單婷婷 張敬波

(大連市檢驗(yàn)檢測(cè)認(rèn)證技術(shù)服務(wù)中心，大連 116021)

1 前言

氯化苦(三氯硝基甲烷，英文名Chloropicrin)作為我國(guó)應(yīng)用較久的糧倉(cāng)熏蒸劑，主要用于殺滅糧食中的害蟲，氯化苦對(duì)糧食有破壞作用，大量使用會(huì)在糧食中殘留。我國(guó)現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法為比色法[1]，但該方法靈敏度低，重現(xiàn)性差，介質(zhì)背景干擾大。對(duì)氯化苦殘留量的測(cè)定文獻(xiàn)報(bào)道主要采用酸回流、石油醚和無水乙醇方法[2-4]，酸回流方法提取樣品中的氯化苦操作繁瑣，石油醚提取樣品中的氯化苦損耗大、且對(duì)人員健康和環(huán)境有一定的危害，而無水乙醇直接提取糧食中的氯化苦對(duì)色譜柱污染嚴(yán)重，重現(xiàn)性差。頂空-氣相色譜法[5,6]需自動(dòng)頂空進(jìn)樣器，有些實(shí)驗(yàn)室不具備檢測(cè)條件，手動(dòng)進(jìn)樣誤差較大。本實(shí)驗(yàn)采用無水乙醇提取，提取液經(jīng)凈化后用正己烷反萃，氣相色譜法測(cè)定，降低了食品基質(zhì)對(duì)色譜柱的污染，方法簡(jiǎn)單、快捷、靈敏度高、重現(xiàn)性好。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器、試劑與材料

Agilent6890N氣相色譜儀，配電子捕獲檢測(cè)器和自動(dòng)進(jìn)樣器。

氯化苦標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(100 mg/L)；乙醇和正己烷(色譜純)；氯化鈉 (分析純，使用前550 ℃灼燒4 h)，使用前將氯化鈉配制成飽和溶液；實(shí)驗(yàn)用水為超純水；PSA固相萃取填料(粒徑40～63 μm)，C18固相萃取填料(粒徑50 μm)；大米、小麥、大豆油(市售)。

2.2 色譜條件

色譜柱：DB-5彈性石英毛細(xì)管柱(30 m×0.32 mm×1.5 μm)；載氣：高純氮，流量：1.5 mL/min，恒流模式 ；補(bǔ)償氣：氮?dú)?，流量?0 mL/min；檢測(cè)器溫度：300 ℃；進(jìn)樣口溫度：170 ℃；不分流；進(jìn)樣量：1 μL；柱溫升溫程序：初始溫度50 ℃，以8 ℃/min的速率升至120 ℃，再以30 ℃/min的速率升至280 ℃，保持2 min。

2.3 樣品測(cè)定

稱取原糧樣品5.00 g于40 mL具塞聚丙烯離心管中，加入10 mL乙醇超聲30min，-18 ℃下冷凍30 min后以4000 r/min的速率離心1 min，取上清液2 mL加入預(yù)裝有80 mg PSA和80 mg C18的10 mL具塞玻璃離心管中，渦旋30 s后以4000 r/min的速率離心1 min，取凈化液1 mL，加入2 mL飽和氯化鈉溶液和2 mL正己烷，渦旋30 s后以4000 r/min的速率離心1 min，取正己烷層用于氣相色譜測(cè)定。

稱取大豆油樣品5.00 g于40 mL具塞聚丙烯離心管中，加入20 mL乙醇劇烈搖振1 min，-18 ℃下冷凍30 min后以4000 r/min的速率離心1 min，取上清液2 mL加入預(yù)裝有80 mg PSA和80 mg C18的10 mL具塞玻璃離心管中，渦旋30 s后以4000 r/min的速率離心1 min，取凈化液1 mL，加入2 mL飽和氯化鈉溶液和2 mL正己烷渦旋離心，取正己烷層用于氣相色譜測(cè)定。

3 結(jié)果與討論

3.1 色譜條件的優(yōu)化

氯化苦的沸點(diǎn)較低，在常規(guī)毛細(xì)管色譜柱上保留時(shí)間較短，溶劑峰會(huì)影響其峰形且不易和干擾峰分離。對(duì)長(zhǎng)度為30m的不同內(nèi)徑、固定相和膜厚的常用色譜柱如：DB-1、DB-5、DB-624、DB-225等色譜柱進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)當(dāng)這幾種固定相膜厚超過1.00 μm時(shí)氯化苦均能和雜質(zhì)峰有效分離。其中DB-624和DB-225的固定相均含有極性基團(tuán)，最高使用溫度較低，高溫時(shí)柱流失會(huì)增大使基線變高；DB-1和DB-5色譜柱的使用溫度高，固定相不易流失，考慮到氯化苦有一定的極性，采用極性稍的DB-5能得到更好的峰形，所以確定采用DB-5色譜柱。

考察了溶劑對(duì)氯化苦峰形的影響。分別用正己烷、甲醇和乙醇將氯化苦配制成濃度為0.01 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)相同的色譜條件下，用正己烷作溶劑時(shí)氯化苦的峰形明顯優(yōu)于甲醇和乙醇(圖1)。

圖1 0.01 μg/mL的不同溶劑的氯化苦標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖

對(duì)氣相色譜進(jìn)樣口溫度進(jìn)行了優(yōu)化。發(fā)現(xiàn)當(dāng)進(jìn)樣口溫度高于190 ℃時(shí)氯化苦的響應(yīng)明顯下降，溫度越高響應(yīng)越低。當(dāng)進(jìn)樣口溫度升至250 ℃時(shí)0.01 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液面積比180 ℃時(shí)降低了約60 %，為了保證氣化效率，將進(jìn)樣口溫度設(shè)為170 ℃。

3.2 提取溶劑的選擇

常見的有機(jī)溶劑對(duì)氯化苦中均有較好的溶解能力。丙酮、乙酸乙酯、烷烴等對(duì)油脂的溶解性太強(qiáng)，若用作提取劑會(huì)將樣品中的脂肪溶出且很難除去。醇類溶劑對(duì)脂肪溶解力較弱且與糧谷基質(zhì)親和力好。分別用甲醇、乙醇和異丙醇對(duì)添加了氯化苦的空白糧谷樣品進(jìn)行提取實(shí)驗(yàn)，當(dāng)樣品質(zhì)量和溶劑體積比為2∶1時(shí)甲醇回收率為60%左右，乙醇和異丙醇回收率在80%以上。甲醇具有較高的毒性，對(duì)檢驗(yàn)人員健康和環(huán)境有較大的危害，異丙醇會(huì)溶解較多脂肪且和正己烷的互溶性好，不利于進(jìn)一步凈化和正己烷萃取，乙醇無毒且回收率好，因此選擇乙醇為提取溶劑。

分別用乙醇以1∶2、1∶3、1∶4、1∶5的比例對(duì)添加氯化苦的糧谷和大豆油樣品進(jìn)行提取，當(dāng)糧谷樣品質(zhì)量和溶劑體積比為1∶2時(shí)，大豆油在1∶4時(shí)回收率滿意，能達(dá)到80%以上。

3.3 凈化和反萃條件的優(yōu)化

糧谷樣品中的脂肪、游離脂肪酸和色素等脂溶性物質(zhì)和少量淀粉會(huì)隨氯化苦進(jìn)入乙醇提取液，若直接進(jìn)行測(cè)定，這些物質(zhì)會(huì)在進(jìn)樣口和色譜柱柱頭積累，影響儀器靈敏度和平行性，縮短色譜柱使用壽命。低溫時(shí)脂肪在乙醇中的溶解度低，冷凍后再離心可初步減少乙醇提取液中的脂肪含量。糧谷中農(nóng)殘測(cè)定時(shí)可用PSA固相萃取填料加入提取溶液的方式去除游離脂肪酸和部分色素，用C18除去部分脂肪[7]。以添加量0.1 mg/kg的大豆油為研究對(duì)象考察了C18的用量對(duì)除脂效果和回收率的影響，采用酯交換法對(duì)待測(cè)正己烷溶液進(jìn)行甲酯化[8]，以油酸甲酯峰面積的變化衡量除脂效果(平行測(cè)定3次)。當(dāng)乙醇提取液體積為2 mL時(shí)，以C18的加入量為橫坐標(biāo)，油酸甲酯面積百分比和回收率為縱坐標(biāo)作趨勢(shì)圖(見圖2)。結(jié)果表明：隨著C18的量的增加油酸甲酯峰面積明顯減少，當(dāng)C18的量超過50 mg后油酸甲酯的峰面積減少趨勢(shì)變緩，當(dāng)C18的量大于100 mg時(shí)油酸甲酯的峰面積不再有明顯變化且回收率略有降低，選擇C18加入量為80 mg。

圖2 油酸甲酯、回收率和C18加入量的關(guān)系圖

凈化后的乙醇提取液加入飽和氯化鈉溶液后用正己烷進(jìn)行反萃，淀粉等水溶性物質(zhì)滯留于水層，氯化鈉的鹽析作用促使目標(biāo)物進(jìn)入正己烷。以不同體積比的乙醇、飽和氯化鈉溶液、正己烷進(jìn)行萃取實(shí)驗(yàn)，考查反萃溶液比例對(duì)回收率的影響，結(jié)果顯示，以乙醇、氯化鈉飽和溶液、正己烷體積比為1∶2∶2時(shí)，提取1次后水相中基本無氯化苦殘留。

3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線

用丙酮將氯化苦標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋成10 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)使用液，再用正己烷作溶劑，配制成0.0010、0.0025、0.0050、0.0125、0.0250、0.1000、0.5000、1.0000 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液系列，按2.2的儀器條件測(cè)定。以氯化苦的濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。氯化苦在 0.0010～1.0000 μg/mL范圍內(nèi)線性良好，其回歸方程為y=361945.70x-3160.27，線性相關(guān)系數(shù)(r)為0.99893。

3.5 方法回收率和最低定量限

分別對(duì)大米、小麥、大豆、玉米、大豆油空白樣品進(jìn)行添加回收實(shí)驗(yàn)，添加水平為0.01 mg/kg、0.05mg/kg和0.5 mg/kg，每個(gè)水平平行測(cè)定6次，計(jì)算平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。結(jié)果表明：樣品中氯化苦平均回收率在74.9 %～98.9 %之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在0.5 %～3.2 %之間，具體數(shù)據(jù)見表1。添加濃度為0.01 mg/kg時(shí)信噪比大于10，可視為最低定量限。

表1 樣品中氯化苦的添加回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)(n=6)

4 結(jié)論

建立了食品中氯化苦的氣相色譜檢測(cè)方法，該方法簡(jiǎn)單、快捷、靈敏度高、重現(xiàn)性好，可用于糧谷、油料和植物油食品中氯化苦的檢測(cè)。