵工藝條件來提高葡萄酒品質(zhì)等方面，對于非釀酒酵母本身研究較少。本研究以非釀酒酵母本身存在的問題為切入點，對新疆本土非釀酒酵母進行ARTP誘變，經(jīng)過多輪篩選最終得到能穩(wěn)定遺傳的目標菌株。誘變菌株YK-1，YK-29在葡萄酒中的應用有望改變葡萄酒品質(zhì)單一化的局面，在葡萄酒釀造生產(chǎn)方面具有更廣闊的應用前景。