張永紅，李存濤，高明敏，張玉紅

(鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院 皮膚科，河南 鄭州 450052)

瘢痕疙瘩是一種引起人體不適、機體功能受限以及心理障礙的皮膚疾病，瘢痕疙瘩內(nèi)部常表現(xiàn)出缺血低氧特征[1- 3]。目前已證明上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial- mesenchymal transition, EMT)是參與瘢痕疙瘩形成和發(fā)展的關(guān)鍵細胞學(xué)改變[2- 3]。二甲雙胍(metformin, MET)是一種可以抑制腫瘤和糖尿病中EMT的關(guān)鍵藥物[4- 5]；MET在體外也可抑制瘢痕疙瘩形成[6]。然而MET誘導(dǎo)抑制瘢痕疙瘩的完整機制仍然未知，因此本研究觀察MET對瘢痕疙瘩成纖維細胞(keloid fibroblasts，KFs)EMT的作用并探討其機制。

1 材料與方法

1.1 臨床樣本

瘢痕疙瘩標本及鄰近正常皮膚組織采集于我院皮膚科。4例瘢痕疙瘩患者均為黃種女性，年齡分別為26、31、32、35歲，瘢痕疙瘩位置均在耳垂。本研究中執(zhí)行的所有程序均經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準，所有受試者均簽署知情同意書。

KFs EMT的方法：在低氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)KFs以誘導(dǎo)EMT，KFs分為對照組和低氧組。用MET或其溶劑生理鹽水(生理鹽水組)低氧誘導(dǎo)KFs：在MET和低氧條件下用纖維母細胞生長因子受體4(fibroblast growth factor receptor 4，F(xiàn)GFR4)過表達載體(FGFR4overexpression vector，F(xiàn)GFR4- OE)或空載體(empty vector，EV)處理KFs或者在MET和低氧條件下用重組人(recombinant human，rh)巨噬細胞刺激1(macrophage stimulate 1，MST1)蛋白(rhMST1)處理KFs。

1.2 試劑與耗材

rhMST1(ab158921)購于美國Abcam公司。杜氏改良培養(yǎng)基(DMEM)和胎牛血清(10099- 141)購于美國Gibco公司。MET購于美國派普泰克公司。FGFR4- OE和空載體(empty vector, EV)購于上海GenePharma公司。Lipofectamine 2000試劑購于美國Invitrogen公司。細胞計數(shù)試劑盒- 8(CCK- 8)、PrimeScript RT反應(yīng)混合物逆轉(zhuǎn)錄RNA試劑盒、Trizol試劑盒、SYBR Premix Ex Taq試劑盒購于上海碧云天公司。蛋白酶抑制劑的RIPA 緩沖液、聚偏二氟乙烯膜購于美國Sigma 公司?？谷薋GFR4、E- 鈣黏蛋白、抗人波形蛋白、抗人MST1一抗購于美國Cell Signaling Technology公司。

1.3 細胞培養(yǎng)

原代人KFs根據(jù)文獻[6]報道進行分離。手術(shù)切除人瘢痕疙瘩組織的表皮和脂肪組織，只保留纖維組織的真皮層，隨后切成小塊。組織小塊在包含1倍膠原酶裂解緩沖液的DMEM中消化2 h，4 ℃下1 500 r·min-1離心5 min后，收集沉淀物并在補充有1%的青霉素-鏈霉素和15%胎牛血清的DMEM(37 ℃、5%CO2)中培養(yǎng)。

1.4 細胞活力檢測

CCK- 8實驗用于測量細胞活力。將KFs(每孔1×104個)接種到96孔板中。分別在常氧下(設(shè)為對照組)和低氧培養(yǎng)箱(37 ℃、1%O2、5%CO2、94%N2)中培養(yǎng)，低氧培養(yǎng)箱中細胞再分為生理鹽水組和MET組兩組。對照組細胞培養(yǎng)24 h，低氧培養(yǎng)的兩組分別加生理鹽水24 h或10 mmol·L-1MET處理細胞 24 h后，每孔加入10 μl CCK- 8，37 ℃孵育2 h。使用酶標儀在450 nm 處測量3組的吸光度值。

1.5 低氧培養(yǎng)條件下KFs細胞的處理與分組

根據(jù)制造商提供的說明，使用Lipofectamine 2000試劑將25 μmol·L-1的FGFR4- OE或25 μmol·L-1的EV轉(zhuǎn)入KFs細胞。將轉(zhuǎn)染的細胞培養(yǎng)24 h，并收集用于實時定量PCR(quantitative real- time PCR, qRT- PCR)和蛋白免疫印跡分析。

根據(jù)是否使用MET治療、聯(lián)合使用FGFR4過表達，或聯(lián)合使用rhMST1處理KFs，將KFs在低氧條件下進行實驗觀察。KFs在低氧條件下培養(yǎng)24 h，分為MET組、生理鹽水組、MET聯(lián)合FGFR4過表達載體轉(zhuǎn)染(MET+FGFR4- OE)組、MET聯(lián)合空載體(EV)(MET+EV)組、MET聯(lián)合rhMST1、MET+rhMST1組。MET在4 ℃下以10 mmol·L-1的濃度儲存。低氧培養(yǎng)環(huán)境下，MET組用10 mmol·L-1MET處理細胞24 h； 生理鹽水組用等體積的生理鹽水處理細胞24 h；MET+FGFR4- OE組在轉(zhuǎn)染25 μmol·L-1FGFR4- OE的同時用10 mol·L-1MET處理細胞24 h；MET+EV組在轉(zhuǎn)染25 μmol·L-1EV的同時用10 mmol·L-1MET處理細胞24 h，MET+rhMST1組用10 mmol·L-1MET和6 mmol·L-1rhMST1處理細胞24 h。

1.6 qRT- PCR

用Trizol試劑盒提取FGFR4- OE組和EV組KFs的總RNA。根據(jù)制造商提供的說明，使用PrimeScript RT反應(yīng)混合物逆轉(zhuǎn)錄RNA。隨后的定量PCR在7500 qPCR系統(tǒng)中使用SYBR Premix Ex Taq試劑進行。具體引物如下：FGFR4：正向5′- GTGCTGCTGCTCGTGGTCCCTA- 3′，反向3′- GCTTCGCGTAGGACGAAGGTGTGTC- 5′；Twist- 1：正向5′- CATTCTCAAGAGGTCGTGCCA- 3′，反向5′- CAGGCCAGTTTGATCCCAGTA- 3；E- 鈣黏蛋白：正向5′- GCCCTGCCAATCCCGATGAAA- 3′，反向5′- GGGGTCAGTATCAGCCGCT- 3′；波形蛋白：正向5′- GCTTCAGAGAGAGGAAGCCGAAAA- 3′，反向5′- CCGTGAGGTCAGGCTTGGAAA- 3′；β- 肌動蛋白：正向5′- ACCGAGCGCGGCTACA- 3′，反向3′- CAGCCGTGGCCATCTCTT- 5′。根據(jù)制造商的協(xié)議，qPCR在總體積20 μl的反應(yīng)混合物中進行，并按以下步驟進行擴增：95 ℃ 10 min，然后95 ℃ 15 s和60 ℃ 60 s循環(huán)40次。生物學(xué)重復(fù)為3。2-ΔΔCt方法用于計算，其中ΔCt=Ct目標基因-Ctβ- 肌動蛋白，ΔΔCt=ΔCt測定值-ΔCt校正值。

1.7 蛋白免疫印跡實驗

離心收集MET組、生理鹽水組、MET+FGFR4- OE組、MET+EV組、MET+rhMST1組的KFs，并用磷酸鹽緩沖液洗滌。細胞在含有蛋白酶抑制劑的RIPA緩沖液中裂解。裂解物通過十二烷基硫酸鈉- 聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，隨后經(jīng)電印跡轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上。在用5%脫脂牛奶封閉后，將膜與一抗在4 ℃下孵育過夜。一抗包括抗人FGFR4、E- 鈣黏蛋白、抗人波形蛋白、抗人MST1和β- 肌動蛋白。然后將印跡與二抗在室溫下孵育 2 h。每個實驗重復(fù)3次。使用ECL系統(tǒng)(GE Healthcare)和Luminescent Image Analyzer LAS3000(富士膠片)將目標蛋白條帶顯色。用Imgae J軟件進行定量分析。

1.8 遷移小室法檢測細胞的遷移

收集對照MET組、生理鹽水組、MET+FGFR4- OE組、MET+EV組、MET+rhMST1組細胞，調(diào)整細胞為105個·ml-1，加入到的transwell小室的上室。溫育12 h 后，使用細胞用無菌棉簽小心除去膜上表面的細胞。最后將已經(jīng)穿透侵入膜下表面的細胞用甲醇固定，用10%的Gimsa染色溶液染色15 min，并在顯微鏡下進行細胞計數(shù)。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理。計量數(shù)據(jù)以均值±標準差表示，正態(tài)分布且方差齊性的數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗；方差不齊的數(shù)據(jù)采用Dunnett’s T3檢驗。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用非參數(shù)檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 二甲雙胍抑制低氧誘導(dǎo)下KFs的增殖活性

檢測MET對低氧環(huán)境中KFs增殖活力的影響，結(jié)果(圖1)顯示，低氧誘導(dǎo)下KFs的增殖率明顯高于對照組(P<0.05)。而低氧下加入10 mmol·L-1的MET處理24 h后，與生理鹽水組相比，MET組KFs的增殖率明顯降低(P<0.05)。

a與對照組比，P<0.05； b 與生理鹽水組比，P<0.05

2.2 MET抑制低氧誘導(dǎo)下KFs的遷移

進一步評估MET對低氧環(huán)境中KFs遷移能力的影響，結(jié)果如圖2所示，低氧下加入10 mmol·L-1的MET處理24 h后，與生理鹽水組比較，MET組KFs的遷移數(shù)目明顯減少(P<0.05)。

a 與生理鹽水組比較，P<0.05

2.3 MET調(diào)控KFs中EMT標志物和FGFR4/MST1信號蛋白的表達

通過蛋白免疫印跡法分析MET對FGFR4、MST1和EMT標志物Twist- 1、E- 鈣黏蛋白、波形蛋白的表達，結(jié)果如圖3。與生理鹽水組比，MET組中FGFR4、MST1、Twist- 1、波形蛋白的表達量明顯降低，而E- 鈣黏蛋白的表達明顯增加(P<0.05)。

a 與生理鹽水組比較，P<0.05

2.4 FGFR4促進KFs中MST1的表達并誘導(dǎo)EMT

KFs細胞轉(zhuǎn)染FGFR4- OE或EV。與EV組比較，F(xiàn)GFR4- OE組FGFR4的mRNA和蛋白水平都增加(均P<0.05)，并且MST1的表達顯著增加(均P<0.05)。FGFR4- OE組遷移細胞數(shù)和EMT標志物Twist- 1、波形蛋白的表達量均明顯增高，且E- 鈣黏蛋白的表達明顯降低(均P<0.05)。見圖4。

a 與EV組比較，P<0.05

2.5 MET通過抑制FGFR4/MST1通路抑制KFs的EMT

進一步研究MET影響瘢痕疙瘩EMT調(diào)控的機制，結(jié)果顯示：與MET+EV組比，MET+FGFR4- OE組中細胞的遷移細胞數(shù)和EMT標志物Twist- 1、波形蛋白的mRNA表達量均明顯增高，且E- 鈣黏蛋白明顯降低(均P<0.05)；而與MET組比，MET+rhMST1組中遷移細胞數(shù)以及EMT標志物Twist- 1、波形蛋白的mRNA表達量都明顯增高，且E- 鈣黏蛋白明顯降低(均P<0.05)。見圖5。這表明MET可以抑制EMT，且其機制是通過抑制FGFR4/MST1通路抑制KFs的EMT。

a 與MET組比較，P<0.05； b 與MET+EV組比較，P<0.05

3 討 論

KFs是瘢痕疙瘩進展的主要誘導(dǎo)細胞。越來越多的研究認為KFs的EMT是誘導(dǎo)瘢痕疙瘩進展的關(guān)鍵因素[7]，因此我們以KFs為研究對象，著重探討KFs在經(jīng)MET處理后細胞增殖、遷移、EMT標志物的表達變化。根據(jù)本研究結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)：(1) 低氧誘導(dǎo)下KFs的增殖能力增加、遷移細胞數(shù)目增多，并且EMT標志物的表達明顯上調(diào)；(2) 抑制KFs中的FGFR4/MST1信號通路是MET抑制KFs增殖能力、遷移和EMT標志物表達的關(guān)鍵機制。本研究顯示MET可通過降低FGFR4和MST1來逆轉(zhuǎn)EMT，表明MET參與 FGFR4/MST1信號通路的失活以抑制瘢痕疙瘩的發(fā)展。

大量研究表明，F(xiàn)GFR4在促進上皮細胞的EMT和細胞遷移中起著關(guān)鍵作用[8- 9]。FGFR4通過EMT促進細胞纖維化[10- 11]。瘢痕疙瘩主要發(fā)生在外傷后，皮膚血管網(wǎng)絡(luò)被破壞，導(dǎo)致局部組織的低氧環(huán)境。此外，組織損傷引起的炎癥和修復(fù)過程中的高代謝狀態(tài)會顯著增加耗氧量并加劇低氧[12]。因為低氧微環(huán)境下，瘢痕疙瘩中的FGFR4往往上調(diào)，而且配體FGF23/FGFR4信號明顯促進心肌細胞的EMT和遷移能力[13- 14]。我們的研究結(jié)果證明，F(xiàn)GFR4過表達可以明顯促進KFs的EMT和遷移能力，而MET可以通過抑制FGFR4表達阻礙KFs的EMT和遷移。

MST1是哺乳動物腫瘤抑制通路的核心激酶，新發(fā)現(xiàn)的證據(jù)亦支持MST1在許多人類疾病如肝臟和腸道再生、先天免疫疾病[15- 16]中發(fā)揮微妙而復(fù)雜的作用。有研究表明MST1可調(diào)控細胞EMT[17- 18]。本研究也觀察到，人重組MST1蛋白能抑制KFs的遷移和EMT標志物Twist- 1、波形蛋白的表達，并促進E- 鈣黏蛋白的表達。多項研究表明，MST1是FGFR4特異性底物，而且MST1是FGFR4相關(guān)信號通路的關(guān)鍵下游效應(yīng)因子[19]。本研究在KFs中過表達了FGFR4，同樣觀察到MST1的蛋白表達被FGFR4顯著上調(diào)。不僅如此，低氧誘導(dǎo)下，在FGFR4表達增高的同時，MST1表達也增高。本研究中我們觀察到FGFR4/MST1信號軸對低氧誘導(dǎo)下KFs的EMT至關(guān)重要，因為過表達FGFR4不僅促進了MST1的表達，同時逆轉(zhuǎn)了MET對低氧條件下EMT的抑制作用，而人重組MST1蛋白明顯促進KFs的遷移和EMT標志物的表達。我們的研究結(jié)果表明FGFR4/MST1信號參與了瘢痕疙瘩的EMT。

MET已被證實還可以發(fā)揮抗瘢痕疙瘩的作用[6]。本研究同樣觀察到MET對KFs增殖和遷移的抑制作用，而且MET可以通過抑制FGFR4/MST1信號通路逆轉(zhuǎn)KFs中低氧誘導(dǎo)的EMT。

綜上所述，本研究表明,低氧環(huán)境通過激活FGFR4誘導(dǎo)的EMT促進了KFs的遷移,MET通過FGFR4/MST1信號通路抑制KFs中低氧誘導(dǎo)的EMT?；谏鲜鲅芯繑?shù)據(jù)，我們提出FGFR4/MST1通路參與低氧誘導(dǎo)的瘢痕疙瘩EMT，因此MET可能是治療瘢痕疙瘩的潛在藥物，而且FGFR4/MST1信號通路是一種潛在的瘢痕疙瘩治療靶點。