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山茱萸多糖對胃癌細胞增殖和凋亡的機制

2022-02-24 06:47聶志勇李守淼王衛(wèi)杰李煥煥袁冬冬
中國藥理學(xué)通報 2022年2期
關(guān)鍵詞:山茱萸抑制率多糖

聶志勇,李守淼,王衛(wèi)杰,李煥煥,袁冬冬

(安陽市腫瘤醫(yī)院腫瘤內(nèi)科,河南 安陽 455000)

胃癌是我國常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤,研究發(fā)現(xiàn)中醫(yī)藥具有治療胃癌的作用,且在提高胃癌患者免疫力及改善生活質(zhì)量等方面具有一定優(yōu)勢[1-2]。如紅景天苷明顯抑制胃癌細胞的增殖并通過Bcl/Bax信號通路誘導(dǎo)其凋亡[3]。紫檀芪可能通過ROS激活線粒體途徑,從而抑制胃癌細胞增殖,誘導(dǎo)胃癌細胞凋亡[4]。山茱萸多糖是山茱萸的主要有效成分,其具有抗氧化、抗衰老、增強免疫功能及抗腫瘤等作用[5]。研究表明,山茱萸多糖可抑制人肝癌HepG2細胞及肺癌A549細胞增殖[6-7]。然而山茱萸多糖是否對胃癌有抗癌作用及其機制尚不清楚。長鏈非編碼RNA(lncRNA)在癌癥進展過程中起著至關(guān)重要的作用,可作為胃癌診斷,治療及評估預(yù)后等的生物靶點[8]。研究報道,lncRNAELF3-AS1可促進體外膀胱癌細胞的活力和遷移,并促進體內(nèi)異種移植腫瘤的生長[9]。沉默lncRNA ELF3-AS1可抑制口腔鱗狀細胞癌細胞的增殖[10]。以上研究表明,lncRNA ELF3-AS1可能在癌癥中起促癌作用。而lncRNA ELF3-AS1在胃癌中的作用及其對胃癌細胞增殖、凋亡的影響尚不清楚。本實驗旨在研究山茱萸多糖對胃癌細胞增殖、凋亡的影響及其機制是否與lncRNA ELF3-AS1有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 材料胃黏膜上皮細胞GES-1、胃癌細胞株AGS購自上海澳音生物科技有限公司;RPMI 1640完全培養(yǎng)基購自上海雅吉生物科技有限公司;山茱萸多糖購自上海益本生物醫(yī)藥科技有限公司;MTT試劑盒、Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自美國Sigma公司;蛋白提取試劑盒、BCA試劑盒購自上海經(jīng)科化學(xué)科技有限公司;實時熒光定量PCR試劑盒購自百奧邁科生物技術(shù)有限公司。

1.2 裸鼠荷瘤實驗BALB/C裸小鼠購自南京君科生物工程有限公司(動物合格證號;閔20190013),取對數(shù)生長期細胞AGS,消化制成單細胞懸液后,于每只裸鼠右后肢皮下接種2.0×106個細胞;所有裸鼠1周后皮下出現(xiàn)>5 mm的結(jié)節(jié)時表明移植瘤建立成功。將接種成功后的裸鼠隨機分為對照組、山茱萸多糖低、中、高劑量組,每組6只,按分組給藥,對照組每天給予蒸餾水灌胃,山茱萸多糖低、中、高劑量組分別按12.5、25、50 g·mg-1劑量給藥,每組每天灌胃1次,連續(xù)給藥10 d;在d 14、21、28時分別處死部分小鼠,剝離腫瘤組織,檢測腫瘤體積。取28 d后小鼠腫瘤組織參照“1.5”中方法檢測腫瘤組織中Ki-67、Bcl-2、Bax蛋白表達水平。

1.3 TUNEL法檢測裸鼠腫瘤組織中細胞凋亡指數(shù)將裸鼠移植瘤組織進行固定,經(jīng)石蠟包埋、切片后用二甲苯脫蠟,然后用胰蛋白酶消化,加入TUNEL反應(yīng)液37 ℃孵育1 h,加入過氧化物酶抗體37 ℃孵育30 min,滴加二氨基聯(lián)苯胺(DAB),室溫孵育30 min,然后封片,烘干,顯微鏡下觀察,細胞核染色呈棕黃色顆粒的為凋亡陽性細胞,細胞凋亡率/%=(染色陽性細胞數(shù)/總細胞數(shù))×100%。

1.4 細胞處理與分組胃黏膜上皮細胞GES-1、胃癌細胞AGS用RPMI 1640完全培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng),取對數(shù)生長期細胞AGS,分別用12.5、25、50 g·L-1的山茱萸多糖處理AGS細胞,作為山茱萸多糖低、中、高劑量組,不作處理的AGS細胞作為對照組;將si-NC、si-ELF3-AS1轉(zhuǎn)染至AGS細胞中,記為si-NC組、si-ELF3-AS1組;將pcDNA、pcDNA-ELF3-AS1轉(zhuǎn)染至AGS細胞后用50 g·L-1的山茱萸多糖處理,記為山茱萸多糖+pcDNA組、山茱萸多糖+pcDNA-ELF3-AS1組。

1.5 MTT檢測細胞增殖抑制率取培養(yǎng)48 h的各組細胞,每孔20 μL MTT溶液,孵育4 h后加入150 μL DMSO,振蕩反應(yīng)10 min,用酶標儀檢測490 nm處檢測吸光度(OD)值。細胞增殖抑制率/%=1-實驗組OD值/對照組OD值×100%。

1.6 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡收集培養(yǎng)48 h的細胞,用預(yù)冷的PBS漂洗2次,用結(jié)合緩沖液重懸,加入10 μL的Annexin V-FITC和5 μL的PI,混勻后避光孵育10 min,上流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.7 Western blot法檢測Ki-67、Bcl-2、Bax蛋白表達提取各組細胞總蛋白,BCA試劑盒定量。蛋白樣品進行SDS-PAGE,轉(zhuǎn)移至PVDF上,5%脫脂牛奶室溫封閉,加入Ki-67、Bcl-2、Bax的一抗,4 ℃孵育過夜;加入山羊抗兔IgG-HRP二抗室溫孵育2 h,暗室中曝光顯影,定影,用Quantity One分析蛋白條帶灰度值,以GAPDH為內(nèi)參計算目的條帶蛋白表達水平。

1.8 實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測lncRNA ELF3-AS1表達水平提取細胞總RNA,反轉(zhuǎn)錄成cDNA,進行PCR擴增,循環(huán)條件為95 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s;72 ℃ 30 s,共40個循環(huán);相對表達量采用2-△△Ct法計算。lncRNA ELF3-AS1上游引物序列:5′-TGAAGTCATCACGAACCGC-3′,下游引物序列:5′-GGAGCCCCAAGTTAATGCG-3′;GAPDH上游引物序列:5′-CCAGGGCTGCTTTTAACTCT-3′,下游引物序列:5′-GGACTCCACGACGTACTCA-3′。

2 結(jié)果

2.1 山茱萸多糖對胃癌AGS細胞裸鼠移植瘤體積變化的影響不同劑量山茱萸多糖處理的裸鼠14 d、21 d、28 d后,與對照組比較,山茱萸多糖低、中、高劑量組裸鼠移植瘤體積均明顯降低(P<0.05),見Fig 1,Tab 1。

Fig 1 Changes in volume of transplanted tumors in each group1:Control;2:Cornus officinalis polysaccharides low-dose group;3:Cornus officinalis polysaccharides middle-dose group;4:Cornus officinalis polysaccharides high-dose group

Tab 1 Effect of cornus officinalis polysaccharides on volume changes of gastric cancer AGS cell xenograft tumor in nude mice

Fig 2 Effectof cornus officinalis polysaccharides on tumor cell apoptosis in nude micedetected by TUNEL method1:Control;2:Cornus officinalis polysaccharides low-dose group;3:Cornus officinalis polysaccharides middle-dose group;4:Cornus officinalis polysaccharides high-dose group

2.2 TUNEL法檢測山茱萸多糖對裸鼠腫瘤細胞凋亡的影響不同劑量山茱萸多糖處理的裸鼠28 d后,與對照組[(9.22±0.96)%]比較,山茱萸多糖低、中、高劑量組腫瘤細胞凋亡指數(shù)[(29.55±2.56)%、(46.33±4.28%)、(68.26±5.28)%]升高(P<0.05),見Fig 2。

2.3 山茱萸多糖對裸鼠腫瘤組織增殖和凋亡相關(guān)蛋白表達的影響與對照組比較,山茱萸多糖低、中、高劑量組裸鼠腫瘤組織中Ki-67、Bcl-2表達水平降低,Bax表達水平升高(P<0.05),見Fig 3。

Fig 3 Proliferation and apoptosis-related protein expression1:Control;2:Cornus officinalis polysaccharides low-dose group;3:Cornus officinalis polysaccharides middle-dose group;4:Cornus officinalis polysaccharides high-dose group

2.4 山茱萸多糖對胃癌AGS細胞增殖及增殖相關(guān)蛋白表達的影響與對照組比較,山茱萸多糖低、中、高劑量組胃癌AGS細胞增殖抑制率[(19.04±1.67)%、(32.14±2.96)%、(51.36±3.65)%vs(0.00±0.00)%]升高,Ki-67蛋白表達水平降低,且呈劑量依賴性(P<0.05),見Fig 4。

Fig 4 Ki-67 protein expression1:Control;2:Cornus officinalis polysaccharides low-dose group;3:Cornus officinalis polysaccharides middle-dose group;4:Cornus officinalis polysaccharides high-dose group

2.5 山茱萸多糖對胃癌AGS細胞凋亡及凋亡相關(guān)蛋白表達的影響與對照組比較,山茱萸多糖低、中、高劑量組胃癌AGS細胞凋亡率[(13.17±1.13)%、(20.37±2.02)%、(29.56±2.18)%vs(7.64±0.52)%]升高,Bcl-2蛋白表達水平降低,Bax蛋白表達水平升高,且呈劑量依賴性(P<0.05),見Fig 5。

2.6 lncRNA ELF3-AS1在胃癌AGS細胞中的表達與GES-1比較,AGS細胞中ELF3-AS1表達水平(3.55±0.24vs1.00±0.07)升高(P<0.05)。

2.7 山茱萸多糖對胃癌AGS細胞中l(wèi)ncRNA ELF3-AS1表達的影響與對照組(1.00±0.06)比較,山茱萸多糖低、中、高劑量組胃癌AGS細胞中ELF3-AS1表達水平(0.77±0.05、0.63±0.04、0.41±0.04)降低,且呈劑量依賴性(P<0.05)。

2.8 抑制lncRNA ELF3-AS1表達對胃癌AGS細胞增殖和凋亡的影響與si-NC組比較,si-ELF3-AS1組ELF3-AS1表達水平降低,細胞抑制率升高,細胞凋亡率升高,Ki-67、Bcl-2蛋白表達水平降低,Bax蛋白表達水平升高(P<0.05),見Fig 6,Tab 2。

Tab2 Effect of inhibiting expression of lncRNA ELF3-AS1 on proliferation and apoptosis of gastric cancer AGS

2.9 lncRNA ELF3-AS1過表達逆轉(zhuǎn)了山茱萸多糖(50 g·L-1)對胃癌AGS細胞增殖和凋亡的作用與山茱萸多糖+pcDNA組比較,山茱萸多糖+pcDNA-ELF3-AS1組ELF3-AS1表達水平升高,細胞抑制率降低,細胞凋亡率降低,Ki-67、Bcl-2蛋白表達水平升高,Bax蛋白表達水平降低(P<0.05),見Fig 7,Tab 3。

Fig 5 Effect of cornus officinalis polysaccharides on apoptosis of gastric cancer AGS cellsA:Apoptosis-related protein expression;B:Apoptosis flow cytometry;1:Control;2:Cornus officinalis polysaccharides low-dose group;3:Cornus officinalis polysaccharides middle-dose group;4:Cornus officinalis polysaccharides high-dose group

Fig 6 Effect of inhibiting expression of lncRNA ELF3-AS1 on proliferation and apoptosis of gastric cancer AGS cellsA:Proliferation and apoptosis-related protein expression;B:Flow cytometric diagram of cell apoptosis

Tab3 Overexpression of lncRNA ELF3-AS1 reversed effect of cornus officinalis polysaccharide on proliferation and apoptosis of gastric cancer AGS cells

Fig 7 Overexpression of lncRNA ELF3-AS1 reversed effect of cornus officinalis polysaccharide on proliferation and apoptosis of gastric cancer AGS cellsA:Proliferation and apoptosis-related protein expression;B:Flow cytometric diagram of cell apoptosis;1:cornus officinalis polysaccharide+pcDNA group;2:cornus officinalis polysaccharide+pcDNA-ELF3-AS1 group

3 討論

中藥治療胃癌是我國獨特的治療手段,由于目前中藥在胃癌中治療的作用機制尚未完全揭示,使得中藥治療在臨床應(yīng)用中仍存在較大局限性[11-12]。因此,深入研究中醫(yī)藥治療胃癌的分子機制有助于其臨床治療。研究報道山茱萸多糖可抑制人宮頸癌HeLa及HepG2細胞的增殖,并促進細胞凋亡[13-14]。而山茱萸多糖對胃癌細胞增殖、凋亡的影響尚不清楚。本實驗建立皮下移植瘤裸鼠模型,用不同劑量的山茱萸多糖對裸鼠進行灌胃處理,結(jié)果顯示,裸鼠體內(nèi)移植瘤體積降低,裸鼠組織中細胞凋亡指數(shù)升高,且Ki-67、Bcl-2蛋白表達水平降低,Bax蛋白表達水平升高;說明山茱萸多糖可抑制裸鼠體內(nèi)移植瘤的生長。為進一步證明山茱萸多糖在體外的作用,用不同濃度山茱萸多糖處理胃癌細胞AGS后,細胞增殖抑制率升高,細胞凋亡率升高,Ki-67、Bcl-2蛋白表達水平降低,Bax蛋白表達水平升高,且呈劑量依賴性;表明山茱萸多糖可劑量依賴的抑制胃癌細胞增殖,且可促進細胞凋亡。以上結(jié)果表明山茱萸多糖在體內(nèi)體外均可抑制胃癌細胞的生長。

研究報道lncRNA ELF3-AS1可促進非小細胞肺癌細胞的侵襲和遷移[15];促進骨肉瘤細胞的增殖[16]。本實驗結(jié)果顯示,lncRNA ELF3-AS1在胃癌細胞AGS中同樣高表達;抑制lncRNA ELF3-AS1表達后,AGS細胞增殖抑制率升高,細胞凋亡率升高,Ki-67、Bcl-2蛋白表達水平降低,Bax蛋白表達水平升高;說明抑制lncRNA ELF3-AS1表達可抑制胃癌細胞增殖,促進細胞凋亡。此外,本實驗結(jié)果顯示,山茱萸多糖可降低胃癌細胞AGS中l(wèi)ncRNA ELF3-AS1表達水平;而lncRNA ELF3-AS1過表達逆轉(zhuǎn)了山茱萸多糖對胃癌AGS細胞增殖和凋亡的作用。

綜上所述,山茱萸多糖可能通過下調(diào)lncRNA ELF3-AS1抑制胃癌AGS細胞增殖,促進AGS細胞凋亡。本實驗發(fā)現(xiàn)山茱萸多糖同樣對胃癌具有抑癌作用,且可能通過調(diào)控ELF3-AS1作用。

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