董 軍，洪 莉，陳令會(huì)，阮夢(mèng)雅

（臺(tái)州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江 臺(tái)州 317000）

甜櫻桃(Prunus aviumL.)屬于薔薇科(Rosaceae)落葉果樹(shù)，是一種重要的經(jīng)濟(jì)水果，營(yíng)養(yǎng)保健價(jià)值較高，素來(lái)享有“果中珍品”和“春果第一枝”的美譽(yù)，深受消費(fèi)者的喜愛(ài)，目前浙江等南方地區(qū)已成為甜櫻桃種植的熱門(mén)選地之一［1-2］；但是由于浙江等地夏季高溫高濕、冬季需冷量不足會(huì)嚴(yán)重制約甜櫻桃品種的選育工作，甜櫻桃對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境有著極其嚴(yán)格的要求，常規(guī)育種方式速度較慢，可采用組織培養(yǎng)技術(shù)有效解決［3-4］。

常規(guī)櫻桃實(shí)生苗的培育一般采用冬季沙藏的方法進(jìn)行繁殖，也可通過(guò)4 ℃冰箱冷藏處理打破休眠，一般情況下每年5—6月成熟采收甜櫻桃種子必須經(jīng)過(guò)90～100 d低溫層積才能打破種子休眠，保證種子出苗［3-5］。近年來(lái)，為保證種子的正常萌發(fā)，科研人員大多利用赤霉素(GA)等植物激素處理的方式來(lái)促進(jìn)種子萌發(fā)，并且可在當(dāng)年獲得第一代種苗，但是其中所用的激素種類、濃度及培養(yǎng)條件相差較大［6-9］。胚培養(yǎng)是人們利用植物體胚具有細(xì)胞全能性的特點(diǎn)來(lái)進(jìn)行人工離體培養(yǎng)的一種繁殖技術(shù)，胚培養(yǎng)能夠提高成苗率，縮短育種周期，進(jìn)一步加快育種進(jìn)程［10］。胚培養(yǎng)在早熟葡萄胚搶救中的應(yīng)用較為成熟［11］，在早熟的李子和杏子的幼胚培養(yǎng)中也有一定應(yīng)用［12］。

洪莉等［13］在甜櫻桃種子快速萌芽育苗試驗(yàn)研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)赤霉素(GA)對(duì)打破種子休眠、萌芽有較好的促進(jìn)效果，其效果遠(yuǎn)大于6-芐氨基阿腺嘌呤(6-BA)等植物激素。故本試驗(yàn)以甜櫻桃種子為試材，將傳統(tǒng)的低溫層積、赤霉素處理等技術(shù)與胚培養(yǎng)技術(shù)相結(jié)合，篩選出促進(jìn)甜櫻桃種子快速萌發(fā)及生長(zhǎng)的最佳條件，建立一套穩(wěn)定、高效的萌芽培養(yǎng)體系，旨在借助于現(xiàn)代生物育種技術(shù)提高育種效率。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料來(lái)源于臺(tái)州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院的早羅賓、布魯克斯、紅蜜等甜櫻桃種子，取其種子為外植體，取材時(shí)間為2022年5月。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 種子萌芽處理 開(kāi)始選擇轉(zhuǎn)色期至成熟期的甜櫻桃果實(shí)，去除果肉，選取顆粒飽滿圓潤(rùn)的甜櫻桃種子，用錘子敲掉外殼，放入滅菌的三角瓶?jī)?nèi)，再加入幾滴1%的聚山梨酯-80溶液，然后用0.1%的氯化汞溶液浸沒(méi)種子消毒，接種于1/2MS培養(yǎng)基上，接種過(guò)程中保證種子橫置半埋于培養(yǎng)基中。設(shè)置GA濃度分別為0、50、100、200、400 mg/L，6-BA濃度為2 mg/L，生長(zhǎng)素（IBA）濃度為1 mg/L，分別置于4 ℃透明冰箱（處理T1～T5）和24 ℃恒溫培養(yǎng)室（處理T6～T10）中進(jìn)行培養(yǎng)，每種處理10瓶，每瓶接種種子3～5個(gè)，處理3周后統(tǒng)計(jì)種子污染率、萌芽率、生長(zhǎng)情況等。

參照上述種子處理方法將去除果肉后的甜櫻桃種子置于室內(nèi)陰干，然后放入紗網(wǎng)袋內(nèi)，于4 ℃冰箱中儲(chǔ)存?zhèn)溆?。?chǔ)存5周后進(jìn)行種子萌芽率的比較，然后經(jīng)處理后3周調(diào)查萌芽率、生長(zhǎng)狀況等。

1.2.2 種苗增殖培養(yǎng) 首先將萌芽的種苗接種到不含激素的增殖培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代培養(yǎng)1～2次，以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，pH值為5.6。然后選取生長(zhǎng)一致、健壯良好的種苗接種到含有不同濃度6-BA的培養(yǎng)基中，設(shè)置增殖培養(yǎng)基T11～T15共5種處理方式，每個(gè)處理中生長(zhǎng)素（IBA）、萘乙酸(NAA)的濃度均為0.1 mg/L，6-BA濃度分別為0、0.25、0.50、0.75、1.00 mg/L。每 種 處 理 接 種 約10瓶，每瓶接種3～5株，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)記錄種苗的增殖系數(shù)、生長(zhǎng)狀況等。

1.2.3 種苗生根培養(yǎng) 將繼代苗轉(zhuǎn)接到不含激素的空白培養(yǎng)基中培養(yǎng)1～2代，以1/2MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，隨后選取生長(zhǎng)一致、健壯，株高1.5～3.0 cm的種苗接種到生根培養(yǎng)基，試驗(yàn)設(shè)置生根培養(yǎng)基種類T16～T20共5種處理方式，生長(zhǎng)素IBA的濃度分別為0、0.3、0.6、0.9、1.2 mg/L，每個(gè)處理中萘乙酸(NAA)的濃度均為0.1 mg/L。每種處理方式接種10瓶，每瓶接種3～5株，將接種的培養(yǎng)基放入培養(yǎng)室培養(yǎng)，并統(tǒng)計(jì)瓶苗的生根長(zhǎng)度、生根率以及生長(zhǎng)狀況等（表4）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同激素及溫度處理對(duì)種子萌芽率的影響

由表1可知，溫度和GA激素濃度對(duì)櫻桃種子萌發(fā)有較大影響。3周后，4 ℃條件下GA濃度為100 mg/L（T3）時(shí)種子萌芽率最高，達(dá)到73.33%；然后隨著GA濃度的增加，甜櫻桃種子的萌發(fā)率開(kāi)始下降。3周后，24 ℃條件下，GA濃度為400 mg/L（T10）時(shí)的種子萌芽率達(dá)到最高（68.67%）；增加GA濃度對(duì)甜櫻桃種子萌芽產(chǎn)生較大影響，在一定范圍內(nèi)提高GA濃度可以明顯提高種子萌芽率。T1和T6表明，在低溫或室溫條件下，僅添加6-BA、IBA處理對(duì)于甜櫻桃種子萌芽效果較差，添加合適范圍濃度的GA可以促進(jìn)甜櫻桃種子快速萌芽。隨后通過(guò)4～5周的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，4 ℃條件下，5周時(shí)T3、T4的櫻桃種子萌芽率超過(guò)90%，T5的種子萌芽率開(kāi)始下降，說(shuō)明GA濃度超過(guò)200 mg/L后對(duì)櫻桃種子的萌芽率無(wú)促進(jìn)作用，甚至?xí)种破浒l(fā)芽；24 ℃條件下，各處理的甜櫻桃種子萌芽率普遍不高，提高幅度較小，萌芽率基本穩(wěn)定在50%～70%，不同濃度的GA對(duì)種子萌芽率的促進(jìn)作用不顯著。4 ℃條件下的萌芽不存在子葉增生、易污染等問(wèn)題，綜合考慮，采用4 ℃+100 mg/L GA為最佳處理，可以促進(jìn)甜櫻桃種子快速萌芽，并且萌芽率最高可超過(guò)90%。

表1 不同濃度激素及溫度處理對(duì)種子萌芽的影響

2.2 激素處理對(duì)儲(chǔ)藏過(guò)久甜櫻桃種子萌芽率的影響

由表2可知，適當(dāng)濃度的激素處理可以提高儲(chǔ)藏時(shí)間過(guò)久的甜櫻桃種子萌芽率，4 ℃冰箱儲(chǔ)存5周后，甜櫻桃種子萌芽率呈現(xiàn)較低水平，品種間萌芽率同樣存在差異，布魯克斯的種子萌芽率整體高于紅蜜的。隨著GA濃度的提高，甜櫻桃種子萌芽率不斷提高，當(dāng)GA濃度為400 mg/L時(shí)，紅蜜和布魯克斯的種子萌芽率均達(dá)到最高，分別為7.12%和9.49%；但紅蜜、布魯克斯的種子萌芽率均不超過(guò)10.00%，大部分處理的種子都未出現(xiàn)明顯萌動(dòng)，少部分種皮破裂，還需要一段時(shí)間后種子才能正常萌發(fā)。綜上所述，儲(chǔ)藏時(shí)間太長(zhǎng)會(huì)對(duì)甜櫻桃種子萌芽率產(chǎn)生負(fù)面的影響，萌芽率普遍整體偏低；去除果肉后及時(shí)用適當(dāng)濃度的激素處理，可以有效提高甜櫻桃種子的萌芽率。

表2 激素處理對(duì)儲(chǔ)藏時(shí)間過(guò)久甜櫻桃種子萌芽率的影響

2.3 不同增殖培養(yǎng)基對(duì)甜櫻桃種苗生長(zhǎng)的影響

由表3可知，在一定濃度范圍內(nèi)提高6-BA濃度可以有效進(jìn)行增殖培養(yǎng)。種苗在T23～T25的培養(yǎng)基里增殖系數(shù)都超過(guò)2.00，其中T24的種苗增殖系數(shù)最高，達(dá)3.20，且該培養(yǎng)基內(nèi)的種苗生長(zhǎng)較快旺盛，葉片嫩綠；但當(dāng)6-BA濃度超過(guò)0.75 mg/L，櫻桃種苗的增殖開(kāi)始受到抑制，增值系數(shù)下降，導(dǎo)致種苗生長(zhǎng)不良，出現(xiàn)葉片皺縮，葉片脆硬甚至玻璃化的現(xiàn)象。綜合考慮，采用T24培養(yǎng)基，即MS+0.75 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA為甜櫻桃種苗生長(zhǎng)的最佳增殖培養(yǎng)基。

表3 不同增殖培養(yǎng)基對(duì)甜櫻桃種苗生長(zhǎng)的影響

2.4 不同生根培養(yǎng)基對(duì)甜櫻桃種苗生根的影響

由表4可知，在一定范圍內(nèi)隨著IBA濃度增加，甜櫻桃種苗生根率逐漸增大，根數(shù)增多，根長(zhǎng)增大。T29的甜櫻桃種苗生根率達(dá)到最高，為75.0%，根數(shù)也較多，且該培養(yǎng)基內(nèi)的種苗生根速度快，一般14 d左右有根長(zhǎng)出，根系生長(zhǎng)狀況良好，粗細(xì)適中，須根較多；T26培養(yǎng)基中甜櫻桃種苗的生根率最低，長(zhǎng)根速度慢甚至是不長(zhǎng)根的情況。由此可見(jiàn)，適當(dāng)濃度的IBA處理可以促進(jìn)甜櫻桃種苗的生根，當(dāng)IBA濃度為0.9 mg/L時(shí)，其種苗的生根系數(shù)達(dá)到最高，生長(zhǎng)態(tài)勢(shì)最好，綜合考慮，采用T29培養(yǎng)基，即1/2MS+0.9 mg/L IBA+0.1 mg/L NAA為最佳培養(yǎng)濃度。

表4 不同生根培養(yǎng)基對(duì)甜櫻桃種苗生根的影響

3 結(jié)論與討論

甜櫻桃胚培養(yǎng)是解決甜櫻桃胚萌芽率低的有效途徑，通過(guò)胚培養(yǎng)可以獲得大量的種苗來(lái)進(jìn)行嫁接擴(kuò)繁，比常規(guī)育種縮短1～2年的周期，胚培養(yǎng)作為一種育種手段可有效提高育種效率。

胚萌發(fā)是胚培養(yǎng)技術(shù)的第一步，胚萌發(fā)的最佳培養(yǎng)條件因材料而異。本試驗(yàn)表明，GA對(duì)甜櫻桃種子萌芽具有促進(jìn)作用，GA與6-BA、IBA配合使用可以有效打破種子休眠、促進(jìn)種子萌芽，其效果相較于單獨(dú)使用6-BA、IBA更加顯著；在4 ℃條件下，濃度為100 mg/L GA處理3周后的種子萌芽率達(dá)到73.33%，5周后的萌芽率可以超過(guò)90%。張琛等［14-17］用6-BA等激素進(jìn)行處理同樣獲得了很高的種子萌芽率，與本試驗(yàn)的研究結(jié)果不一致；本試驗(yàn)前期研究發(fā)現(xiàn)GA促進(jìn)甜櫻桃種子萌芽的效果更好，6-BA打破種子休眠、促進(jìn)萌芽的效果一般。趙艷華等［15］研究認(rèn)為無(wú)論在低溫還是常溫條件下均可以促進(jìn)甜櫻桃的胚萌發(fā)。本研究發(fā)現(xiàn)常溫條件可以促進(jìn)已萌芽的種子正常生長(zhǎng)，但是高濃度的GA會(huì)導(dǎo)致甜櫻桃種子出現(xiàn)子葉過(guò)快裂開(kāi)、子葉加厚增生等問(wèn)題，不利于種子萌芽后的生長(zhǎng)，需及時(shí)將種苗轉(zhuǎn)接到增殖培養(yǎng)基中。本研究還發(fā)現(xiàn)甜櫻桃種子儲(chǔ)存時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)對(duì)種子萌芽率產(chǎn)生不利影響，去除果肉后及時(shí)做保濕處理是保證甜櫻桃種子正常萌芽的首要條件。綜上認(rèn)為，甜櫻桃種子采收后及時(shí)采用適宜濃度GA處理，輔以低溫條件，可有效促進(jìn)甜櫻桃種子快速萌芽。

鄭瑋［18］研究認(rèn)為不同基因型甜櫻桃莖尖培養(yǎng)成活率差異較大，這與本文的不同品種的甜櫻桃種子在相同增殖培養(yǎng)基中的增殖系數(shù)存在差異的研究結(jié)果類似。本研究發(fā)現(xiàn)高濃度6-BA(≥1.0 mg/L)會(huì)導(dǎo)致植株出現(xiàn)葉片皺縮卷曲、葉片脆硬等現(xiàn)象；同樣6-BA濃度（≤0.5 mg/L）過(guò)小會(huì)導(dǎo)致植株存在生長(zhǎng)緩慢、增殖不足等問(wèn)題。與秦志華等［16-17］研究認(rèn)為的高濃度6-BA對(duì)甜櫻桃的增殖效果不利，甚至?xí)?dǎo)致植株玻璃化現(xiàn)象產(chǎn)生的結(jié)果相似。本研究發(fā)現(xiàn)MS+0.75 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA+0.1 mg/L NAA配置最佳，該處理的增殖效果較好，增殖系數(shù)達(dá)3.2，種苗健壯、生長(zhǎng)旺盛。一定范圍內(nèi)隨著IBA濃度的增加生根率逐漸提高。本研究生根培養(yǎng)基以1/2MS+0.9 mg/L IBA+0.1 mg/L NAA配 置 為 最佳，生根率達(dá)75.0%。一定范圍內(nèi)提高IBA濃度對(duì)于提高生根率有明顯的促進(jìn)作用；低濃度的IBA需要延長(zhǎng)生根培養(yǎng)時(shí)間才能保證正常的生根率，過(guò)長(zhǎng)的培養(yǎng)時(shí)間會(huì)導(dǎo)致種苗營(yíng)養(yǎng)不足，長(zhǎng)勢(shì)減弱，不利于后期煉苗移栽。

傳統(tǒng)方法認(rèn)為甜櫻桃等核果類種子需要一定時(shí)間的低溫來(lái)打破休眠才能保證其萌芽率，本試驗(yàn)通過(guò)“低溫+激素”處理來(lái)解決了種子休眠和萌芽率低的問(wèn)題，通過(guò)組織培養(yǎng)的方式對(duì)種苗進(jìn)行組織擴(kuò)增，提高了育種效率，對(duì)于縮短甜櫻桃新品種選育周期具有一定參考借鑒作用。