張 飛，郭亞平，于 濤，紀(jì)建達(dá)，湯坤賢，吳元菲

(1.自然資源部第三海洋研究所，福建 廈門 361005； 2.福建省海洋生態(tài)保護(hù)與修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 福建 廈門 361005； 3.南京大學(xué)地理與海洋科學(xué)學(xué)院，江蘇 南京 210023； 4.廈門大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，福建 廈門361005)

銫是第一主族的堿性金屬元素，沒有明確的生物學(xué)功能，但由于其化學(xué)性質(zhì)類似于生命必需元素鉀，通常會(huì)通過細(xì)胞膜上的鉀離子(K+)轉(zhuǎn)運(yùn)通道進(jìn)入細(xì)胞體內(nèi)，經(jīng)由食物鏈傳遞和生物累積進(jìn)入生態(tài)系統(tǒng)。已有研究表明，銫會(huì)對(duì)包括細(xì)菌、真菌和植物在內(nèi)的生物體產(chǎn)生毒害作用[1-3]，目前人們認(rèn)為銫對(duì)生物的毒性作用可能基于以下3種機(jī)制：銫離子(Cs+)減少細(xì)胞對(duì)K+的吸收并引起細(xì)胞的鉀饑餓，Cs+與鉀依賴性蛋白形成不可逆的結(jié)合造成細(xì)胞毒性，Cs+與K+競爭基本的生化功能[4]。

已有研究表明，濃度高于毫摩爾級(jí)的Cs+即對(duì)一般的微生物產(chǎn)生毒害作用[3,5]。例如Cs+對(duì)于Bacillussubtilis007、B.subtilisNCIB 168、B.subtilisNCIB 1650、EscherichiacoliNCIB 9484的最小抑制濃度分別為22、25、24、26 mmol/dm3[5]。當(dāng)前僅有少數(shù)幾株可以耐受200 mmol/dm3及以上濃度Cs+的細(xì)菌被報(bào)道，分別為可以耐受200 mmol/dm3Cs+的Streptomycessp. TOHO-2[6]和Flavobacteriumsp. 200Cs-4[7]，可以耐受400 mmol/dm3Cs+的Serratiasp. Cs60-2[8]和Arthrobactersp. KMSZP6[9]，以及可以耐受高達(dá)500 mmol/dm3Cs+的Yersiniasp. Cs67-2[8]。本研究旨在篩選可以耐受高濃度Cs+的海洋細(xì)菌，并在此基礎(chǔ)上探究細(xì)菌耐受Cs+的機(jī)制，以期為運(yùn)用微生物技術(shù)修復(fù)海洋水體環(huán)境中放射性銫污染提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株

實(shí)驗(yàn)菌株為本研究在廣西防城港海域分離的一株海洋細(xì)菌，參考菌株為BacillushwajinpoensisSW-72T[通過海洋微生物菌種保藏管理中心(Marine Culture Collection of China, MCCC)訂購，菌株保藏編號(hào)JCM 11807]。

1.2 主要試劑和培養(yǎng)基

CsCl (國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，KCl (西隴科學(xué)股份有限公司)，1 000 μg/cm3銫標(biāo)準(zhǔn)溶液，革蘭氏染色試劑盒(海博生物技術(shù)有限公司)，API試劑盒(梅里埃生物制品有限公司)，PCR試劑盒(寶生物工程有限公司)，海鹽(西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司)。

2216E液體培養(yǎng)基(蛋白胨5.0 g/dm3，酵母膏1.0 g/dm3，海鹽 31 g/dm3，pH為7.2～7.4)。1/2 2216E液體培養(yǎng)基(蛋白胨2.5 g/dm3，酵母膏0.5 g/dm3，海鹽31 g/dm3，pH為7.2～7.4)。2216E固體培養(yǎng)基為在相應(yīng)液體培養(yǎng)基中添加瓊脂(16 g/dm3)。

含K+/Cs+培養(yǎng)基：在2216E液體、固體培養(yǎng)基中分別加入終濃度為50、200、500、700 mmol/dm3的KCl、CsCl。

1.3 菌株的分離純化

采集廣西防城港近岸海域(21°39.491′N, 108°36.785′E)表層沉積物(水深9 m)。將1 g沉積物樣品加入到9.0 cm3無菌海水中震蕩混勻，取0.5 cm3上清液加入50.0 cm3含有50 mmol/dm3CsCl的2216E液體培養(yǎng)基中，于25 ℃、160 r/min搖床上振蕩培養(yǎng)。將生長到指數(shù)期的菌液按照1∶100的體積比接種到含有200 mmol/dm3CsCl的2216E液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。按照類似方法將上一步驟獲得的菌液加入到含有下一更高濃度的2216E液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，依次經(jīng)過含有500、700 mmol/dm3CsCl的2216E液體培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)。將上述經(jīng)過含有不同濃度 CsCl 的2216E液體培養(yǎng)基培養(yǎng)后的菌液分別涂布在含有對(duì)應(yīng)濃度Cs+的2216E固體培養(yǎng)基上進(jìn)行分離純化，每個(gè)濃度的培養(yǎng)基上隨機(jī)選取25個(gè)菌落進(jìn)行進(jìn)一步純化，對(duì)純化后的細(xì)菌進(jìn)行16S rRNA測序并保種。

1.4 菌株的鑒定

根據(jù)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》《微生物分類學(xué)》《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[10-12]對(duì)一株可在添加有700 mmol/dm3CsCl的2216E固體培養(yǎng)基上正常生長的細(xì)菌進(jìn)行鑒定。鑒定內(nèi)容包括：通過掃描電鏡觀察該菌株的形態(tài)特征；提取該細(xì)菌基因組DNA，進(jìn)行16S rRNA序列擴(kuò)增并測序。將測序結(jié)果提交到NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)和Ezbiocloud數(shù)據(jù)庫(http://eztaxon-e.ezbiocloud.net)與已有的序列進(jìn)行比對(duì)分析[13]。從Ezbiocloud數(shù)據(jù)庫選取多條相似度較高的16S rRNA基因序列，利用MEGA 7.0中的Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并分別通過API 20NE、API ZYM和API 50CHB等快檢試劑盒檢測該菌株的基本生理生化特征，進(jìn)而確定該菌株的系統(tǒng)分類學(xué)地位。

1.5 耐受銫能力的測定

本研究以菌液在600 nm的光密度值 (OD600)來反映菌株的生長情況。為考察實(shí)驗(yàn)菌株和參考菌株在不同濃度度CsCl和KCl條件下的生長情況。用無菌接種環(huán)將在2216E固體培養(yǎng)基上活化的這兩株菌的單菌落分別接種于2216E液體培養(yǎng)基中，在200 r/min、28 ℃條件下震蕩培養(yǎng)。在上述菌液OD600=0.02時(shí)，吸取200 mm3接種于20 cm3含有不同濃度(0、500、700 mmol/dm3)CsCl和KCl的1/2 2216E液體培養(yǎng)基中，在200 r/min、28 ℃條件下繼續(xù)震蕩培養(yǎng)。每隔2 h取樣200 mm3菌液于96孔板中，在酶標(biāo)儀Spectra Max 190(美谷分子儀器有限公司)下測定OD600值。每組3次重復(fù)。

1.6 實(shí)驗(yàn)菌株對(duì)銫的移除率測定

將在2216E液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h的實(shí)驗(yàn)菌株菌液于12 000 r/min、4 ℃條件下離心 10 min，棄上清，菌體以無菌海水重懸至OD600=1.50。取0.5 cm3接種于50.0 cm3含700 mmol/dm3CsCl的1/2 2216E液體培養(yǎng)基中，于200 r/min、28 ℃條件下培養(yǎng)。每隔12 h取樣，于12 000 r/min、4 ℃條件下離心 10 min，每次用 500 mm3無菌MilliQ水洗滌3次。利用原子吸收分光光度計(jì)TAS 990 (北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)測定上清液和洗滌液中Cs+的含量，參數(shù)設(shè)置為銫燈波長852.1 nm，燈電流4.0 mA。每次實(shí)驗(yàn)同步測定銫的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并以流式細(xì)胞儀AccuriTM C6(美國BD公司)測定菌體數(shù)量。測定Cs+濃度時(shí)加入KCl，使K+的終濃度達(dá)到2 000 μg/cm3，用于抑制溶液中Cs+的電離。銫離子的移除率采用如下公式[14]：

Qt=[(C0-Ct)/C0]×100%

(1)

式(1)中：Qt為t時(shí)刻銫離子的移除率(%)，C0和Ct分別為最初時(shí)刻和t時(shí)刻培養(yǎng)基中Cs+的濃度[mmol/(109cells)]，t為實(shí)驗(yàn)持續(xù)時(shí)間(h)。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株的分離鑒定

在菌株分離鑒定的過程中發(fā)現(xiàn)，在含有200 mmol/dm3CsCl的2216E液體培養(yǎng)基中芽孢桿菌屬細(xì)菌為優(yōu)勢類群，在含有500 mmol/dm3CsCl的培養(yǎng)基中，假單胞菌屬(Pseudomonas)細(xì)菌為優(yōu)勢類群。在含有700 mmol/dm3CsCl的培養(yǎng)基上分離得到一株海洋細(xì)菌，該菌株在固體培養(yǎng)基上可形成淡黃色、中間凸起、表面光滑、邊緣整齊、直徑約為1.0～1.5 mm的圓形菌落[圖1(a)]。掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)該菌株細(xì)胞呈短桿狀，長1.9～3.8 μm，寬0.9～1.2 μm[圖1(b)]。對(duì)其16S rRNA序列測序比對(duì)發(fā)現(xiàn)，該菌株屬于芽孢桿菌屬，與B.hwajinpoensisSW-72T的16S rRNA序列相似度最高(99%)，且獨(dú)立聚類到同一分支上(圖2)。利用API 20NE、API ZYM和API 50CHB等快檢試劑盒對(duì)該菌株進(jìn)行生理生化特征檢測后發(fā)現(xiàn)，該菌株具有硝酸鹽還原性，不產(chǎn)吲哚，能水解明膠，能利用葡萄糖氧化發(fā)酵，能利用D-果糖、D-葡萄糖、麥芽糖、蔗糖和海藻糖產(chǎn)生酸，與芽孢桿菌屬的細(xì)菌生理生化特征一致。經(jīng)細(xì)胞形態(tài)、菌落形態(tài)、16S rRNA測序和生理生化指標(biāo)鑒定，初步鑒定該菌屬于芽孢桿菌，命名為Bacillussp. Cs-700。

圖1 Bacillus sp. Cs-700的菌落形態(tài)和細(xì)胞形態(tài)Fig. 1 Colony and cell morphologies of Bacillus sp. Cs-700(a)為菌落形態(tài)，(b)為細(xì)胞形態(tài)。

圖2 用鄰接法繪制的基于16S rRNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 2 Phylogenetic tree based on 16S rRNA sequences by Neighbor-Joining analysis

2.2 Bacillus sp. Cs-700對(duì)銫的耐受能力

在系統(tǒng)發(fā)育上作為Bacillussp. Cs-700親緣關(guān)系最近的菌株，B.hwajinpoensisSW-72T的生長不會(huì)受到不同K+濃度的影響，但在不同Cs+濃度的條件下，表現(xiàn)出顯著的生長差異[圖3(a)]。在200 mmol/dm3Cs+的培養(yǎng)環(huán)境，前期菌株生長顯著受到抑制；在30 h后，生長曲線才逐漸上升，表現(xiàn)出一定的適應(yīng)性生長，而在500、700 mmol/dm3Cs+的培養(yǎng)環(huán)境中，并未觀察到B.hwajinpoensisSW-72T的生長[圖3(a)]，表明B.hwajinpoensisSW-72T能適應(yīng)廣鹽度但無法在高Cs+濃度的環(huán)境生長。Bacillussp. Cs-700在200、500、700 mmol/dm3Cs+條件下均能生長，而且在已考察的含有相同濃度CsCl和KCl的培養(yǎng)基中生長差異不大[圖3(b)]。而在不含外源添加K+或Cs+的2216E液體培養(yǎng)基中，Bacillussp. Cs-700的生長會(huì)略低于添加K+或Cs+條件的生長。這表明Bacillussp. Cs-700作為一株中度嗜鹽菌，能夠耐受700 mmol/dm3Cs+的脅迫。綜上，本研究證實(shí)了抑制B.hwajinpoensisSW-72T菌體生長的因素并不是高Cs+濃度所產(chǎn)生的高滲透壓，而是高Cs+濃度產(chǎn)生的細(xì)胞毒性。同時(shí)本研究進(jìn)一步印證了耐受高Cs+濃度是菌株Bacillussp. Cs-700的特性，而不是芽孢桿菌屬細(xì)菌的共性。

圖3 B. hwajinpoensis SW-72T和Bacillus sp. Cs-700在含有不同濃度Cs+或K+培養(yǎng)基中的生長情況Fig. 3 Growth of B. hwajinpoensis SW-72T and Bacillus sp. Cs-700 in media of different concentrations of Cs+ or K+

2.3 Bacillus sp. Cs-700對(duì)銫的移除率

同時(shí)考察Bacillussp. Cs-700細(xì)胞和其所在培養(yǎng)基中的Cs+濃度隨時(shí)間的變化情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在開始培養(yǎng)的48 h內(nèi)，菌體中的Cs+濃度會(huì)迅速上升，相應(yīng)培養(yǎng)基中的Cs+濃度會(huì)急劇下降。在開始培養(yǎng)至12 h時(shí)，菌體中的Cs+濃度可達(dá)1.13 mmol/(109cells)，相應(yīng)對(duì)培養(yǎng)基中的Cs+移除率為26.16%。培養(yǎng)至48 h時(shí)，菌體細(xì)胞中Cs+濃度達(dá)到2.97 mmol/(109cells)，培養(yǎng)基中Cs+濃度降到最低，菌體對(duì)Cs+的移除率達(dá)到最大，大約為52.06%。培養(yǎng)48 h后細(xì)胞中的Cs+濃度開始呈下降的趨勢，細(xì)菌對(duì)Cs+的移除率也隨細(xì)胞中Cs+含量的減少而降低，而培養(yǎng)基中的Cs+濃度逐漸上升(圖4、表1)。

表1 Bacillus sp. Cs-700在含有700 mmol/dm3 CsCl的培養(yǎng)基中Cs+的移除率Tab. 1 Cs+ removal rate of Bacillus sp. Cs-700 in medium containing 700 mmol/dm3 CsCl

圖4 培養(yǎng)基和Bacillus sp. Cs-700細(xì)胞中的Cs+濃度變化Fig. 4 Changes in concentration of cesium ion in medium and intracellular of Bacillus sp. Cs-700

芽孢桿菌是一類分布非常廣泛的細(xì)菌，一些芽孢桿菌可以耐受強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、高溫及多種抗藥性。由于特殊的生理特性和遺傳背景，多種芽孢桿菌可被用于污染環(huán)境的生態(tài)修復(fù)。已有研究發(fā)現(xiàn)，從放射性廢物處置場所收集的土壤中分離的Bacillussp. dwc-2菌株，可以在含有9.83 mg/dm3鈾離子(U6+)的溶液中吸附和累積86.86%的U6+[15]。從大亞灣核電站附近的土壤中分離的抗銫細(xì)菌B.cereusBAT-221菌株，在初濃度為80 mg/dm3的銫溶液中對(duì)Cs+的吸附率達(dá)到了86.39%[16]。上述研究表明，多種芽孢桿菌類群對(duì)包括Cs+、U6+在內(nèi)的金屬離子具有高耐受性，具有對(duì)其污染的環(huán)境進(jìn)行生物修復(fù)的潛能。

Cs不是生命必需元素，在生物學(xué)過程中常常與生命必需元素K起著補(bǔ)償和競爭的作用[17]。生物體對(duì)于高濃度Cs+的耐受能力通常歸結(jié)為其細(xì)胞內(nèi)保持相對(duì)低濃度Cs+以及耐受相對(duì)高濃度Cs+的能力[7]。對(duì)于Bacillussp. Cs-700全基因組分析后發(fā)現(xiàn)，該菌株的基因組中包含有很多與K+攝取、跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和蛋白合成相關(guān)的基因，這可能與該菌株耐受高濃度Cs+的能力相關(guān)[18]。

在研究Bacillussp. Cs-700對(duì)環(huán)境中濃度為700 mmol/dm3Cs+的移除率實(shí)驗(yàn)中，于培養(yǎng)前期，細(xì)胞大量快速吸附Cs+。這可能由于Bacillussp. Cs-700是一株革蘭氏陽性細(xì)菌，其細(xì)胞壁的主要成分是肽聚糖和磷壁酸，它們攜帶有帶負(fù)電荷的基團(tuán)，進(jìn)而借助陰陽離子的相互作用而實(shí)現(xiàn)吸附Cs+。這一過程不消耗能量，吸附迅速，屬于被動(dòng)行為[19]。在培養(yǎng)中期，細(xì)胞中Cs+的含量會(huì)隨著時(shí)間增加，但增長率趨緩，這個(gè)階段可能主要是細(xì)胞內(nèi)積累Cs+。活細(xì)胞內(nèi)積累Cs+是一個(gè)依賴時(shí)間(通常超過24 h)和代謝的過程[20]。隨著時(shí)間的推移，Bacillussp. Cs-700對(duì)Cs+移除率緩慢降低，其中可能的原因包括：①Cs+具有較低的電荷-半徑比，是一種弱的路易斯酸，與配體基團(tuán)具有較弱的結(jié)合能力，曾吸附在細(xì)胞表面的Cs+發(fā)生脫落，解吸附到培養(yǎng)基中；②通過K+通道進(jìn)入細(xì)胞的Cs+多于細(xì)胞內(nèi)K+釋放時(shí)補(bǔ)償進(jìn)入的Cs+，細(xì)胞內(nèi)滲透壓增加導(dǎo)致Cs+外流出細(xì)胞；③此時(shí)的細(xì)菌處于平臺(tái)期后期，伴隨著部分細(xì)胞裂解，在細(xì)胞內(nèi)的Cs+釋放到環(huán)境中。結(jié)果表明Bacillussp. Cs-700對(duì)Cs+生物吸附可用于水環(huán)境中Cs+的去除，該菌株具有較好的移除銫的能力，可作為潛在的銫污染生物修復(fù)材料。

微生物能用于放射性核素的修復(fù)，首先應(yīng)滿足對(duì)放射性核素具有一定耐受性[21]。在通過培養(yǎng)基中增加Cs+濃度篩選耐受銫菌株時(shí)，500 mmol/dm3培養(yǎng)基中的細(xì)菌優(yōu)勢類群與200、700 mmol/dm3培養(yǎng)基中差異較大?？赡苁且?yàn)樵?00 mmol/dm3條件下，隨機(jī)挑取的25個(gè)菌落中假單胞菌屬細(xì)菌生長狀況較好，這同時(shí)說明這一環(huán)境中存在較多可以耐受500 mmol/dm3Cs+的海洋細(xì)菌。本研究分離得到的Bacillussp. Cs-700不僅具有較好的耐受高濃度Cs+的特性，而且具有較好的銫移除能力及修復(fù)銫污染環(huán)境的潛力。在此基礎(chǔ)上進(jìn)行菌株耐受高濃度銫機(jī)理的探究，同時(shí)繼續(xù)優(yōu)化環(huán)境參數(shù)，確定該菌株對(duì)Cs+移除的最佳條件，對(duì)于遭受銫污染海洋環(huán)境的生物修復(fù)舉措具有重要的借鑒意義。

3 結(jié)論

本研究篩選出一株耐受高濃度銫的海洋細(xì)菌，經(jīng)鑒定命名為Bacillussp. Cs-700。該菌株能夠耐受環(huán)境中濃度為700 mmol/dm3的Cs+，是目前已報(bào)道可耐受最高Cs+濃度的細(xì)菌。在含有700 mmol/dm3CsCl的培養(yǎng)狀態(tài)下，Bacillussp. Cs-700對(duì)銫的移除率最高可達(dá)52.06%。本研究表明Bacillussp. Cs-700具有較好的銫耐受力和移除率，可作為潛在的銫污染環(huán)境中生物修復(fù)的候選者，可為探索海洋放射性銫的生態(tài)修復(fù)提供參考。

致謝:感謝廈門大學(xué)近海海洋環(huán)境科學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室林大暉特任助理研究員、中國海洋微生物菌種保藏管理中心李光玉博士以及自然資源部第三海洋研究所海洋生物與生態(tài)實(shí)驗(yàn)室蔡鷺春工程師給予的指導(dǎo)和幫助。