陳旭青，周龍?jiān)疲?軍，吳繼勇，于希忠，嚴(yán)芮雯，嚴(yán)道南，馬華安

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院耳鼻喉科，2.南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)中心，江蘇 南京 210029；3.南京中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210046)

自然殺傷(natural killer，NK)細(xì)胞為機(jī)體固有免疫系統(tǒng)的重要組成，其于不同微環(huán)境刺激下，呈現(xiàn)出的分化傾向不一[1]。IL-12可誘導(dǎo)其分化為NK1型細(xì)胞，其以CD45RO等表型特征，分泌INF-γ等細(xì)胞因子，以協(xié)調(diào)免疫應(yīng)答。NK細(xì)胞NK2型分化，則可分泌大量IL-4、IL-5等Th2型細(xì)胞因子，介導(dǎo)變應(yīng)性炎癥反應(yīng)[2-3]。多項(xiàng)研究顯示，變應(yīng)性疾病狀態(tài)下，NK細(xì)胞可向病變部位募集，并發(fā)生NK2主導(dǎo)型活化，促進(jìn)局部Th2型細(xì)胞因子的表達(dá)[4-5]，即NK細(xì)胞NK2型活化與變應(yīng)性疾病發(fā)展密切關(guān)聯(lián)。故探討NK細(xì)胞異?；罨瘷C(jī)制，調(diào)控其功能紊亂，對(duì)變應(yīng)性疾病的治療具有重要價(jià)值。

線粒體為調(diào)控細(xì)胞各項(xiàng)生命活動(dòng)的動(dòng)力元件，其通過(guò)頻繁融合、分裂動(dòng)態(tài)變化維持內(nèi)部功能穩(wěn)態(tài)[6-7]。這一動(dòng)態(tài)平衡機(jī)制涉及多種蛋白，其中Drp1為調(diào)控線粒體分裂的關(guān)鍵分子。細(xì)胞內(nèi)Drp1過(guò)度活化，可于線粒體外膜大量募集，通過(guò)壓縮外膜加速線粒體分裂，并觸發(fā)活性氧(reactive oxygen species，ROS)大量?jī)?nèi)生，以此調(diào)控Ca2+穩(wěn)態(tài)、吞噬、炎癥反應(yīng)、凋亡等細(xì)胞諸多生命活動(dòng)[6]。近年研究顯示，NK細(xì)胞NK2型活化伴隨著線粒體動(dòng)態(tài)變化的失衡，存在線粒體過(guò)度分裂現(xiàn)象[8]，但兩者內(nèi)在關(guān)聯(lián)尚不明確?；诖?，本研究擬以線粒體分裂抑制劑Mdivi-1，探討重建NK細(xì)胞線粒體動(dòng)態(tài)平衡對(duì)NK細(xì)胞異?；罨挠绊?，并揭示NK細(xì)胞異常活化的內(nèi)在機(jī)制。

1 材料

1.1 主要儀器Herocell 180型CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo公司)、ELX800型酶標(biāo)儀(美國(guó)BioTek)、ChemiDoc XRS型化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀、Accuri C6 型細(xì)胞儀(美國(guó)BD)、Lecia DMI 3000B型倒置熒光顯微鏡(德國(guó)Leica公司)、Lecia SP8型激光共聚焦顯微鏡(德國(guó)Leica公司)。

1.2 主要藥品與試劑線粒體分裂抑制劑1(mitochondrial division inhibitor，Mdivi-1,M0199)購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司，重組人胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素(thymus stromal lymphopoietin，TSLP，300-62)購(gòu)自美國(guó)PeproTech公司，α-MEM培養(yǎng)基(11900024)、馬血清(16050122)、胎牛血清(10100147)、巰基乙醇(614272)購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，肌醇(A600536)、葉酸(A610466)、磷酸鹽(phosphate buffer saline，PBS)緩沖液粉末(B040100)購(gòu)自生工生物工程股份有限公司，ROS檢測(cè)熒光探針-二氫乙啶(dihydroethidium，DHE)試劑盒(KGAF019)購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，MitoTracker Green(40742ES50)購(gòu)自上海翊圣生物科技有限公司、牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA，ST025)、BCA蛋白定量試劑盒(P0012)購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，PVDF膜(IPVH00010)購(gòu)自美國(guó)Millipore公司，IL-4(70-EK104-96)、IL-5(70-EK105-96)、IFN-γ(70-EK180-48)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)試劑盒均購(gòu)自杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司，MnSOD兔多克隆抗體(ab13534)、Drp1兔單克隆抗體(ab184247)、β-actin兔多克隆抗體(ab8227)均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，p-Drp1兔多克隆抗體(3455S)購(gòu)自美國(guó)CST公司，HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG(A0208)購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞人惡性非霍奇金淋巴瘤患者的自然殺傷細(xì)胞(NK-92MI，GOY-ATCC-0016)購(gòu)自上海谷研實(shí)業(yè)有限公司。以含12.5%胎牛血清、12.5%馬血清、0.2 mmol·L-1肌醇、0.1 mmol·L-1巰基乙醇、0.02 mmol·L-1葉酸的α-MEM培養(yǎng)基，于37 ℃ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2 方法

2.1 實(shí)驗(yàn)分組NK-92MI細(xì)胞分為空白組、TSLP組、1 μmol·L-1Mdivi-1組、5 μmol·L-1Mdivi-1組、10 μmol·L-1Mdivi-1組。TLPS組細(xì)胞以20 μg·L-1TSLP刺激24 h，誘導(dǎo)NK細(xì)胞NK2分化。Mdivi-1組以20 μg·L-1TSLP聯(lián)合相應(yīng)濃度Mdivi-1孵育24 h。

2.2 上清細(xì)胞因子分析回收各組細(xì)胞上清，于500×g，4 ℃條件下離心10 min，獲取上清。據(jù)ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)樣、待測(cè)樣加樣，震蕩、洗滌，檢測(cè)抗體、HRP標(biāo)記的鏈霉親和素、底物孵育后，以酶標(biāo)儀進(jìn)行雙波長(zhǎng)掃描，測(cè)定各組上清IL-4、IL-5、IFN-γ水平。

2.3 蛋白印跡分析回收細(xì)胞樣本，經(jīng)裂解、勻漿、靜置、離心后，獲取蛋白上清。BCA法測(cè)定蛋白濃度，調(diào)整終濃度，高溫變性后-80 ℃凍存?zhèn)溆?。取蛋白樣品?jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳并轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5% BSA的TBST室溫封閉后，分別加入以1% BSA稀釋的IL-4、IFN-γ、p-JAK2、JAK2、p-STAT6、STAT6、β-actin抗體，4 ℃孵育過(guò)夜。次日孵育HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG。滴加ECL曝光液，以Bio-rad化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀顯影，拍照保存。圖像以ImageJ軟件分析。

2.4 細(xì)胞ROS檢測(cè)離心收集處理后細(xì)胞，以含25 μmol·L-1DHE的α-MEM培養(yǎng)基重懸，CO2培養(yǎng)箱中孵育1 h。離心，PBS洗滌，棄上清。500 μL PBS重懸，Accuri C6流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度。

2.5 線粒體形態(tài)觀察離心收集處理后細(xì)胞，以含37 ℃預(yù)熱的100 nmol·L-1MitoTracker Green α-MEM培養(yǎng)基，于CO2培養(yǎng)箱中孵育30 min。離心，PBS洗滌，棄上清。α-MEM培養(yǎng)基重懸，接種于激光共聚焦皿，激光共聚焦顯微鏡下拍照。

3 結(jié)果

3.1 Mdivi-1對(duì)NK-92MI細(xì)胞上清IL-4、IL-5、IFN-γ 水平的影響NK細(xì)胞NK2型活化以表達(dá)、分泌IL-4、IL-5因子為特征，而IFN-γ則為NK細(xì)胞NK1活化標(biāo)志性因子。如Fig 1所示，與對(duì)照組比較，TSLP組NK-92MI細(xì)胞上清中IL-4、IL-5水平明顯升高，IFN-γ水平下調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與TSLP組比較，5、10 μmol·L-1Mdivi-1組細(xì)胞上清IL-4、IL-5水平降低，10 μmol·L-1Mdivi-1組IFN-γ濃度則有所回升，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3.2 Mdivi-1對(duì)NK-92MI細(xì)胞內(nèi)生ROS的影響ROS為諸多變應(yīng)性疾病的重要病理信號(hào)，調(diào)控著NK細(xì)胞功能狀態(tài)[9-10]。如Fig 2、3所示，與對(duì)照組比較，TSLP組NK-92MI細(xì)胞ROS水平明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與TSLP組對(duì)比，5、10 μmol·L-1Mdivi-1組ROS水平降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3.3 Mdivi-1對(duì)NK-92MI細(xì)胞線粒體形態(tài)的影響線粒體過(guò)度分裂可觸發(fā)ROS大量生成，為變應(yīng)性炎癥、免疫細(xì)胞功能紊亂的重要因素[6,11]。如Fig 4所示，對(duì)照組NK-92MI細(xì)胞內(nèi)線粒體主要呈長(zhǎng)管狀，散布于胞質(zhì)。TSLP刺激后，NK-92MI細(xì)胞內(nèi)大量圓球狀線粒體生成。而Mdivi-1干預(yù)后，有效減少了TSLP刺激下球狀線粒體的生成。

3.4 Mdivi-1對(duì)NK-92MI細(xì)胞Drp活化、MnSOD表達(dá)的影響Drp1為調(diào)控線粒體分裂的關(guān)鍵因子，線粒體功能的紊亂伴隨著氧化應(yīng)激防御因子MnSOD表達(dá)的下調(diào)[7,12]。如Fig 5所示，與對(duì)照組比較，TSLP組NK-92MI細(xì)胞p-Drp1水平明顯上調(diào)，而MnSOD表達(dá)下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而Mdivi-1干預(yù)后，有效逆轉(zhuǎn)了上述分子表達(dá)變化，且該效應(yīng)隨著藥物劑量上調(diào)呈增強(qiáng)趨勢(shì)。

Fig 1 Levels of IL-4,IL-5 and IFN-γ in supernatant of each group n=3 )*P<0.05,**P<0.01 vs control group;#P<0.05,##P<0.01 vs TSLP group.

Fig 2 DHE staining of NK-92MI cells in each group n=3 )A：Control;B:TSLP;C:1 μmol·L-1 Mdivi-1;D:5 μmol·L-1 Mdivi-1;E:10 μmol·L-1 Mdivi-1;Scale bar=100 μm

Fig 3 Flow cytometric quantitative analysis of DHE staining of NK-92MI cells in each group n=4 )**P<0.01 vs control group;##P<0.01 vs TSLP group.

Fig 4 Mitochondrial morphology of each group by confocal fluorescence microscopy n=5 )**P<0.01 vs control group;##P<0.01 vs TSLP group.Scale bar=10 μm.

Fig 5 Expression of p-Drp1 and MnSOD A:Electrophoretogram of p-Drp1 and MnSOD in each group.B:Quantitative analysis of p-Drp1 and MnSOD expression.**P<0.01 vs control group;#P<0.05,##P<0.01 vs TSLP group.

4 討論

線粒體為高度動(dòng)態(tài)的網(wǎng)管狀細(xì)胞器，其動(dòng)態(tài)平衡機(jī)制調(diào)節(jié)著細(xì)胞系列生命活動(dòng)，而與多種生理病理變化密切關(guān)聯(lián)[6-7]。NK細(xì)胞是參與機(jī)體腫瘤免疫、變態(tài)反應(yīng)等活動(dòng)的重要細(xì)胞[5]。近年研究示，NK細(xì)胞功能紊亂，常伴隨著線粒體功能的失常，以及線粒體過(guò)度分裂現(xiàn)象[8,13]。然而粒體功能與NK細(xì)胞狀態(tài)間是否存在關(guān)聯(lián)尚不明確。本研究則立于“線粒體功能紊亂-細(xì)胞異常活化”這一視角，探討NK細(xì)胞NK2 活化的內(nèi)部機(jī)理，為NK細(xì)胞異?；罨瘷C(jī)制及潛在干預(yù)靶點(diǎn)這一研究盲區(qū)提供參考。

NK細(xì)胞NK2型活化，釋放IL-4、IL-5、IL-10等細(xì)胞因子，介導(dǎo)變應(yīng)性炎癥反應(yīng)，參與變應(yīng)性鼻炎、特應(yīng)性皮炎、哮喘等疾病的發(fā)生發(fā)展[2,14]。TSLP可有效誘導(dǎo)T細(xì)胞Th2型分化、NK細(xì)胞NK2活化，為加劇體內(nèi)外變應(yīng)性炎癥反應(yīng)的重要分子[15]。研究顯示，TSLP刺激后，NK-92MI細(xì)胞上清中IL-4、IL-5水平顯著升高，IFN-γ水平下調(diào)，符合NK細(xì)胞NK2型活化表征。而5、10 μmol·L-1Mdivi-1干預(yù)后，細(xì)胞上清IL-4、IL-5水平下調(diào)，IFN-γ 濃度亦有所回升，提示Mdivi-1能有效抑制TSLP刺激所誘導(dǎo)的NK細(xì)胞Th2反應(yīng)相關(guān)因子的分泌。

Mdivi-1為調(diào)節(jié)Drp1活性以特異性逆轉(zhuǎn)線粒體分裂事件的化學(xué)分子[16]。近年來(lái)，Mdivi-1已廣泛運(yùn)用于線粒體動(dòng)態(tài)變化與腫瘤、神經(jīng)退行性、心血管疾病等關(guān)聯(lián)的探索之中[16-17]。線粒體熒光探針MitoTracker染色示，TSLP刺激后，大量球狀線粒體分布于NK細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)，提示線粒體分裂亢進(jìn)，這一現(xiàn)象與其他其他文獻(xiàn)報(bào)道相符[6,8]。而Mdivi-1干預(yù)后，TSLP誘導(dǎo)下NK細(xì)胞線粒體過(guò)度分裂現(xiàn)象得到顯著改善，其線粒體長(zhǎng)度亦有所回歸。蛋白印跡分析示，Mdivi-1干預(yù)可有效抑制NK細(xì)胞異?；罨癄顟B(tài)下線粒體分裂調(diào)控因子Drp1的活化。提示Mdivi-1抗NK細(xì)胞NK2型活化作用可能與其抑制線粒體過(guò)度分裂，重建線粒體動(dòng)態(tài)平衡相關(guān)。

線粒體過(guò)度分裂可觸發(fā)大量?jī)?nèi)生ROS的生成[6]，而后者與T、B、NK細(xì)胞等異?；罨芮嘘P(guān)聯(lián)[9,18]。DHE染色及流式分析顯示，TSLP刺激下NK細(xì)胞內(nèi)生ROS水平明顯升高。而Mdivi-1干預(yù)則能有效下調(diào)TSLP刺激下NK細(xì)胞ROS內(nèi)生，且該效應(yīng)與Mdivi-1濃度呈正相關(guān)態(tài)勢(shì)。同時(shí)，蛋白印跡分析亦顯示，TSLP刺激下NK細(xì)胞MnSOD這一氧化應(yīng)激防御因子表達(dá)的下調(diào)，亦于Mdivi-1干預(yù)后得到一定程度逆轉(zhuǎn)。綜上，Mdivi-1調(diào)節(jié)NK細(xì)胞ROS水平，可能是其抑制線粒體分裂以改善NK細(xì)胞NK2型活化的效應(yīng)環(huán)節(jié)之一。

本次試驗(yàn)存在一些問(wèn)題：(1)鑒于原代NK細(xì)胞培養(yǎng)難度較大，本研究以NK92MI細(xì)胞株作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，研究結(jié)果可能存在一定偏倚；(2)本研究未能選擇Drp1基因沉默技術(shù)調(diào)節(jié)線粒體分裂，從抑制劑及基因敲降兩個(gè)層面同步驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果；(3)Mdivi-1抑制線粒體分裂后，具體通過(guò)哪些分子機(jī)制鏈影響NK細(xì)胞分化未進(jìn)一步深入探索，這是我們下一步研究的重要方向。

綜上，通過(guò)Mdivi-1抑制線粒體過(guò)度分裂，重建線粒體動(dòng)態(tài)變化，可有效抑制TSLP刺激下NK細(xì)胞NK2型活化。線粒體動(dòng)態(tài)失衡是NK細(xì)胞異?；罨膬?nèi)在機(jī)制之一，其可能為改善NK細(xì)胞NK2型活化介導(dǎo)的變應(yīng)性炎癥反應(yīng)的重要靶點(diǎn)。