張樹交 查中明 武 陽

人類肝細胞癌(HCC)是最常見的惡性腫瘤之一，被公認為是全球所有與癌癥相關的死亡率的第二大誘因[1]。 HCC的死亡率高達95%，5年生存率極短，僅為6.9%[2]。與HCC發(fā)生率密切相關的危險因素包括乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)感染，吸煙，飲酒，飲食中攝入黃曲霉毒素，糖尿病和肥胖[3]。因此，至關重要的是發(fā)現(xiàn)影響化療藥物對HCC發(fā)揮作用的關鍵分子機制，以改善HCC患者的診斷和治療。Oct3/4是POU家族的轉錄因子，與八聚體序列基序結合以激活下游基因的表達[4]。Oct3/4的表達升高與多種癌癥相關，包括膀胱癌，非小細胞肺癌和肝細胞癌[5]。盡管已經進行了許多研究，但是Oct3/4在癌癥中的預后意義仍然存在爭議，并且Oct3/4與化療的關系尚未得到充分認識[6]?；诖?，本研究旨在探討CRISPR/CAS9靶向敲除Oct3/4基因后化療藥物索拉菲尼(Sorafenib)對肝癌細胞的作用影響。

1 材料與方法

1.1 材料

Li-7、HepG2、Huh7、BEL-7405、LX-2細胞均購自普諾賽公司(貨號：CL-0139、CL-0103、CL-0120、CL-0321、CL-0560)。Sorafenib購自深圳市益百順科技有限公司(貨號：Sorafenib)。pX459、，pX460-1、pX461-1均購自Addgene。Cas9慢病毒購自吉滿生物科技(上海)有限公司(貨號：GM-KC-100001)。Oct3/4和GAPDH抗體均購自abcam(貨號：ab124826、ab8245)，Total RNA Isolation Kit購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司(貨號：RC101-01)。逆轉錄反應試劑盒購自北京拜爾迪生物技術有限公司(貨號：DEM201-50T)。細胞凋亡檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司(貨號：C1062L)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)和加藥處理 Li-7、HepG2、Huh7、BEL-7405、LX-2均用RPMI-1640(補充10%胎牛血清和1%雙抗)維持，并放于含5%CO2的37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。索拉菲尼(Sorafenib)的處理終濃度為20 μM。

1.2.2 CRISPR/CAS9基因敲除與陽性細胞的篩選 Cas9慢病毒感染HepG2細胞，并使用2 μg/ml的嘌呤霉素進行篩選Cas9陽性細胞。使用CRISPR設計工具(http://crispr.mit.edu/)設計了靶向OCT3/4基因片段的單向導RNA(sgRNA)序列:5'- CCAAGCTCCTGAAGCAGAAG-3'。pX459(包含U6啟動子-sgRNA插入位點-sgRNA的3個載體)，pX460-1(包含U6啟動子-sgRNA插入位點-sgRNA支架和CAG啟動子-Cas9-T2A-嘌呤霉素N-乙?；D移酶基因-牛生長激素多腺苷酸化信號)和pX461-1(包含U6啟動子-sgRNA插入位點-sgRNA支架，以及CAG啟動子-嘌呤霉素N-乙?；D移酶(PuroR)-牛生長激素聚腺苷酸化信號)用于sgRNA的亞克隆。轉染后2周以低密度培養(yǎng)細胞，允許單個菌落(50個菌落)擴增，然后通過PCR測序進行選擇。

1.2.3 RNA抽取與實時熒光定量PCR 使用Total RNA Isolation Kit從細胞系中分離出總RNA。使用凝膠電泳和2000 Nanodrop分光光度計評估提取的RNA的質量和數量。使用隨機六聚體引物和MMLV逆轉錄酶對總RNA(1 μg)進行反轉錄。為了定量Oct3/4和GAPDH的轉錄水平，定量RT-PCR反應包含Premix Ex Taq預混液、2 μl cDNA模板和引物，在Rotor-Gene Q實時PCR循環(huán)儀中進行。擴增步驟為：95 ℃5 min，然后進行40個循環(huán)，分別是94 ℃30 s，57.5 ℃ 30 s和72 ℃30 s。使用2-△△ct計算相對表達量。

1.2.4 免疫印跡 使用哺乳動物蛋白提取試劑制備總蛋白樣品。使用二辛可寧酸蛋白質測定法測定蛋白質濃度。蛋白質樣品(每個樣品60 μg)通過8%SDS-PAGE分離并轉移到硝酸纖維素膜上。然后將膜用5%脫脂奶在37 ℃下封閉1 h，然后在4 ℃下與一抗連續(xù)孵育12 h，在4 ℃與相應的二抗連續(xù)孵育4 h。最后，使用增強的化學發(fā)光法觀察印跡并定量使用ChemiImager系統(tǒng)。 GAPDH用作內部參考。每個實驗至少重復3次，每個樣品重復3次。

1.2.5 細胞凋亡的檢測 根據制造商的說明書，使用膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(FITC)/碘化丙啶(PI)測定法評估HepG2細胞的凋亡。對于流式細胞術分析，用Sorafenib處理HepG2細胞，然后收集并用冷PBS溶液洗滌2次。將細胞懸浮于400 μl結合緩沖液中，加入5 μl Annexin V-FITC孵育15 min，隨后在37 ℃與10 μl PI孵育5 min。立即使用流式細胞儀和Cell Quest 4.0.2軟件分析染色的細胞。

1.2.6 DNA損傷的檢測 使用堿性單細胞凝膠電泳評估DNA損傷。Sorafenib處理后，將HepG2細胞在4 ℃的細胞裂解液(2.5 M NaCl，100 mM Na2EDTA，10 mM Tris，pH 10.0；1%Triton X-100和10%DMSO)中浸沒1 h，然后置于電泳溶液(300 mM NaOH，1 mM Na2EDTA，pH>13)在4 ℃下放置40 min。 電泳(25 V，～300 mA)并隨后用Tris-HCl(400 mM，pH 7.5)中和后，將細胞用PI(5 mg/l；Sigma-Aldrich)染色。 最后，使用CASP彗星分析1.2.2軟件在熒光顯微鏡下以40倍的放大倍率分析彗星圖像。 DNA的Olive尾矩(稱為尾巴中的DNA百分比)用于評估DNA損傷的程度。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 Oct3/4在人肝癌細胞和人肝正常細胞中的表達

實時熒光定量PCR發(fā)現(xiàn)Oct3/4在人肝癌細胞Li-7、HepG2、Huh7、BEL-7405中的mRNA表達水平顯著高于人肝正常細胞LX-2(P<0.05)，見圖1A。同時，Oct3/4在人肝癌細胞Li-7、HepG2、Huh7、BEL-7405中的蛋白表達水平顯著高于人肝正常細胞LX-2，見圖1B。

圖1 Oct3/4在人肝癌細胞和人肝正常細胞中的表達

2.2 CRISPR/CAS9技術構建Oct3/4敲除的肝癌細胞系

設計gRNA靶向Oct3/4第1個外顯子，見圖2A。使用CRISPR/CAS9對HepG2細胞進行基因編輯后，挑取嘌呤霉素篩選出的2個單克隆細胞株進行Oct3/4表達水平的檢測，發(fā)現(xiàn)1#號單克隆細胞株Oct3/4表達水平低于野生型WT，2#號單克隆細胞株沒有表達Oct3/4，見圖2B。提取1#號和2#號單克隆基因組后PCR進行測序，發(fā)現(xiàn)1#號基因組上的Oct3/4第1個外顯子只有1條染色體缺失了2個堿基，另一條染色體并未缺失；2#號基因組上的Oct3/4第1個外顯子2條染色體均存在不同程度的缺失，一條缺失2個堿基，另一條缺失4個堿基，見圖2C。

圖2 CRISPR/CAS9技術構建Oct3/4敲除的肝癌細胞系

2.3 Oct3/4敲除對化療藥物作用效果的影響

選取2#號細胞株作為后續(xù)Oct3/4 KO細胞株。使用索拉菲尼處理野生型HepG2細胞和Oct3/4 KO HepG2細胞，發(fā)現(xiàn)Oct3/4 KO細胞株的凋亡水平顯著上升(P<0.05)，DNA損傷水平顯著上升(P<0.05)，見圖3A和3B。

圖3 Oct3/4敲除對化療藥物作用效果的影響

3 討論

肝癌是世界范圍內的常見惡性腫瘤，每年造成700000多例死亡。HCC是原發(fā)性肝癌的主要類型[7]，在病因上與乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)感染、肝硬化、酒精中毒和非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)相關[8]。手術切除是肝癌患者的主要治療方法。然而，由于侵襲性生長和晚期癥狀表現(xiàn)，大多數HCC患者被診斷為晚期，不符合手術治療的條件[9]。晚期HCC患者的中位生存期約為9個月，而5年總生存率僅為10%，治療晚期HCC患者的選擇仍然非常有限，因此有必要進一步開發(fā)新的治療方案。

OCT3/4在胚胎干細胞，生殖細胞和各種人類癌癥中表達[10]。眾所周知，它是干細胞多能性和自我更新的主要調節(jié)劑[11]。越來越多的證據表明[12]，在包括前列腺癌、黑色素瘤和HCC在內的許多癌癥中，OCT3/4表達與腫瘤起始之間存在相關性。已有研究發(fā)現(xiàn)OCT3/4表達在HCC對藥物敏感性中起關鍵作用[13]。在本研究中，Oct3/4在人肝癌細胞Li-7、HepG2、Huh7、BEL-7405中的mRNA表達水平顯著高于人肝正常細胞LX-2(P<0.05)。同時，Oct3/4在人肝癌細胞Li-7、HepG2、Huh7、BEL-7405中的蛋白表達水平顯著高于人肝正常細胞LX-2。因此，Oct3/4可能是促進肝癌發(fā)生發(fā)展和耐藥性的關鍵因子。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)最早是在細菌和古細菌中發(fā)現(xiàn)的一種自適應免疫機制，可防止病毒DNA入侵[14]。在哺乳動物細胞中，CRISPR/Cas9系統(tǒng)已經過工程改造，可為特定基因敲除引入移碼突變[15]。由于容易編程和高基因編輯功效，CRISPR/Cas9系統(tǒng)已越來越多地用于研究各種生物系統(tǒng)中基因功能的喪失[16]。在本研究中，使用CRISPR/CAS9對HepG2細胞進行基因編輯后，挑取嘌呤霉素篩選出的2個單克隆細胞株進行Oct3/4表達水平的檢測，1#號單克隆細胞株Oct3/4表達水平低于野生型WT，2#號單克隆細胞株沒有表達Oct3/4。測序后發(fā)現(xiàn)1#號基因組上的Oct3/4第1個外顯子只有1條染色體缺失了2個堿基，另一條染色體并未缺失；2#號基因組上的Oct3/4第1個外顯子2條染色體均存在不同程度的缺失，一條缺失2個堿基，另一條缺失4個堿基。

索拉非尼靶向多種酪氨酸激酶，包括RAF，VEGFR和PDGFR，以抑制其下游增殖和生存信號通路[17]。先前的研究表明[18]，索拉非尼治療部分通過引起腫瘤細胞DNA損傷和凋亡來抑制腫瘤生長。索拉非尼因其可耐受的安全性和可控的副作用，在臨床上是一種有吸引力的分子靶向藥物。但是，索拉非尼治療HCC的臨床療效不高，只能將患者的平均總生存期延長3個月[19]。耐藥性的發(fā)展被認為是導致HCC患者索拉非尼治療失敗的主要障礙[20]。為了克服索拉非尼耐藥性，與其他抗癌藥物尤其是靶向與索拉非尼耐藥性有關的分子的藥物聯(lián)合開發(fā)，越來越受到重視。本研究使用Sorafenib處理野生型HepG2細胞和2# Oct3/4 KO HepG2細胞后，Oct3/4 KO細胞株的凋亡水平顯著上升(P<0.05)，DNA損傷水平顯著上升(P<0.05)。因此，Oct3/4基因可能是HCC耐索拉菲尼的原因之一。然而，索拉非尼耐藥的潛在機制很復雜，并且仍然難以捉摸。對索拉非尼耐藥性的分子基礎進行進一步的研究，可能為確定合理的聯(lián)合療法克服索拉非尼耐藥性的新靶標提供參考。

綜上所述，Oct3/4基因的敲除能夠顯著提高化療藥物Sorafenib促肝癌細胞凋亡和DNA損傷的作用。