林鎮(zhèn)躍，陳建明*

(1.閩江學院海洋研究院, 福建 福州 350108； 2.閩江學院福州市海洋生態(tài)養(yǎng)殖行業(yè)技術(shù)創(chuàng)新中心, 福建 福州 350108)

“共生”和“鈣化”一直是珊瑚生物生態(tài)學研究中兩個最核心的問題。珊瑚組織由內(nèi)胚層和外胚層組成：蟲黃藻共生于內(nèi)胚層，而外胚層主要涉及與外部環(huán)境的化合物交換和珊瑚骨架的形成[1]。蟲黃藻是由珊瑚胃真皮細胞通過吞噬作用獲得的，從而形成一個稱為“共生體”，由細胞內(nèi)膜及囊泡封閉的結(jié)構(gòu)，宿主的共生體膜與藻類的細胞膜逐漸成熟并融合形成了一個共生體膜復合體[2]。目前我們認為，共生體膜主要起源于宿主質(zhì)膜，既可以防止宿主溶酶體對內(nèi)共生蟲黃藻的消化，又可以通過它與蟲黃藻相互作用。國內(nèi)尚缺少關(guān)于共生珊瑚細胞微結(jié)構(gòu)和功能的研究工作，但了解珊瑚細胞生物學方面的知識對于預測珊瑚應對環(huán)境變化的反應至關(guān)重要。

石珊瑚如何以文石的形式沉積碳酸鈣骨架，近一個世紀以來一直被廣泛討論，但沒有形成明確的共識。有兩種普遍的假說：地球化學家通常主張一個以物理化學為主的機制，是基于珊瑚鈣化部位內(nèi)部的化學控制；而生物學家則主張另一種由生物控制的機制，認為珊瑚通過分泌骨骼有機基質(zhì)(Skeletal Organic Matrix， SOM)調(diào)節(jié)或者控制礦物質(zhì)的沉積過程。支持第一種假說的依據(jù)有：提高鈣化位點的海水pH，或者提高鈣離子和無機碳濃度，可以產(chǎn)生適合礦化晶體形成的穩(wěn)態(tài)條件[3]。支撐第二種假說的依據(jù)認為：SOM特別是富酸蛋白誘導粒子附著和晶體生長，并聚集形成有序的文石結(jié)構(gòu)，即使在pH較低、不利于文石沉積的條件下，石珊瑚仍可以維持鈣化。本研究通過掃描電鏡研究叢生盔形珊瑚(Galaxeafascicularis)骨骼的微觀結(jié)構(gòu)，并利用電感耦合等離子體質(zhì)譜(Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry, ICP-MS)分析珊瑚骨骼的微量元素形態(tài)，這些數(shù)據(jù)加深了對珊瑚骨架的空間結(jié)構(gòu)和成分組成的了解，有助于闡明珊瑚的礦化機制。

1 材料和方法

1.1 材料

叢生盔形珊瑚樣品于2015年6—8月采集自海南文昌海域，部分采集的珊瑚養(yǎng)殖于實驗室的循環(huán)海水水族箱條件下(25 ℃,平均pH 8.15，鹽度35)。珊瑚養(yǎng)殖使用hqi-10000 K金屬鹵化物燈提供有效光輻射強度(PAR)為180 μmol/(m2·s-1)，光周期是L∶D=12 h∶12 h。

1.2 方法

1.2.1 珊瑚共生體的觀察 用剪刀取新鮮的珊瑚觸手組織，經(jīng)DAPI染色后置于TCS SP5 II型激光共聚焦顯微鏡(Leica，德國)觀察珊瑚與共生蟲黃藻。珊瑚觸手組織經(jīng)聚合樹脂包埋切片，利用JEM-1230型透射電鏡(JEOL，日本)觀察珊瑚與共生蟲黃藻的亞細胞結(jié)構(gòu)。將組織塊切成小于1 mm3，用2.5%(質(zhì)量分數(shù))的戊二醛和1.0%(質(zhì)量分數(shù))的鍔酸固定。后用10%～90%(體積分數(shù))的乙醇逐級脫水，每級30 min，最后用無水乙醇脫水3次，樣品放置于干燥器中脫水。再先用樹脂∶酒精=1∶3 (體積比，下同)滲透6 h，后用樹脂∶酒精=3∶1滲透過夜，最后純樹脂包埋3 h并置于60 ℃烘箱中1～2 d。超薄切片后鏡檢。

1.2.2 珊瑚骨骼形態(tài)的觀察 珊瑚觸手組織和骨骼[圖1(a)、(b)]先用蒸餾水涮洗去除殘余有機質(zhì)，去除表面吸附物。將切好的珊瑚觸手組織和骨骼樣品經(jīng)E-1010型離子濺射儀(Hitachi，日本)在高真空模式下噴金90 s后于30 kV高壓進行FEI Quanta 450型掃描電鏡(FEG，美國)觀察珊瑚骨骼樣品表面和內(nèi)部微結(jié)構(gòu)。

1.2.3 珊瑚骨骼元素成分分析 取部分珊瑚骨骼進行粉碎，過100 目篩后。稱取約0.3 g樣品，將樣品置于消解管中，分別加入5 cm365%(體積分數(shù))的濃硝酸和2 cm330%(體積分數(shù))的H2O2，然后置于微波消解儀中進行消解。消解后，放入電加熱器中于160 ℃進行趕酸，再轉(zhuǎn)移至10 cm3容量瓶中，并用2%(體積分數(shù))的硝酸溶液定容。之后放入ICP-MS (Thermo Fisher，美國)中測定元素含量，并選用相關(guān)內(nèi)標元素做標準曲線和定量計算。以上實驗均在自然資源部第三海洋研究所科學儀器共享平臺完成。

2 結(jié)果與討論

2.1 叢生盔形珊瑚共生體的顯微結(jié)構(gòu)

通過激光共聚焦顯微鏡觀察珊瑚觸手息肉組織，共生蟲黃藻主要分布于珊瑚的內(nèi)、外表皮細胞，有利于充分利用光源，估算細胞密度約為1×104～3×104蟲黃藻細胞/mm2(圖1)。通過透射電鏡觀察珊瑚觸手息肉組織，外胚層上皮細胞含有大量橫紋肌細胞及刺細胞。刺細胞大小約為2 μm×3 μm，內(nèi)含有不同長度、細長盤卷的刺絲。此外，還有分泌細胞(腺細胞)及間細胞。分泌細胞暗色不透明、密度均勻，含細胞核并有細小的微纖結(jié)構(gòu)。胞內(nèi)含有大量的分泌顆粒，有的分泌出囊泡，容易識別。間細胞是一些小型、圓形的細胞，單獨或成堆分布，并有較大的細胞核，主要分布于分泌細胞中間，或者間細胞經(jīng)過分化形成分泌細胞(圖2)。

圖1 叢生盔形珊瑚共生體與骨骼的形態(tài)結(jié)構(gòu)Fig. 1 Morphological structures of coral symbiot and skeletons of G. fascicularis(a)為叢生盔形珊瑚單體及觸手照片；(b)為骨骼形態(tài)照片；(c)為顯微鏡觀察的珊瑚組織；(d)為激光共聚焦顯微鏡觀察的珊瑚組織，藍色為DAPI染色，紅色為蟲黃藻自發(fā)熒光。

圖2 透射電鏡觀察的珊瑚組織及細胞結(jié)構(gòu)Fig. 2 Coral tissue and cell structures under TEM(a)、(b)為外皮肌細胞及刺絲囊細胞，(c)、(d)為黏液分泌細胞及單核的黏液變細胞，(e)、(f)為內(nèi)共生蟲黃藻細胞的亞顯微結(jié)構(gòu)。

一般情況下，不在分裂狀態(tài)的蟲黃藻呈球狀被珊瑚宿主的表皮細胞單獨包裹，能明顯觀察到珊瑚及蟲黃藻的幾種細胞質(zhì)成分。蟲黃藻的細胞核形態(tài)不規(guī)則，多位于藻細胞中心，由幾條黑色濃縮染色體組成。淀粉核呈橢圓形，一般連接葉綠體，或者淀粉核被葉綠體所覆蓋。蛋白體較大而呈泡狀，在每個藻細胞中數(shù)量為一到兩個。線粒體呈梭形或細長棒狀結(jié)構(gòu)，具有褶皺狀的嵴，嵴分布于雙層膜隔膜內(nèi)。脂質(zhì)體呈囊泡狀，并非所有細胞都含有脂質(zhì)體。葉綠體主要分布在細胞周圍，呈分葉狀結(jié)構(gòu)，含有片狀結(jié)構(gòu)類囊體，通常呈平行排列。用透射電鏡可以清楚地觀察到珊瑚共生體膜的完整結(jié)構(gòu)。蟲黃藻的細胞質(zhì)由藻的質(zhì)膜和細胞壁所包圍，又被多層宿主衍生的膜復合體所包圍[圖2(f)]。在靠近蟲黃藻葉綠體的是一層不連續(xù)、扁平的囊泡膜，其厚度約為19～80 nm，長度可達1 400 nm或更長。蟲黃藻質(zhì)膜約6～7 nm厚，是包含細胞質(zhì)的最內(nèi)層膜，呈彎曲的形狀。膜間空隙具有均勻厚度，與膜間空隙邊界緊鄰的是兩層宿主衍生的中間膜結(jié)構(gòu)，分別為中間膜1和中間膜2，這兩層膜有時分界不明顯。在整個共生體膜系統(tǒng)的最外層是由宿主衍生的、較厚的共生體外膜，呈波浪狀結(jié)構(gòu)。通過顯微觀察，我們確定珊瑚共生體的外膜層和內(nèi)膜層分別起源于宿主細胞和蟲黃藻細胞，共生體之間的所有營養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)運必須通過共生體外膜層和內(nèi)膜層，這對于蟲黃藻和宿主之間的代謝相互作用至關(guān)重要。雖然我們對珊瑚共生體膜結(jié)構(gòu)有了進一步的了解，但是共生體膜的分子組成及代謝物是如何通過共生體膜進行交換運輸，這些細節(jié)我們還不得而知。

一些蟲黃藻的典型細胞結(jié)構(gòu)特征，例如染色體呈高度濃縮的細胞核、葉狀環(huán)繞細胞的葉綠體、巨大的淀粉核及蛋白體等在游離的蟲黃藻中也可以觀察到，但是游離的蟲黃藻缺乏共生體結(jié)構(gòu)。內(nèi)共生蟲黃藻位于宿主內(nèi)胚層細胞內(nèi)的共生體中，因此，共生體也被定義為宿主和蟲黃藻細胞衍生的多層膜復合體，介于共生體內(nèi)、外膜之間的膜間空隙，被認為是宿主和蟲黃藻的邊界。有時能夠觀察到共生體膜內(nèi)陷或者卷曲的現(xiàn)象，這可能與共生蟲黃藻的分裂有關(guān)[2]。與游離的蟲黃藻不同，內(nèi)共生的蟲黃藻生活于高滲透壓的珊瑚細胞環(huán)境中，而這種共生體的空間結(jié)構(gòu)可以支持二氧化碳、碳酸氫鹽離子和營養(yǎng)物質(zhì)在宿主和藻細胞的擴散和遷移，同時共生體膜也可以防止珊瑚細胞的內(nèi)消化作用。然而，應該指出的是共生體膜具有分子識別的機制，不能阻斷光合作用產(chǎn)物和宿主釋放因子的輸送。最近有研究表明珊瑚共生體腔的pH范圍接近4.0，遠遠低于宿主細胞和藻細胞的pH(7.1～7.4)，其低pH環(huán)境創(chuàng)造了共生體膜與珊瑚細胞或藻細胞質(zhì)膜之間強烈的質(zhì)子梯度，可以促進宿主和蟲黃藻之間的代謝物交換[1]。在脅迫條件下，共生體的形態(tài)發(fā)生變化，包括細胞的收縮、液泡化的增加，類囊體的無序和松散等。例如高溫(34 ℃)下，將導致藻細胞變小，細胞質(zhì)與細胞器融合，形成較大的細胞器體，最后共生體膜破裂，蟲黃藻細胞進入凋亡[5]。雖然對珊瑚共生體的細胞結(jié)構(gòu)有了進一步的認識，但對共生體確切的細胞功能和響應機制還知之甚少，這對理解珊瑚宿主與蟲黃藻的共生關(guān)系及其生物相互作用至關(guān)重要，將有助于揭開珊瑚生長和功能障礙(白化)背后的生化過程。

2.2 叢生盔形珊瑚的表皮組織結(jié)構(gòu)

利用掃描電鏡觀察珊瑚觸手息肉組織的表面及外皮層結(jié)構(gòu)(圖3)。珊瑚的體壁由一層厚厚的表皮細胞(由黏液細胞和表皮支持細胞組成)和一層由中胚層分化的胃真皮細胞組成。擴張觸手組織表面最突出的特征是表皮細胞的絨毛突出，黏液細胞分泌的大量黏液遮住或者包裹表面的微絨毛。正面觀察表皮細胞，黏液緊密覆蓋于外表面，形成質(zhì)密呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的薄層，表皮層上還分布一些類似于彈孔的形狀，孔隙直徑達0～3 μm，推測這些孔隙是由表皮細胞附著的蟲黃藻或者微生物脫落而留下的。通過掃描電鏡圖片觀察，體壁表面具有一定的流動性，大量微生物和蟲黃藻貼附在珊瑚黏液細胞層的外表面。從上表皮層斷裂的樣品中，可清楚觀察外皮層的表面形態(tài)，其厚度接近50 μm。內(nèi)皮層細胞間邊界明顯可見，但這些細胞內(nèi)沒有纖毛和微絨毛，內(nèi)皮層細胞排列緊密，鑲嵌大量蟲黃藻細胞。共生蟲黃藻除了主要被包裹于珊瑚內(nèi)表皮細胞，在珊瑚外表皮黏液細胞同樣也附著大量蟲黃藻，本研究推測珊瑚外表皮具有分泌黏液及流動性的特征，可能與蟲黃藻和微生物的穿梭有直接關(guān)系。

圖3 珊瑚組織的掃描電鏡觀察Fig. 3 Coral tissue under SEM(a)、(b)為珊瑚外表皮的形態(tài)特征，(c)、(d)為附著于珊瑚外表皮的蟲黃藻，(e)、(f)為內(nèi)共生蟲黃藻的空間結(jié)構(gòu)。

黏液細胞是珊瑚表皮的一種優(yōu)勢細胞類型，這有利于附著微生物(包括蟲黃藻)，促進微生物群落在珊瑚的表皮上繁殖，增加珊瑚皮層厚度，豐富微生物種群。珊瑚表皮黏液除了通過招募海水中活動的微生物，還將促進微生物的原位生長來補充珊瑚的微生物群體，而體表微生物所需的養(yǎng)分來源于表皮下面的珊瑚組織。珊瑚的外表皮作為阻隔海水的物理屏障，然而掃描電鏡下觀察到珊瑚表皮存在孔隙，這可能更有利于營養(yǎng)物質(zhì)的橫向運輸。研究表明，黏液細胞一般有兩種類型，一類細胞是呈大而多角形的海綿包裹體；另一類細胞較小，并伴有較濃泡沫狀分泌物的顆粒，這類細胞最容易被識別。黏液在擠壓或胞吐過程中，囊泡與細胞膜融合，在不進行膜分離的情況下釋放其內(nèi)容物。另外還有以全細胞方式進行分泌，即整個細胞分解，再釋放出細胞質(zhì)和分泌物。甲苯胺藍的組織化學反應表明，黏液細胞成分主要包括酸性或中性碳水化合物，例如多種黏多糖、蛋白質(zhì)、碳水化合物和脂類等，其中多糖組分是黏液中的主要成分[4]。雖然對分泌黏液的成分和生化性質(zhì)有了一定的了解，但其功能尚不十分清楚。在珊瑚中黏液除了與捕食有關(guān)外，還可能參與體外消化，清除沉積物，防止體表的干燥和紫外線輻射損傷，提高珊瑚對鹽度和溫度變化的抵抗力。

2.3 叢生盔形珊瑚骨骼顯微結(jié)構(gòu)及金屬元素形態(tài)特征

珊瑚骨骼連接反口的外胚層，又稱為鈣基外胚層，其生長的鈣基細胞表面與骨骼完全相互融合。鈣基細胞分泌SOM，并控制鈣離子流通最終形成纖維狀的文石骨架[11]。從掃描電鏡觀察(圖4)來看，叢生盔形珊瑚單體骨骼呈杯狀結(jié)構(gòu)，杯直徑約1.0～6.0 mm，深度在0.5～8.0 mm之間。單體骨架發(fā)育有兩輪不完全的隔壁和裂片，隔壁和裂片從底板向上隆起呈放射狀垂直排列，并微凸于體壁之外，軸柱不明顯。橫截面觀察裂片呈不均勻分布；隔壁呈鋸齒狀，表面不平滑附有類似疙瘩狀的凸起?？v剖面觀察，能看到橫向鱗板，與隔壁垂直交錯排列構(gòu)成獨立的隔間腔，鱗板厚度和隔間腔大小不一，隔間腔內(nèi)分布有呈三角釘狀的水鎂石晶體。掃描電鏡觀察了珊瑚骨骼早期礦化中心(Early Mineralized Center， EMC)和隔壁輻射出的文石結(jié)構(gòu)，文石骨架由連續(xù)的文石質(zhì)結(jié)晶纖維和晶粒有規(guī)則的堆積疊加形成。在有些樣品中的鱗板上發(fā)現(xiàn)有少量方解石礦物晶體和文石晶簇存在，方解石礦物晶體形狀為立方體狀，文石針晶主要呈簇狀排布?？傮w來說，碳酸鈣與SOM的結(jié)晶度在珊瑚骨架中的分布并不均勻，相比隔壁，EMC具有較高的SOM含量，結(jié)構(gòu)更加密實[圖4(f)]。這些觀察表明，珊瑚通過分泌合成SOM誘導粒子附著，隨著碳酸鹽晶體生長進一步堆積形成骨架，因此，SOM對于珊瑚鈣化過程是至關(guān)重要的，支持珊瑚礦化過程的生物調(diào)控觀點。

圖4 叢生盔型珊瑚骨骼內(nèi)部結(jié)構(gòu)特征Fig. 4 Internal structure features of the coral G. fascicularis(a)為珊瑚單體，(b)為珊瑚單體橫截面，(c)為隔壁的顯微結(jié)構(gòu)，(d)為珊瑚單體縱截面，(e)為針狀水鎂石晶體，(f)、(g)為礦化晶粒的形態(tài)及大小，(h)、(i)為文石質(zhì)骨骼纖維，(j)至(l)為方解石和文石碳酸鹽晶體。

在珊瑚骨架的微觀結(jié)構(gòu)上，發(fā)現(xiàn)EMC的骨骼更加結(jié)實，說明其具有較高鈣化速率[6]。目前還不清楚珊瑚骨骼最初的礦化是由細胞內(nèi)的囊泡直接分泌形成，還是由外胚層鈣基細胞在胞外鈣化形成。然而，骨骼的掃描電鏡分析揭示碳酸鈣前體納米粒子沉積時富集大量珊瑚分泌的SOM，有研究表明SOM前體蛋白在初級結(jié)構(gòu)上極其多樣，既有酸性蛋白質(zhì)也有堿性蛋白質(zhì)，其中酸性蛋白質(zhì)富含天冬氨酸，從數(shù)量上看，富含天冬氨酸蛋白在骨骼基質(zhì)中占主導地位，這類富含酸性的蛋白質(zhì)可直接從海水中沉淀碳酸鈣，并以纖維化形式構(gòu)成文石晶體[7]。此外，阿拉伯糖在SOM中也有相當大的富集，這與珊瑚表皮細胞黏液組分一致。SOM在不同石珊瑚種中所占質(zhì)量的比重介于0.1%～0.3%之間，例如在鹿角珊瑚(A.digitifera)中，SOM的濃度約為0.2%[8]。SOM對碳酸鈣體外結(jié)晶也有很大的影響，在高濃度SOM(10～20 mg/mm3)下，晶體的形貌發(fā)生了很大的變化[9]。本研究支持珊瑚礦化過程的生物調(diào)控觀點，生物礦化的過程是相對穩(wěn)態(tài)的[7]，不限于各種理化參數(shù)(例如碳酸鹽離子飽和狀態(tài)或海水的pH等)的控制，珊瑚自身也能夠加大鈣化代謝的潛力以應對未來的海洋氣候變化，如熱脅迫、富營養(yǎng)化和海洋pH降低等威脅[10-11]。

2.4 叢生盔形珊瑚骨骼的金屬元素形態(tài)特征

叢生盔形珊瑚骨骼的各金屬元素形態(tài)數(shù)據(jù)如圖5所示。從圖5可以看出，各種元素在叢生盔形珊瑚骨骼中的含量具有較大的差別。含量最高的是44Ca和43Ca，分別為3 038.90、1 914.62 ng/g，其次為23Na(776.43 ng/g)、88Sr(229.73 ng/g)、27Al(118.70 ng/g)，含量均高于100.00 ng/g。含量較高的金屬元素還有39K、66Zn、56Fe、11B、137Ba，含量均高于10.00 ng/g，其他的金屬元素含量均低于10.00 ng/g。目前，對珊瑚文石中鈣離子的礦化過程有較為深入的認識[12-13]，而其他金屬元素的礦化吸收過程還尚不清楚[14]。有研究認為，珊瑚生長速率等生物因素可能影響骨骼中的微量元素吸收[15]，例如通過溫度和光照處理提高鈣化速率時，骨骼中的Mg/Ca比值相應升高；骨骼中的Sr/Ca比值卻對光照不敏感，而水溫才是控制Sr/Ca比值的主要因素[16]。珊瑚骨骼中某些金屬元素含量的比值與海水環(huán)境參數(shù)具有相關(guān)性，記錄了珊瑚生長的歷史環(huán)境[17]。古溫標參數(shù)(Sr/Ca、Mg/Ca、U/Ca)經(jīng)常用于推測歷史時期的珊瑚生長率與鈣化率，這可能是由于鈣泵對鈣離子以外的金屬親和力不高，而且鈣泵的活力對溫度較為敏感，因此新生骨骼中的Sr/Ca比值容易受溫度影響[18]。此外，河流排放物、海洋上升流、河流的注入量及近岸降雨量等因素也會影響珊瑚對海水中微量金屬(如Ba、Zn等)的吸收[19]；珊瑚骨骼中的重金屬元素如Cd、Pb、Mn也可用于示蹤海洋的污染狀況[20]。未來開展珊瑚骨骼微量元素與海洋環(huán)境參數(shù)的相互作用研究，將有助于進一步探討珊瑚生物鈣化的環(huán)境效應。

圖5 珊瑚骨骼中金屬元素形態(tài)分析測定結(jié)果Fig. 5 Results of speciation analysis of metal elements in skeleton of G. fascicularis

3 結(jié)論

叢生盔形珊瑚廣泛分布于我國南海海域，并對環(huán)境變化和壓力脅迫具有一定的抗逆性，可作為研究珊瑚“生物鈣化”和“共生互作”等方面的一個重要模式生物。為加深對其認識，本研究通過透射電鏡和掃描電鏡研究了叢生盔形珊瑚共生體的細胞顯微結(jié)構(gòu)及骨骼的形態(tài)特征，獲得了如下結(jié)論：

珊瑚共生體的外膜層和內(nèi)膜層分別起源于宿主細胞和蟲黃藻細胞，珊瑚共生體膜的復雜結(jié)構(gòu)對“珊瑚-蟲黃藻”的代謝物交換和生物相互作用具有重要意義。珊瑚外皮細胞可分泌大量的黏液而且體壁表面具有一定的流動性，可能與共生蟲黃藻和微生物的穿梭有直接的關(guān)系。另外，珊瑚的骨骼顯微結(jié)構(gòu)表明，SOM的分泌對于鈣化晶體和骨架纖維的形成至關(guān)重要，支持了珊瑚礦化的生物調(diào)控觀點。