王 煜，趙 嵐，闞伯紅，史慧妍

神經(jīng)干細胞(neural stem cells,NSCs)是哺乳動物神經(jīng)組織中的一種能夠通過自身的分裂、更新、持續(xù)增殖以及多向分化的特性產(chǎn)生充足的腦組織細胞的細胞群體[1]。該細胞的發(fā)現(xiàn)和分離實驗的成功給帕金森病、腦卒中和多發(fā)性硬化等神經(jīng)退化性疾病的治愈提供了希望[2]。有報道[3]顯示miR-9的表達上調(diào)與NSCs向神經(jīng)元分化有關(guān)。β-微管蛋白-Ⅲ(β-tubulin-Ⅲ)是細胞骨架家族神經(jīng)細胞的特異性蛋白，在現(xiàn)階段的研究中被證實是神經(jīng)元早期發(fā)育的標志[4]。膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)是一種存在于星形膠質(zhì)細胞內(nèi)的中間絲蛋白，其表達升高往往預(yù)示著星形膠質(zhì)細胞的活化[5]。目前關(guān)于三者在NSCs定向分化為神經(jīng)元的過程中的相關(guān)性研究較少。該研究重點探討miR-9是否通過調(diào)控β-tubulin Ⅲ、GFAP影響NSCs增殖。

1 材料與方法

1.1 實驗分組32只約240 g的健康SPF級SD孕鼠購自上海靈暢生物科技公司，許可證號:SCXX(滬)2018-0003，孕鼠進行NSCs分離，將分離出的NSCs隨機分為4組：NO組常規(guī)培養(yǎng)；NN組轉(zhuǎn)染miR-9 無意義序列；NM組轉(zhuǎn)染miR-9模擬物；NI組轉(zhuǎn)染miR-9抑制劑。

1.2 實驗儀器與試劑GFAP 抗體(上海士峰生物科技有限公司，貨號：sc-33673)；β-tubulin Ⅲ 抗體(北京百奧萊博科技有限公司，貨號：A0303)；電泳儀(型號:EPS-300)、PCR儀(型號：DP1000)(上海啟步生物科技有限公司)；miR-9 mimics、miR-9-NC、miR-9 inhibitor(上海啟因生物科技有限公司，貨號：219600)；MTT試劑盒(上海臻科生物公司，貨號：4890-50-K)；PVDF膜(美國Millipore公司，貨號：Millipore IPVH 00010)；流式細胞儀(東莞南尋進出口公司，型號：SP6800)；恒溫搖床(河南信諾儀器設(shè)備公司，型號：TS-100C)。

1.3 大鼠NSCs的分離、培養(yǎng)麻醉大鼠(2%戊巴比妥鈉)，取出胎鼠，分離并剪碎腦室管膜、腦室下區(qū)、海馬組織。加0.25%胰蛋白酶消化20 min，過濾，用含胎牛血清的培養(yǎng)液終止消化，將濃度為5×108/L的細胞接種至6孔板，進行胰蛋白酶消化，1 600 r/min離心5 min，收集、重懸并培養(yǎng)細胞。

1.4 細胞轉(zhuǎn)染將數(shù)量為1×104個的NSCs細胞株接種到96孔中，15 h后，待細胞重復融合，在EP管中加入200 μl轉(zhuǎn)染液體和4 μl脂質(zhì)體，后加入5 μg的miR-145 mimics、miR-9 inhibitor、miR-145-NC，充分混合后，轉(zhuǎn)染 9 h后，繼續(xù)培養(yǎng)4 h采用qRT-PCR法檢測是否轉(zhuǎn)染成功。

1.5 細胞免疫熒光鑒定細胞數(shù)量、接種、培養(yǎng)同1.4項。2 d后使用多聚甲醛(40 g/L)固定，25 ℃固定10 min，PBS洗滌，5 min/次，共3次；0.5% Triton X-100打孔5 min，PBS洗滌同上；1% BSA 25 ℃孵育0.5 h后，加Anti-Nestin抗體(1 ∶200)4 ℃孵育過夜，PBS洗滌同上；加Anti-Rabbit熒光二抗(1 ∶100)25 ℃避光孵育1 h，PBS洗滌同上；DAPI避光染色10 min，PBS洗滌同上，封固，熒光顯微鏡觀察。

1.6 RT-PCR檢測miR-9、β-tubulin Ⅲ、GFAP含量把保存在-80 ℃環(huán)境中的NSCs細胞取出進行研磨,用TRIzol進行總RNA的提取,逆轉(zhuǎn)錄參照說明書執(zhí)行；將逆轉(zhuǎn)后所得的cDNA進行熒光反應(yīng)實驗。所有反應(yīng)嚴格按照反應(yīng)條件進行擴增，內(nèi)參采用GAPDH，95 ℃變性3 min,95 ℃變性5 s,60 ℃退火1 min,共40個循環(huán)。取平均值計算Ct值,計算方法用2-△△Ct法。見表1。

表1 引物序列

1.7 MTT細胞活力檢測細胞數(shù)量、接種培養(yǎng)同1.4。置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng) 12 h后，在0、24、48、72 h時，更換培養(yǎng)基，孵育4 h，吸棄培養(yǎng)液，每孔加入150 μl DMSO，振蕩孵育10 min。酶聯(lián)免疫檢測儀492 nm測定吸光度(optical density,OD)值，每組實驗至少重復3次并收集數(shù)據(jù)。

1.8 流式細胞儀檢測細胞凋亡細胞數(shù)量、接種培養(yǎng)同1.4。0.01 mol/L PBS洗滌，2 500 r/min離心5 min，室溫避光靜置15 min，收集細胞，保存，PBS洗滌3次，100 μl接種于5 ml流式試管中，加入AnnexinV-FITC 5 μl、碘化丙啶染色液 10 μl充分混合，4 ℃避光孵育0.5 h，流式細胞儀檢測NSCs凋亡情況。

1.9 Western blot檢測β-tubulin Ⅲ、GFAP蛋白表達將NSCs細胞進行裂解并提取核蛋白,并對核蛋白的濃度進行測量,分裝后,-20 ℃保存。將提取出的蛋白溶液和緩沖溶液混勻,按照4 ∶1的比例，為了讓蛋白質(zhì)變性需將蛋白溶液全部煮沸變性處置。將電泳后50 μm的蛋白樣品置于PVDF膜上，加脫脂奶粉加封。1 h后加一抗β-tubulin Ⅲ(1 ∶500)、GFAP(1 ∶500)，然后PBS漂洗3次，間隔10 min。最后加入封閉液稀釋辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗(1 ∶2 000)，25 ℃封閉1 h。取出PVDF膜漂洗(同上)，DAB顯色后照相。

1.10 統(tǒng)計學處理采用SPSS 25.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析，四組NSCs生物活性及β-tubulin Ⅲ、GFAP蛋白、mRNA等比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較行t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠NSCs特征性標志蛋白Nestin鑒定免疫熒光染色結(jié)果顯示細胞傳代后24 h NSCs檢測指標Nestin在90%的細胞中呈現(xiàn)陽性，且與細胞核共定位，提示NSCs分離成功。見圖1。

圖1 細胞株復蘇傳代后Nestin染色×400A～C：誘導前細胞的熒光染色；D～F：誘導1 d時細胞的熒光染色；藍色：DAPI對照；綠色：NSCs；藍色與綠色重疊越多表明陽性率越高

2.2 各組miR-9、β-tubulin Ⅲ、GFAP的基因表達NM組NSCs中miR-9 mRNA表達量最高，與NN組、NO組、NI組相比，差異有統(tǒng)計學意義(F=165.807，P<0.01)，說明轉(zhuǎn)染成功。四組中NM組β-tubulin Ⅲ mRNA表達量最高，GFAP mRNA表達量最低，NI組則相反(Fβ-tubulin Ⅲ=113.627，F(xiàn)GFAP=174.025，P<0.01)；NN組與NO組對比上述三個指標數(shù)據(jù)差異無統(tǒng)計學意義。見圖2。

圖2 4組NSCs細胞中miR-9、β-tubulin Ⅲ、GFAP表達量與NO組比較：**P<0.01；與NN組比較：##P<0.01；與NM組比較：&&P<0.01

2.3 各組β-tubulin Ⅲ、GFAP蛋白含量與NO組、NN組、NI組相比，NM組β-tubulin Ⅲ蛋白含量最高，GFAP蛋白含量最低(Fβ-tubulinⅢ=108.253，F(xiàn)GFAP=167.406，P<0.01)。四組中NI組β-tubulin Ⅲ蛋白表達量降低，GFAP蛋白表達升高；NO組β-tubulin Ⅲ、GFAP蛋白含量與NN組對比差異無統(tǒng)計學意義。見圖3。

圖3 各組細胞中β-tubulinⅢ、GFAP的蛋白表達比較與NO組比較：**P<0.01；與NN組比較：##P<0.01；與NM組比較：&&P<0.01

2.4 各組NSCs增殖情況24 h后各組細胞活性對比差距較大(F=74.078，P<0.01)。與NN組、NO組、NI組相比，NM組NSCs增殖活性最強且呈現(xiàn)隨時間延長而逐漸增強的趨勢(P<0.01)，NI的細胞活性較其他三組相比減弱，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，NO組NSCs的活性略低于NN組，差異無統(tǒng)計學意義。見圖4。

圖4 各組NSCs細胞增殖情況與NO組比較：**P<0.01；與NN組比較：##P<0.01；與NM組比較：&&P<0.01

2.5 各組NSCs細胞凋亡情況NO組、NN組、NM組、NI組細胞凋亡率見圖5。其中NM組細胞凋亡率少于其他三組(P<0.01)，NI的細胞凋亡率較其他三組相比升高(P<0.01)，NO組與NN組胞凋亡數(shù)量差異無統(tǒng)計學意義。

圖5 4組細胞凋亡情況比較與NO組比較：**P<0.01；與NN組比較：##P<0.01；與NM組比較：&&P<0.01

3 討論

早期的研究中提示，正常情況下哺乳動物大腦皮質(zhì)神經(jīng)細胞不可再生。然而近些年的研究[6]表明NSCs作為神經(jīng)前體細胞不但自身具有更新能力，而且能夠分化為大腦細胞。這一發(fā)現(xiàn)為神經(jīng)退化性疾病的治療帶來了新的希望。有報道[7]顯示NSCs的分化機制較為復雜，受機體內(nèi)某些信號調(diào)控影響，尋找干細胞增殖和分化的途徑和方法成為研究的關(guān)鍵。

miRNAs是一種高度保守的非編碼RNA，具有調(diào)控細胞的生物學行為的作用。有研究[8]表明其在哺乳動物大腦中普遍存在，提示其可能在神經(jīng)功能中具有重要意義。miR-9是一種新型的保守miRNA，在人類以及多類生物體內(nèi)廣泛存在。有報道[9]顯示miR-9在神經(jīng)系統(tǒng)中特異性表達，發(fā)揮調(diào)節(jié)神經(jīng)發(fā)育的作用。另外，miR-9在近些年的多種腫瘤細胞的研究中呈現(xiàn)表達失調(diào)，提示其與癌細胞的生物學行為有關(guān)。同時研究[10]表明miR-9在神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變的神經(jīng)元中表達缺失。以上結(jié)果皆提示miR-9與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育以及疾病的發(fā)生過程相關(guān)，可能是兩者的重要調(diào)控因子。本研究顯示NM組NSCs活性最強且呈現(xiàn)隨時間延長而逐漸增強的趨勢。此結(jié)果提示過表達miR-9能夠增加NSCs細胞活性，減少其凋亡。

李彩霞 等[11]對龜板提取物在NSCs向神經(jīng)元細胞分化的過程中的作用進行探討，結(jié)果表明過表達miR-9能夠通過調(diào)節(jié)Notch 1的表達在間充質(zhì)細胞分化為神經(jīng)元的過程中發(fā)揮促進作用。何玲 等[12]研究表明腦絡(luò)通通過上調(diào)β-tubulin Ⅲ、降低GFAP的表達促進NSCs增殖、分化。NSCs向神經(jīng)元分化進程中細胞的形態(tài)變化以及遷移需要細胞骨架的配合[13]。細胞骨架最主要的組成部分為微管，微管是一種管狀物，主要成分為微管蛋白，其中β-tubulin不僅僅是微管的組成成分之一，也是構(gòu)成神經(jīng)元的主要成分。其改變受NSCs向神經(jīng)元分化影響。β-tubulin的所有同源體中β-tubulinⅢ具備神經(jīng)元特異性，作為神經(jīng)元標志物之一被廣泛應(yīng)用于神經(jīng)生物學研究[14]。GFAP被發(fā)現(xiàn)于星形膠質(zhì)細胞內(nèi)，屬于Ⅲ型中間絲蛋白。作為星形膠質(zhì)細胞骨架的主要成分在細胞形態(tài)功能維持、神經(jīng)生理功能及疾病過程中廣泛參與，引起研究者的關(guān)注。免疫組化檢測顯示在健康的生物機體組織中GFAP大多呈現(xiàn)陰性表達，而在神經(jīng)系統(tǒng)受損后，機體組織中的星形膠質(zhì)細胞迅速增多發(fā)揮保護作用，但其增長過多時造成的膠質(zhì)瘢痕在神經(jīng)元的活動聯(lián)結(jié)中成為了阻礙。GFAP作為星形膠質(zhì)細胞的主要成分其表達隨著星形膠質(zhì)細胞的激活增長。因此GFAP蛋白激活被當做神經(jīng)系統(tǒng)星形膠質(zhì)細胞活化的標志物，在臨床可用作急性神經(jīng)損傷的判斷指標。本研究結(jié)果顯示，NM組細胞中β-tubulinⅢ mRNA蛋白表達量在四組中最高，而GFAP mRNA和蛋白表達量最低，提示miR-9通過調(diào)控β-tubulin Ⅲ、GFAP的表達促進NSCs增殖。本研究與上述研究結(jié)果相似。

綜上所述，過表達的miR-9通過促進β-tubulin Ⅲ表達、抑制GFAP表達，從而促進NSCs增殖。該實驗尚有一些不足，如樣本量受限、未對所有類型的NSCs進行試驗，不能排除細胞種類對實驗所帶來的影響，在今后的研究中應(yīng)加入更多的實驗方法對NSCs生物活性進行檢測，為神經(jīng)退化性疾病的治療提供更有利的實驗依據(jù)。