高大玉，張均雩，李 倩，顧冰潔，王小琴，袁 海，沈敏寧，陳興國(guó)

0 引 言

痛風(fēng)是單鈉尿酸鹽(monosodium urate, MSU)晶體在關(guān)節(jié)內(nèi)及其周圍形成和沉積，引起關(guān)節(jié)急性紅腫、疼痛，常反復(fù)發(fā)作，并引起嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)和不可逆的骨侵蝕[1]。研究發(fā)現(xiàn)，高尿酸血癥與痛風(fēng)密切相關(guān)，其不僅是痛風(fēng)發(fā)作的病因，也是痛風(fēng)發(fā)作的重要標(biāo)志[2]。臨床工作中發(fā)現(xiàn)，有部分痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎患者急性發(fā)作期血尿酸(serum uric acid, SUA)水平較慢性緩解期降低，甚至降低到正常范圍內(nèi)(≤420 μmol/L)[3-7]。研究發(fā)現(xiàn),急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎時(shí)SUA的降低與尿酸排泄增加有關(guān)[5, 8]。有學(xué)者認(rèn)為,腎上腺糖皮質(zhì)激素及炎癥因子C反應(yīng)蛋白(CRP)、白細(xì)胞介素6(IL-6)的增加可能參與降尿酸過程[5]。上述研究結(jié)論提示在痛風(fēng)急性發(fā)作時(shí)，機(jī)體自身可能通過啟動(dòng)生理機(jī)制增加腎排泄，從而達(dá)到自我調(diào)節(jié)尿酸濃度的目的，但具體機(jī)制尚未闡明。

痛風(fēng)急性發(fā)作期患者血清中外泌體表達(dá)明顯增加。由此推測(cè)，外泌體可能參與了尿酸代謝的調(diào)控。URAT1是一種重要的尿酸重吸收轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。本研究通過提取痛風(fēng)發(fā)作期、緩解期以及正常人的血清外泌體，并分別作用于轉(zhuǎn)染URAT1基因的人胚胎腎細(xì)胞株(Human Embryonic Kidney 293，HEK 293)，通過檢測(cè)URAT1的表達(dá)變化，探討外泌體對(duì)尿酸重吸收的調(diào)控機(jī)制，及導(dǎo)致痛風(fēng)患者急性發(fā)作期血尿酸下降的可能原因。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象選取并收集2021年1月至2021年6月南京市第一醫(yī)院風(fēng)濕免疫科就診的17例痛風(fēng)患者和17例健康體檢者臨床資料和血清標(biāo)本。痛風(fēng)患者均為男性，年齡22～86歲，中位年齡58.5歲。所有患者均符合2015年EULAR/ACR提出的痛風(fēng)分類標(biāo)準(zhǔn)診斷[9]。分別在痛風(fēng)患者的急性發(fā)作期(急性發(fā)作組)和慢性緩解期(慢性緩解組)收集臨床資料及血清。同時(shí)選取17名健康體檢人員作為對(duì)照組。各組患者人口及臨床特征差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見表1。痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎急性發(fā)作患者納入標(biāo)準(zhǔn)：有典型的關(guān)節(jié)紅、腫、熱、痛的臨床表現(xiàn)，未接受非甾體消炎藥、激素、秋水仙堿及降尿酸藥物治療，患者發(fā)作時(shí)炎癥指標(biāo)血沉(ESR)明顯升高，且SUA明顯低于其慢性緩解期(≥60 μmol/L)的患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并心腦血管、內(nèi)分泌疾病、惡性腫瘤、血液系統(tǒng)疾病及其他風(fēng)濕疾?。粐?yán)重腎功能不全(腎小球?yàn)V過率GFR<30 mL/min，血清肌酐水平> 2.0 mg/dL)；肝炎或肝功能不全(丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶或天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶水平>2.0×正常上限)；傳染病病史等。研究經(jīng)南京市第一醫(yī)院倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)(批件號(hào)：KY20210628-03)，所有受試均知情同意。

表1 不同分期痛風(fēng)患者臨床特點(diǎn)比較

1.2外泌體提取收集所有患者空腹外周血，室溫下以2000×g轉(zhuǎn)速離心10 min，分離血清，并在-80 ℃下保存。將外周血清以2000×g和4 ℃離心20 min去除死細(xì)胞，再以10 000×g和4 ℃離心30 min去除細(xì)胞碎片。將上清液轉(zhuǎn)移到另一個(gè)干凈的離心管中，在120 000×g和4℃條件下進(jìn)行60 min的超離心。丟棄上清液后用PBS重懸沉積的外泌體，然后在120 000×g和4℃條件下超離60 min。純化后的外泌體用PBS重懸以供進(jìn)一步研究或在-80 ℃保存。

1.3外泌體的鑒定采用免疫印跡法鑒定外泌體的特異性蛋白標(biāo)記物CD63(美國(guó)Cell Signaling Technology)。利用納米顆粒跟蹤分析儀(ZetaView PMX 110)對(duì)外泌體的大小和數(shù)量進(jìn)行納米顆粒跟蹤分析(上海生博生物醫(yī)藥科技有限公司)。并使用JEM-1010電子顯微鏡(JEOL)對(duì)外泌體的形態(tài)進(jìn)行拍照，由南京醫(yī)科大學(xué)分析測(cè)試中心操作鑒定，實(shí)驗(yàn)儀器為透射電子顯微鏡JEOL JEM-1010。

1.4URAT1過表達(dá)腎細(xì)胞株的制備

1.4.1 質(zhì)粒的構(gòu)建URAT1慢病毒在上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司處購(gòu)買，具體信息見圖1。

基因名稱：SLC22A12(NM_144585)，物種：Human，載體名稱：GV492，熒光標(biāo)記：EGFP，克隆位點(diǎn)：Age I，元件順序：Ubi-MCS-3FLAG-CBh-gcGFP-IRES-puromycin

1.4.2URAT1目的基因轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞將HEK293細(xì)胞接種到6孔板(板1)中培養(yǎng)；另用一塊6孔板(板2)以相同細(xì)胞密度接種一孔用于第2天計(jì)數(shù)。各孔加入2 mL培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，胰酶消化用于計(jì)數(shù)孔內(nèi)細(xì)胞，得到板1每孔細(xì)胞數(shù)。將板1中的細(xì)胞分為2組，每3孔為一組，各對(duì)應(yīng)一種慢病毒，按感染復(fù)數(shù)=5將目的基因慢病毒和對(duì)照慢病毒分別加入到2組HEK293細(xì)胞中，混勻后培養(yǎng)48 h。感染48 h后，EDTA消化病毒感染過的細(xì)胞，將各組中的3孔細(xì)胞合并收集, 轉(zhuǎn)移至新的6孔板中培養(yǎng)，其中每塊新的6孔板留出一孔用于陰性對(duì)照(即不加嘌呤霉素培養(yǎng))。根據(jù)HEK293細(xì)胞嘌呤霉素最低致死濃度測(cè)定的結(jié)果，用含0.6 g/L嘌呤霉素的培養(yǎng)基。連續(xù)加藥培養(yǎng)12 d，待細(xì)胞長(zhǎng)滿后，使用光學(xué)顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染穩(wěn)定后2種細(xì)胞的形態(tài)。

1.4.3轉(zhuǎn)染URAT1后的合格細(xì)胞株熒光鑒定在URAT1穩(wěn)轉(zhuǎn)株及空載體穩(wěn)轉(zhuǎn)株細(xì)胞生長(zhǎng)至融合率約為80%后，取出細(xì)胞，用PBS洗3次，每次5 min。4%多聚甲醇覆蓋細(xì)胞，室溫靜置15 min后，用PBS洗3次，每次5 min。5 mg/L DAPI室溫避光染色5 min，用PBS洗3次，每次5 min。加入PBS覆蓋細(xì)胞，使用熒光顯微鏡觀察并在相同曝光條件下拍攝細(xì)胞照片。

1.4.4Westernblot檢測(cè)URAT1的蛋白表達(dá)水平利用RIPA裂解液提取全細(xì)胞蛋白，超聲破碎后以13 000×g、4 ℃條件下離心10 min, 取上清, 使用BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定樣品總蛋白濃度。蛋白質(zhì)(30 μg)通過10% SDS-PAGE進(jìn)行分離，并轉(zhuǎn)移到硝化纖維膜。5%的脫脂牛奶室溫下2 h封閉后,加入事先按說明書比例配制的對(duì)應(yīng)一抗，4 ℃ 搖床過夜,室溫用TBST洗膜3次，每次10 min。加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗兔抗(1∶20 000稀釋)或鼠抗(1∶5000稀釋)，室溫下孵育2 h。TBST洗膜3次，每次10 min。將A、B發(fā)光液按比例稀釋混合，滴上發(fā)光液，在成像系統(tǒng)中顯像，用圖象處理系統(tǒng)Image J分析目標(biāo)條帶光密度值。主要用于免疫印跡分析的抗體包括：GAPDH兔一抗：南京翼飛雪生物科技有限公司，URAT1兔一抗：賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司，HRP-標(biāo)記二抗兔IgG：碧云天生物科技。

1.4.5實(shí)時(shí)熒光定量(qRT-PCR)檢測(cè)URAT1的mRNA表達(dá)水平使用TRIzol提取HEK293細(xì)胞的總RNA。RNA反轉(zhuǎn)錄獲得 cDNA(HiScript? Q Select RT SuperMix for qPCR),使用qRT-PCR儀(Applied Biosystems life technologies)和AceQ qPCR SYBR Green Master Mix(南京諾唯贊生物科技有限公司)在如下熱循環(huán)條件下進(jìn)行qPCR：10 s 95 ℃，緊隨其后10 s 95 ℃，30 s 60 ℃，然后95 ℃ 15 s，60 ℃持續(xù)60 s，95 ℃ 15 s獲得熔化曲線。用2-ΔΔCt方法定量相對(duì)基因表達(dá)。數(shù)據(jù)以GAPDH mRNA水平為標(biāo)準(zhǔn)。引物為:URAT1，正向5′ TCTCCACGTTGTGCTGGTTC-3′，反向5′-GGATGTCCACGACACCAATGA-3′;和GAPDH,正向5′GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′和反向5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′。

1.5尿酸攝取實(shí)驗(yàn)

1.5.1 外泌體刺激細(xì)胞將5×104個(gè)的HEK293 URAT1+細(xì)胞接種到12孔板中。待細(xì)胞增長(zhǎng)至70%～80%時(shí)，分別加入急性發(fā)作期、慢性緩解期的外泌體10 μg/mL共培養(yǎng)6 h，并作一組未加入外泌體的空白對(duì)照。更換培養(yǎng)基，分別于第30、60、90、120、180分鐘時(shí)收取細(xì)胞，通過qRT-PCR檢測(cè)其URAT1 mRNA的表達(dá)情況。

1.5.2細(xì)胞攝取尿酸實(shí)驗(yàn)在預(yù)實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)過尿酸濃度梯度(400-500-600-700-800 μmol/L)后，發(fā)現(xiàn)加入800 μmol/LUA刺激細(xì)胞后，細(xì)胞反應(yīng)結(jié)果較好；同時(shí)，800 μmol/L是常規(guī)患者血液濃度的可達(dá)到濃度高值。因此，選擇800 μmol/L作為最終實(shí)驗(yàn)濃度。在與未經(jīng)外泌體或經(jīng)慢性緩解期、急性發(fā)作期外泌體共培養(yǎng)6 h后，加入高濃度800 μmol/L無菌尿酸溶液刺激細(xì)胞，于60 min收集細(xì)胞上清液，檢測(cè)尿酸濃度，測(cè)得尿酸的濃度差，計(jì)算不同狀態(tài)下HEK293 URAT1+細(xì)胞的尿酸攝取率。

2 結(jié) 果

2.1 外泌體鑒定結(jié)果

2.1.1 透射電子顯微鏡通過透射電子顯微鏡可觀察到杯狀或圓形囊泡狀結(jié)構(gòu)，直徑為130～150 nm，符合典型外泌體的形態(tài)和大小，確認(rèn)已成功提取外泌體。同時(shí)可以發(fā)現(xiàn)，慢性緩解期患者外泌體直徑略大于正常人和急性發(fā)作期患者見圖2。

a:正常人；b:慢性緩解期；c:急性發(fā)作期；標(biāo)尺：200 nm圖 2 外泌體透射電鏡顯微鏡鑒定結(jié)果Figure 2 Identification of exosomes by TEM

2.1.2免疫印跡檢測(cè)通過在蛋白水平對(duì)外泌體表面特異性標(biāo)記物CD63檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)正常人、慢性緩解期患者、急性發(fā)作期患者的外泌體濃度逐漸升高，這與痛風(fēng)疾病活動(dòng)的變化相符。

2.1.3納米顆粒跟蹤分析通過納米顆粒跟蹤分析(Nanoparticle Tracking Analysis, NTA)檢測(cè)，見表2，發(fā)現(xiàn)正常人的外泌體粒徑最小(P<0.05)，慢性緩解期與急性發(fā)作期外泌體的粒徑差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；而就顆粒濃度而言，急性發(fā)作期的外泌體濃度最高，慢性緩解期的濃度次之，正常人的最低(P<0.01)，見圖3，表2。

表2 外泌體NTA計(jì)數(shù)及粒徑分析表

1:急性發(fā)作期；2：慢性緩解期；3：正常人a:血清外泌體蛋白Western Blot檢測(cè)膜蛋白CD63表達(dá)；b:粒徑大小分析;c:顆粒濃度分析*P<0.05、**P<0.01圖 3 外泌體鑒定結(jié)果Figure 3 Identification of exosomes

2.2HEK293細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)URAT1滿布綠色熒光證實(shí)URAT1基因成功轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中(圖4a,b)，且顯示視野范圍內(nèi)無明顯未轉(zhuǎn)染細(xì)胞，提示轉(zhuǎn)染效率較高，HEK293 URAT1+細(xì)胞模型構(gòu)建成功。見圖4。并從mRNA水平和蛋白水平分別驗(yàn)證URAT1表達(dá)情況。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染了URAT1基因的HEK293細(xì)胞在mRNA水平和蛋白水平均高表達(dá)了URAT1，明顯高于未轉(zhuǎn)染細(xì)胞及轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照細(xì)胞。見圖5。

a：熒光顯微鏡白光；b：熒光顯微鏡DAPI；c：熒光顯微鏡GFP圖 4 熒光顯微鏡觀察HEK293細(xì)胞中URAT1質(zhì)粒Figure 4 Observation of URAT1+ plasmid in HEK293 cells

1:HEK293細(xì)胞;2:HEK293轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照;3:HEK293轉(zhuǎn)染URAT1

2.3尿酸攝取結(jié)果

2.3.1 經(jīng)外泌體刺激后的細(xì)胞URAT1表達(dá)情況過表達(dá)URAT1的HEK293細(xì)胞在與外泌體共培養(yǎng)后，與未加入外泌體的細(xì)胞相比，急性發(fā)作期組URAT1 mRNA表達(dá)水平明顯降低(P<0.01)，慢性緩解期組略有下降(P<0.05)。

2.3.2與尿酸共培養(yǎng)后HEK293URAT1+細(xì)胞對(duì)尿酸的攝取率在過表達(dá)URAT1的HEK293細(xì)胞中，尿酸攝取率在不同外泌體共培養(yǎng)狀態(tài)下具有明顯差異。未加外泌體組尿酸攝取率為(6.03±0.62)×10-4，加入急性發(fā)作組為(2.15±0.43)×10-4，與未加外泌體相比明顯降低(P<0.01)；加入慢性緩解組也有所降低，但不如急性發(fā)作期明顯(P<0.05)，且急性發(fā)作期與慢性緩解期間差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

3 討 論

本研究旨在探索痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎急性發(fā)作期部分患者血尿酸下降的可能的原因。在這項(xiàng)研究中，構(gòu)建了過表達(dá)尿酸重吸收蛋白URAT1的細(xì)胞模型，即HEK293 URAT1+細(xì)胞，并給予痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎不同時(shí)期外泌體刺激，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞攝取尿酸的能力下降。

尿酸的排泄減少是發(fā)生高尿酸血癥的原因[10]。人體中，2/3的尿酸經(jīng)腎排泄，另1/3的尿酸經(jīng)腸道排泄[11]。人體尿酸排泄的中心是尿酸重吸收和分泌之間的動(dòng)態(tài)平衡。而這一過程主要通過各種尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的參與完成，包括尿酸重吸收蛋白以及尿酸分泌蛋白、多藥耐藥蛋白4(MRP4)、Na+-磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(NPT1/NPT4)、ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2(ABCG2)等[11]。其中URAT1是一種主要的尿酸重吸收轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，位于腎近端小管上皮細(xì)胞的頂端膜上，在維持尿酸穩(wěn)態(tài)中起著關(guān)鍵作用[12]。

診斷為高尿酸血癥的患者在急性痛風(fēng)發(fā)作時(shí)，SUA水平有時(shí)會(huì)下降甚至在正常范圍內(nèi)[5-8]。這一現(xiàn)象已被廣泛認(rèn)識(shí)，同時(shí)也對(duì)于痛風(fēng)的診斷造成一定影響。雖然研究發(fā)現(xiàn)痛風(fēng)急性發(fā)作期SUA下降可能與腎尿酸排泄增加有關(guān)[8]；但造成這種現(xiàn)象的機(jī)制并不明確。本研究討論痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎急性發(fā)作時(shí)SUA水平的降低是否與尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)量有關(guān)，以及外泌體是否在尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)中起作用。

本研究通過超速離心后得到的沉淀，經(jīng)TEM鑒定后確認(rèn)了為外泌體。通過對(duì)重懸后的外泌體進(jìn)行納米顆粒跟蹤分析(Nanoparticle Tracking Analysis, NTA)，結(jié)合Stockes-Einstein方程式計(jì)算并得出的外泌體顆粒流體力學(xué)直徑和濃度。經(jīng)NTA檢測(cè)回報(bào)，正常人的外泌體直徑最小，慢性緩解期痛風(fēng)患者外泌體的直徑與急性發(fā)作期的相差較小；而急性發(fā)作期外泌體濃度最高，慢性緩解期次之，正常人的最低。由此我們初步得出結(jié)論，外泌體的濃度與痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎疾病活動(dòng)相關(guān)。

為解不同時(shí)期外泌體對(duì)尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白URAT1的影響，本研究將URAT1轉(zhuǎn)染進(jìn)入HEK293細(xì)胞，得到穩(wěn)定表達(dá)URAT1的細(xì)胞，再經(jīng)不同時(shí)期外泌體共培養(yǎng)后，發(fā)現(xiàn)在與急性發(fā)作期外泌體共培養(yǎng)后，與未加入外泌體的細(xì)胞相比，URAT1 mRNA表達(dá)水平明顯降低。這提示我們，外泌體可能通過某種機(jī)制靶向URAT1影響其表達(dá)。

過表達(dá)URAT1 的HEK293細(xì)胞在未經(jīng)外泌體或經(jīng)與慢性緩解期、急性發(fā)作期外泌體共培養(yǎng)6 h后，加入800 μmol/L高濃度UA刺激細(xì)胞，第60分鐘后尿酸濃度具有明顯差異，即尿酸攝取有差異。與未加外泌體相比，加入急性發(fā)作期外泌體組尿酸攝取明顯降低，慢性緩解期外泌體組亦有所下降，但無前者明顯。尿酸攝取降低的原因可能是外泌體內(nèi)攜帶的某些具有調(diào)控能力的物質(zhì)，作用于URAT1，從而使得結(jié)果呈現(xiàn)出攝取尿酸降低的趨勢(shì)。而對(duì)于慢性緩解期外泌體降低尿酸攝取的能力比急性發(fā)作期外泌體稍低，其原因可能是由于慢性緩解期的患者處于一種長(zhǎng)期的高尿酸刺激的情況下，機(jī)體在減少尿酸攝取的同時(shí)也有了一定的耐受能力。

外泌體是細(xì)胞通過內(nèi)體途徑分泌到細(xì)胞外的具有生物活性的脂質(zhì)雙層納米囊泡，直徑為40～160 nm，可攜帶多種蛋白質(zhì)、mRNA、miRNA等，在腫瘤、免疫、代謝性疾病中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[13]。

目前國(guó)內(nèi)外尚未關(guān)于外泌體是否對(duì)痛風(fēng)/尿酸有影響及兩者相關(guān)性的研究，亦未查閱到外泌體與尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白兩者相關(guān)性的研究，本研究在一定程度上提供了新的痛風(fēng)研究思路及方向。而且，隨著藥物載體系統(tǒng)的研究發(fā)展，外泌體作為載體已成為藥物輸送領(lǐng)域的新型治療工具[14]，這為臨床上尋找新的安全有效的降尿酸藥物提供了可能。

本研究尚有一些不足之處。首先，因?yàn)檠芯啃枰?，所挑選血清樣本的要求較為嚴(yán)格，故本研究收集樣本較少，有待進(jìn)一步增加樣本量研究；其次，因?yàn)樾∈笸达L(fēng)模型的缺乏，我們并未進(jìn)行體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，有待進(jìn)行在體實(shí)驗(yàn)以證明我們的研究結(jié)果。

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)了外泌體可能調(diào)控了尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白URAT1的功能，在之后的實(shí)驗(yàn)中，我們將進(jìn)一步明確其分子機(jī)制，確定外泌體中具體發(fā)揮調(diào)控作用的物質(zhì)，比如通過基因芯片篩選出差異表達(dá)的miRNA、預(yù)測(cè)其下游可能的靶基因等，深入探索痛風(fēng)急性發(fā)作期血尿酸下降的原因。