楊小依，張舒純，張昕，李景云，池霞，童梅玲

(1.南京醫(yī)科大學 兒科學院，江蘇 南京 210029； 2.南京醫(yī)科大學附屬婦產(chǎn)醫(yī)院 兒童保健科，江蘇 南京 210004； 3.常州市兒童醫(yī)院，江蘇 常州 213003； 4.南京醫(yī)科大學附屬婦產(chǎn)醫(yī)院 醫(yī)學研究中心，江蘇 南京 210004)

雙酚A(bisphenol A，BPA)，作為高分子合成材料的重要原料之一，廣泛應(yīng)用于黏合劑、罐頭內(nèi)壁、人造牙齒、食品包裝材料等日常生活用品和工業(yè)用品的生產(chǎn)中[1]。目前，在水體、土壤、室內(nèi)灰塵等環(huán)境介質(zhì)中經(jīng)?？蓹z測到BPA[2]。BPA可以通過消化道、呼吸道和皮膚等多種途徑進入人體[3]，對人類健康產(chǎn)生危害。研究發(fā)現(xiàn)，BPA能通過胎盤屏障進入胎兒體內(nèi)并且在胎兒體內(nèi)存在清除延遲現(xiàn)象，導致子代兒童出現(xiàn)對比敏感度降低等視覺發(fā)育異常表現(xiàn)[4- 5]，但目前有關(guān)孕期BPA暴露對子代視覺發(fā)育影響的作用機制尚無深入報道。

斑馬魚因具有產(chǎn)卵量大、發(fā)育迅速、視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)與人類相似、基因組與人類同源性高等特點[6]，被廣泛應(yīng)用于毒理學、視覺發(fā)育等的研究中[7]。本研究在前期實驗的基礎(chǔ)上，以斑馬魚為動物模型，通過構(gòu)建胚胎期BPA暴露的斑馬魚模型，研究BPA暴露后子代斑馬魚眼部形態(tài)及視覺行為學變化，系統(tǒng)探索胚胎期BPA暴露對斑馬魚眼結(jié)構(gòu)及視覺功能的影響，為環(huán)境污染物暴露致子代視覺損害提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

研究所用成年野生型TU品系斑馬魚購自南京堯舜禹生物有限公司，并根據(jù)斑馬魚養(yǎng)殖指南雌雄分開飼養(yǎng)于通信作者所在實驗室斑馬魚自動化養(yǎng)殖系統(tǒng)：水溫為(28.5±0.5) ℃；pH值為6.8～7.5；光周期為14 h光照∶10 h黑暗，每天早晚各喂食1次新鮮孵化的豐年蝦。

1.2 主要實驗試劑與儀器

BPA(CAS No.80- 05- 7, 純度99.9%)、DMSO(CAS No.67- 68- 5)均購自Sigma- Aldrich公司，斑馬魚自動化養(yǎng)殖系統(tǒng)購自上海海圣生物實驗設(shè)備有限公司，恒溫培養(yǎng)箱購自上海愛朗儀器有限公司，體視顯微鏡購自徠卡顯微系統(tǒng)公司，VisioBox和ZebraBox斑馬魚行為學分析系統(tǒng)購自Viewpoint公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 斑馬魚胚胎收集及染毒

實驗前一天下午喂食后，將成年雌雄魚按1∶2配對放入配種缸，隔板將雌雄魚分隔，第2天早上開燈后1 h內(nèi)抽去隔板使雌雄魚接觸交配，完成交配后收集胚胎。

于受精后4 h(4 hour post- fertilization，4 hpf)去除發(fā)育停滯的胚胎，隨機選取80枚發(fā)育良好的胚胎，分別放置在含10 ml不同暴露濃度BPA溶液的培養(yǎng)皿中，同時設(shè)置溶劑對照組(0.1%DMSO)。結(jié)合前期實驗測定的BPA暴露對斑馬魚半致死濃度LD50為58.37 μmol·L-1(數(shù)據(jù)未發(fā)表)及相關(guān)文獻，本實驗設(shè)置BPA暴露濃度分別為0、0.1、1、10、50 μmol·L-1，暴露時間為4～144 hpf。為保證BPA暴露濃度的穩(wěn)定，每隔24 h更換新鮮配置的染毒液。

1.3.2 胚胎期 BPA暴露后子代斑馬魚的眼部大體形態(tài)變化

每天上午11:00通過體視顯微鏡觀察斑馬魚不同階段的發(fā)育情況。隨機選取不同暴露組的96 hpf斑馬魚幼魚各6條，在體視顯微鏡下拍攝并記錄幼魚俯視圖和側(cè)視圖，利用Image J軟件測量眼長、總體長和眼面積。

1.3.3 HE染色觀察胚胎期BPA暴露后子代斑馬魚視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)的變化

隨機選取不同暴露組的96 hpf斑馬魚幼魚各6條，使用4%多聚甲醛過夜固定，經(jīng)梯度酒精脫水、二甲苯透明處理后浸蠟包埋。蠟塊經(jīng)常規(guī)切片、蘇木精伊紅染，封片后于顯微鏡下觀察。

1.3.4 胚胎期BPA暴露后子代斑馬魚的視覺行為學分析

1.3.4.1 斑馬魚自主擺尾能力 在24 hpf，隨機選取各組胚胎20枚，在體視顯微鏡下觀察記錄各組斑馬魚胚胎擺尾次數(shù)，每次記錄2 min，折算成每1 min擺尾頻次，重復3次實驗。

1.3.4.2 斑馬魚眼動反應(yīng)(optokinetic response，OKR) 在96、120 hpf，使用VisioBox儀器檢測幼魚的眼動反應(yīng)。隨機選取不同組的斑馬魚幼魚，每組10條，分次放入有3%甲基纖維素的35 mm培養(yǎng)皿中，使其背部向上，以固定空間頻率(0.06 cycles·deg-1)、時間頻率(16°·s-1)順時針及逆時針各30 s的光柵刺激，記錄和分析其眼動頻率，重復3次實驗。

1.3.4.3 斑馬魚自主運動水平及光驚嚇反應(yīng) 在120、144 hpf，隨機選取在不同組的幼魚，每組8條，放置于96孔板中，每孔1條幼魚并含200 μl 斑馬魚培養(yǎng)液，將96 孔板放入ZebraBox觀察箱。首先進行幼魚自主運動水平的檢測，檢測時長為60 min，記錄每條幼魚的運動軌跡、運動距離等數(shù)據(jù)；然后進行明暗周期交替的光驚嚇反應(yīng)檢測。先進行10 min的暗適應(yīng)，適應(yīng)完畢后設(shè)置光暗周期黑暗∶光照為10 min∶10 min，循環(huán)3次，以1 min為單位收集運動軌跡、運動距離等數(shù)據(jù)，測定時長共60 min，重復3次實驗。

1.4 統(tǒng)計學處理

使用GraphPad Prism 9.0.1進行統(tǒng)計分析。不同實驗組間采用單因素方差分析(One- way ANOVA)，以Dunnett法進行組間兩兩比較，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。所有圖中顯示的誤差條代表平均值的標準誤差。

2 結(jié) 果

2.1 胚胎期BPA暴露后子代斑馬魚眼結(jié)構(gòu)情況

隨著BPA暴露時間的延長，各組斑馬魚胚胎均開始孵化、存活。在96 hpf，斑馬魚胚胎基本孵化完全，在體視顯微鏡下檢測不同組斑馬魚幼魚眼長、體長、眼面積，結(jié)果顯示：BPA暴露組幼魚的眼面積減小，并隨著BPA暴露濃度的升高，眼面積的減小愈發(fā)顯著，尤其是50 μmol·L-1BPA暴露組與對照組相比眼面積顯著下降21.81%(P<0.01)(圖1A、B)。進一步計算幼魚眼長與身長比例發(fā)現(xiàn)，50 μmol·L-1BPA暴露組中幼魚的眼長與體長比例較對照組也明顯下降，差異具有統(tǒng)計學意義(圖1B)。

接著，本研究通過HE染色觀察BPA暴露對幼魚96 hpf視網(wǎng)膜分層結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)果顯示：對照組中幼魚視網(wǎng)膜分層清晰、各層細胞排列規(guī)整，從內(nèi)到外依次可見神經(jīng)節(jié)細胞層、雙極細胞層、感光細胞層；0、0.1 μmol·L-1BPA暴露組幼魚的視網(wǎng)膜亦有較明顯的分層結(jié)構(gòu)，而1 μmol·L-1BPA暴露組中幼魚視網(wǎng)膜分層結(jié)構(gòu)開始出現(xiàn)紊亂，且隨著BPA暴露濃度增加，紊亂越來越明顯，尤其是10、50 μmol·L-1BPA暴露組幼魚的視網(wǎng)膜各層逐漸分層不清，其中尤其是感光細胞層細胞數(shù)目減少、排列紊亂(圖1C)。

圖1 BPA暴露對子代斑馬魚眼結(jié)構(gòu)的影響 A.斑馬魚幼魚大體形態(tài)； B.斑馬魚眼面積、眼長與體長比，a 與對照組相比，P<0.01； C.96 hpf幼魚的視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)

2.2 胚胎期BPA暴露后子代斑馬魚的行為表現(xiàn)

2.2.1 胚胎期BPA暴露后子代斑馬魚自主擺尾運動

發(fā)育至24 hpf時，神經(jīng)發(fā)育良好的斑馬魚胚胎可出現(xiàn)規(guī)律的尾部自主擺動。檢測各組胚胎的自主擺尾活動，結(jié)果顯示，對照組胚胎擺尾頻次約為6.650次·min-1，而BPA暴露組總體自主擺尾頻次隨著BPA濃度升高呈現(xiàn)出下降趨勢，其中10、50 μmol·L-1BPA暴露組斑馬魚胚胎自主擺尾頻率分別減少18.05%(P<0.01)、35.71%(P<0.001)，差異具有統(tǒng)計學意義(圖2)。

圖2 24 hpf斑馬魚胚胎自主擺尾頻次 a 與對照組相比，P<0.001； b 與對照組相比，P<0.01

2.2.2 胚胎期BPA暴露后子代斑馬魚視動反應(yīng)

發(fā)育至96 hpf時，斑馬魚已具備基本的視覺功能，可以通過OKR檢測其視覺功能的情況[8]。結(jié)果顯示，隨著BPA暴露濃度的升高，96 hpf幼魚的眼動頻率和幅度均呈現(xiàn)降低趨勢，其中10、50 μmol·L-1BPA暴露組幼魚的眼動幅度較對照組明顯減小，眼動頻率分別減少7.1%(P<0.001)和4.2%(P<0.001)(圖3A)。當幼魚發(fā)育至120 hpf時，BPA暴露組斑馬魚也有相同眼動頻率和幅度降低的趨勢，在10、50 μmol·L-1BPA暴露組中差異顯著(圖3B)。

圖3 BPA暴露對子代斑馬魚OKR的影響 A. 96 hpf斑馬魚幼魚眼動頻率； B.120 hpf斑馬魚幼魚眼動頻率； a 與對照組相比，P<0.001

2.2.3 胚胎期BPA暴露后子代斑馬魚運動軌跡

當幼魚發(fā)育至120、144 hpf時，本研究利用斑馬魚行為學分析系統(tǒng)檢測其自主運動和光驚嚇運動的能力。首先，行為學測試記錄幼魚運動軌跡結(jié)果顯示，120、144 hpf運動軌跡呈現(xiàn)相同的趨勢：隨著BPA暴露濃度升高，其運動軌跡變得雜亂無章，逐漸失去貼壁運動的特性和正常的明暗周期運動節(jié)律(圖4A)。

接著，自主運動能力檢測顯示，120 hpf時，溶劑對照組與空白對照組幼魚游動距離無明顯差異，而隨著BPA暴露濃度升高，幼魚的游動距離顯著縮短。相較于120 hpf，144 hpf幼魚的總游動距離均有所提升，但是10、50 μmol·L-1BPA暴露組減少40.93%(P<0.001)、46.48%(P<0.001)(圖4B)。

斑馬魚在明暗交替的刺激時會表現(xiàn)出正常的運動節(jié)律，即在光照下斑馬魚表現(xiàn)出低速運動，在黑暗環(huán)境中其運動速度較快。因此，本研究還設(shè)計了規(guī)律出現(xiàn)的明暗交替刺激，以此來評價幼魚的光驚嚇能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，發(fā)育至120 hpf，1、10、50 μmol·L-1BPA暴露組的幼魚在黑暗刺激下運動總距離縮短，10、50 μmol·L-1BPA暴露組暗周期運動距離對比明周期未見較大增加。而發(fā)育至144 hpf，僅10、50 μmol·L-1BPA暴露組的斑馬魚明暗周期下運動距離與對照組相比有顯著縮短(圖4C)。

圖4 BPA暴露對子代斑馬魚運動行為的影響 A.120 hpf幼魚1 min游動軌跡； B.120及144 hpf幼魚自主運動總距離； C.120及144 hpf幼魚光暗刺激下運動距離； a 與對照組相比，P<0.001； b 與對照組相比，P<0.01； c 與對照組相比，P<0.05

3 討 論

近年來，越來越多的研究聚焦于環(huán)境污染物所產(chǎn)生的視覺毒性。Huang等[9]發(fā)現(xiàn)，多環(huán)芳烴暴露會造成細胞凋亡和使細胞增殖減少，從而導致視覺系統(tǒng)發(fā)育缺陷；Chen等[10]發(fā)現(xiàn)，多溴聯(lián)苯醚可以通過干擾眼睛發(fā)育相關(guān)基因的表達，損傷視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)，從而導致視覺功能障礙。BPA作為雙酚類化合物中最常見的環(huán)境污染物，導致子代兒童的紅綠色覺異常[5]，動物實驗也證實胚胎期低濃度BPA暴露影響日本青鳉正常的眼色素沉著[11]，提示BPA暴露對子代視覺發(fā)育造成了一定的影響，然而其具體作用機制需要進一步探索。斑馬魚是一種廣泛用于眼發(fā)育研究的模式動物，其視覺系統(tǒng)較為發(fā)達，且視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)與人類相似[12]。因此，本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，以斑馬魚為模式動物，通過構(gòu)建胚胎期BPA暴露的斑馬魚模型來闡明胚胎期BPA暴露對子代斑馬魚眼結(jié)構(gòu)和視覺功能的影響，從而為環(huán)境污染物暴露致子代視覺損害提供理論依據(jù)。

首先本研究測量了胚胎期BPA暴露后的斑馬魚幼魚眼面積、眼長、體長，結(jié)果表明，50 μmol·L-1BPA暴露后斑馬魚眼面積明顯減小。有研究發(fā)現(xiàn)，斑馬魚胚胎暴露于四溴雙酚A會導致受精后第5天的仔魚眼睛大小顯著減小[13]，提示胚胎期高濃度BPA暴露將影響斑馬魚眼外觀形態(tài)正常發(fā)育。我們通過眼部組織切片及HE染色來評估胚胎期BPA暴露對斑馬魚視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，1、10、50 μmol·L-1組中幼魚視網(wǎng)膜各層逐漸分層不清，尤其是感光細胞層細胞數(shù)目減少、排列紊亂。以上結(jié)果表明，盡管較低濃度的BPA暴露后斑馬魚幼魚眼睛大體外觀未出現(xiàn)明顯改變，但是其視網(wǎng)膜的結(jié)構(gòu)出現(xiàn)了紊亂，細胞形態(tài)不規(guī)則，提示胚胎期較低濃度BPA仍可對子代眼結(jié)構(gòu)的發(fā)育產(chǎn)生影響。

為進一步探究胚胎期BPA暴露對斑馬魚視覺功能的影響，本研究通過不同時期的行為學實驗評估胚胎期BPA暴露后斑馬魚的視覺行為。研究資料表明，斑馬魚擁有明暗感知、光驚嚇反應(yīng)、趨光反應(yīng)的前提是具備完善的視覺功能[14- 15]，因此行為學實驗可以被認為是評估視覺功能的一種方法[16]。24 hpf時，斑馬魚神經(jīng)開始發(fā)育，此時視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞出現(xiàn)。隨后，神經(jīng)節(jié)細胞的突觸逐漸延伸，發(fā)育至48 hpf時到達視頂蓋。74 hpf時，斑馬魚與視覺相關(guān)的視網(wǎng)膜細胞基本發(fā)育成熟，并初具功能[8,17]。隨著發(fā)育時間的延長，視網(wǎng)膜功能在144 hpf基本成熟。因此，本研究選取了不同的時間點進行視覺行為的檢測。24 hpf的自主擺尾能力檢測發(fā)現(xiàn)，BPA暴露濃度為10 μmol·L-1時斑馬魚幼魚的自主擺尾能力已受到影響，這表明，即使在胚胎期較低濃度BPA暴露下，斑馬魚的神經(jīng)發(fā)育仍然受到傷害。96、120 hpf時，OKR檢測發(fā)現(xiàn)BPA暴露后斑馬魚幼魚的眼動反應(yīng)能力逐漸減弱。相似的是，Baumann等[13]也發(fā)現(xiàn)，斑馬魚胚胎暴露于TBBPA 后，受精后第5天的斑馬魚幼魚OKR呈現(xiàn)出劑量依賴性減弱。本研究又進一步通過120、144 hpf 視覺運動反應(yīng)檢測發(fā)現(xiàn)，從較低濃度BPA暴露起，斑馬魚幼魚的運動能力和明暗感知能力受損，表現(xiàn)為運動能力下降及暗周期運動能力無明顯提高。Fraser等[18]亦發(fā)現(xiàn)BPA暴露后將導致斑馬魚幼魚光暗循環(huán)運動出現(xiàn)改變。有趣的是，在0.1、1 μmol·L-1BPA暴露下發(fā)育至144 hpf 與同濃度暴露的120 hpf斑馬魚幼魚相比，其運動水平及對光照的反應(yīng)均有所恢復。而既往研究也已證實斑馬魚視網(wǎng)膜存在強大的損傷后再生能力[19]，其相關(guān)機制有待進一步研究。胚胎期BPA暴露后子代斑馬魚不同發(fā)育時期的視覺行為學改變均表明，胚胎期低濃度BPA已影響斑馬魚幼魚的正常視覺行為，提示BPA在斑馬魚胚胎發(fā)育早期已對視網(wǎng)膜的發(fā)育產(chǎn)生了影響，從而導致異常的視覺功能。

綜上所述，本研究的結(jié)果證實，胚胎期BPA暴露可造成斑馬魚視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)出現(xiàn)改變，導致視網(wǎng)膜分層結(jié)構(gòu)紊亂，引起異常視覺行為，提示環(huán)境污染物可對子代視覺的發(fā)育造成一定的影響，這為環(huán)境污染物暴露致子代視覺損害提供了理論依據(jù)，也提示了兒童的眼保健要從母親孕期保健開始，避免接觸環(huán)境污染物，為后代的眼健康打下良好的基礎(chǔ)。