郭棟梁，黃石連，王 靜，韓冬梅，李建光

（廣東省農(nóng)業(yè)科學院果樹研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南亞熱帶果樹生物學與遺傳資源利用重點實驗室，廣東省熱帶亞熱帶果樹研究重點實驗室，廣州 510641）

0 引言

龍眼(Dimocarpus longan Lour.)，為無患子科(Sapindaceae)，龍眼屬(Dimocarpus)植物，是原產(chǎn)中國熱帶、亞熱帶地區(qū)的珍稀水果之一，栽培歷史已有2000多年[1]。95%以上的龍眼種植在東南亞的中國、泰國和越南，其余地區(qū)僅澳大利亞、印尼等地有零星栽培。在自然環(huán)境的長期影響和人為選擇的干預下，中國形成了豐富的龍眼種質資源庫[2]，不僅獲得了龍眼與荔枝的遠緣雜交后代，而且保存了裂葉、焦核、白核、紅果皮等具有特殊性狀的資源。國家龍眼種質圃（福州）收集保存了來自中國、泰國、越南、印度尼西亞、美國等國家的種質資源343份[3]，廣東省農(nóng)業(yè)科學院果樹研究所龍眼種質資源圃收集有各種龍眼種質資源150份。豐富的龍眼資源儲備是我們研究物種起源進化、挖掘控制特異性狀的基因及選育種工作的基礎，而對龍眼種質資源進行綜合評價及遺傳多樣性鑒定則是最為關鍵的基礎工作。

近幾十年來，由于龍眼產(chǎn)業(yè)的迅猛發(fā)展，各地區(qū)間的種質資源交流日益頻繁，無序的引種導致龍眼種質資源同名異物或者同物異名的混亂現(xiàn)象十分突出，資源識別難，追溯難，防偽難成為制約龍眼產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的關鍵問題，急需建立一套有效鑒別和區(qū)分龍眼種質資源的方法。傳統(tǒng)的形態(tài)學鑒定法耗時長，易受環(huán)境條件的影響，準確性差，已不能適應產(chǎn)業(yè)的需求，分子標記憑借操作易、成本低、分辨率高等優(yōu)點成為植物種質資源鑒定與分類和遺傳多樣性分析最有效的方法[4]。許多科研工作者應用 RAPD[5-6]、AFLP[7]、ISSR[8]、SRAP[9]等分子標記對龍眼種質資源的遺傳多樣性進行了分析。

SSR標記具有多態(tài)性高、共顯性、易檢測、重復性高、數(shù)量豐富和對基因組有很好的覆蓋性等特點，廣泛應用于植物遺傳多樣性、新品種鑒定、分子標記輔助育種(MAS)、遺傳連鎖圖譜的構建、分子指紋圖譜的構建等多種方面的研究[10]。近幾年，由于轉錄組測序技術的飛速發(fā)展，基于轉錄組數(shù)據(jù)開發(fā)的SSR分子標記技術被廣泛的應用于已在柑橘[11]、荔枝[12]、桃[13]、梨[14]、葡萄[15]、獼猴桃[16]、木瓜[17]、苦蕎[18]、大豆[19]等作物上。

龍眼的SSR分子標記開發(fā)較晚，傅嘉欣[20]基于基因組SSR數(shù)據(jù)開發(fā)出48對龍眼SSR引物。隨著轉錄組測序技術的進步，依托EST數(shù)據(jù)開發(fā)SSR標記成為更高效的選擇，洪仕南[21]以紅核子龍眼的轉錄組數(shù)據(jù)為基礎開發(fā)了19對EST-SSR引物，郭棟梁[22]以石硤龍眼頂芽的轉錄組數(shù)據(jù)開發(fā)了21對有效的EST-SSR引物，胡文舜[23]利用香脆龍眼果實的轉錄組數(shù)據(jù)開發(fā)的SSR引物分析了5個龍眼近源屬的55種材料的遺傳多樣性。龍眼SSR分子標記的開發(fā)為龍眼遺傳圖譜構建、系譜分析和MAS育種提供高效的分子標記資源。

分子指紋圖譜是指在SSR指紋圖譜的基礎上，基于一定原則對SSR指紋進行字符編碼，獲得可快速、準確區(qū)分不同種質資源的字符串?；赟SR標記的分子指紋圖譜研究在桃[24]、蘋果[25]、葡萄[26]、梨[27]、棗[28]、山楂[29]等果樹資源上已有相關報道，尚未發(fā)現(xiàn)利用SSR標記構建龍眼的分子指紋圖譜。本研究利用前期已開發(fā)的SSR分子標記分析了廣東省農(nóng)業(yè)科學院果樹研究所龍眼資源圃中保存的85份龍眼種質資源的遺傳多樣性并建立了分子指紋圖譜，旨在為龍眼種質資源的分子鑒定和變異分析提供安全高效的技術支持。

1 材料和方法

1.1 材料

本試驗所用85份龍眼種質資源，部分引自福建、四川、廣東等省市（表1），部分為近年來雜交獲得的優(yōu)良單株。供試資源均種植于廣東省農(nóng)業(yè)科學院果樹研究所資源圃中，其生長結果期間的管理水平較為相似。

表1 供試的85份龍眼種質資源

1.2 方法

龍眼葉片基因組DNA提取參照翟世博[30]的方法。龍眼SSR引物選用之前開發(fā)的7個龍眼轉錄組SSR標記[22]，前向引物用Fam熒光修飾（Thermo Scientific，上海）（表2）。龍眼熒光PCR擴增反應體系15μL，其中包括：2*Taq PCR Master M ix 7.5μL，0.1 μmol/LM ix primer2μL，DNA模板1μL(50～200 ng)，ddH2O 4.5μL。擴增反應是在TaKaRa PCRThermal Cycler Dice儀器上進行，擴增程序如下：96℃預變性3min；94℃變性30 s，退火（根據(jù)引物合成單上的Tm減2℃）30 s，72℃延伸1m in，30個循環(huán)；72℃延伸10min。

表2 SSR引物信息

取1μL的PCR產(chǎn)物加入10μL的Hi-Di甲酰胺和0.5μL的內(nèi)標，在遺傳分析儀ABI3730xl上進行毛細管電泳，利用GeneMapper4.1軟件（應用生物系統(tǒng)公司）進行SSR等位片段的檢測和標記分型。用數(shù)字1和0分別表示實驗材料某一等位基因的有無，記錄85份龍眼種質資源的擴增結果建立“1-0”數(shù)字庫。

1.3 數(shù)據(jù)分析

對Gene Marker軟件獲得數(shù)據(jù)用Cervus3.0軟件計算等位基因數(shù)目和多態(tài)性信息量(polymorphism information content,PIC)，利用FSTAT2.9.3.2軟件計算基因的多樣性。利用NTsys-pc 2.10e軟件中的Qualitative data模塊對品種間的遺傳距離系數(shù)(Nei distance)進行分析，以clustering程序中SHAN進行非加權類平均法(unweighted pair group method using arithmetic aaverages,UPGMA)建立所有品種的聚類柱狀圖。

2 結果和分析

2.1 SSR位點的多態(tài)性

利用7對自主開發(fā)的轉錄組SSR引物對85份龍眼種質資源進行擴增，共獲得等位基因片段29個，平均每個引物獲得4.14個，單個引物獲得的等位基因片段數(shù)范圍為3～7個，其中獲得等位基因片段最多為LY2引物，最少的為LY3、LY6、LY7和LY9引物。有效等位基因數(shù)(Ne)范圍在1.52～3.133之間，平均2.175，有效等位基因所占比例為52.49%。群體平均Shannon遺傳多樣性指數(shù)(I)為0.877，其中LY8最高為1.249，LY7最低為0.55；觀測雜合度(Ho)的變化范圍為0.341～0.782，平均值為0.51，期望雜合度(He)的變化范圍為0.342～0.681，平均值為0.514，He的平均值大于0.5。引物的多態(tài)性信息量(PIC)的變化范圍為0.238～0.627之間，平均值0.439。7對引物中有3對引物的PIC值大于0.5，為高度多態(tài)性信息引物（表3）。

表3 85份龍眼種質資源在7個SSR位點的遺傳多樣性

2.2 基于毛細管電泳的龍眼種質資源聚類分析

利用UPGMA方法對85份龍眼種質資源進行遺傳距離分析，其結果表明，85個龍眼種質資源的遺傳距離范圍0.00～0.635，平均為0.299?；贜ei’s遺傳距離，對85份龍眼種質資源進行聚類分析，建立聚類分析樹狀圖（圖1）。結果表明，在遺傳距離為0.635，可以將85份龍眼種質資源分為8個類群。第一類群8份資源：大個圓、越南四季、潘通、伊多、0807-2優(yōu)株、沙梨木、沙梨肉、0405優(yōu)株；第二類群5份資源：廣早、可哈拉、卷葉、石硤、臺山廣早；第三類群8份資源：新窖烏圓、儲良、處暑本、綠珠、巨龍、新滘一號、普明庵、20180723優(yōu)株；第四類群12份資源：青殼寶圓、羅傘木、水南一號、賜合種、河垌廣眼、0807-7優(yōu)株、白花木、桂明、雞腎眼、桂花味、雞卵眼、20180725優(yōu)株；第五類群13份資源：早白露、東壁、實生遲熟、頂圓、瀘早、赤殼、雞蛋本、草鋪種、遲熟龍眼、瀘豐、蜀冠、順德十葉、實生蜀冠；第六類群14份資源：海晏、20180806優(yōu)株、0807-4優(yōu)株、友誼106、0731優(yōu)株、遲龍眼、旺高堂、雙孖木、青殼蕉、駝背木、0806優(yōu)株、鳳梨穗、鳳梨朵、實生脆肉；第七類群10份資源：香眼、古山二號、水眼、九月烏、立冬本、洲頭本、0807-5優(yōu)株、龍憂、紅匣臻、紅核子；第八類群15份資源：后巷本、后壁埔、立秋本、東莞大果、福眼、公媽本、20180813優(yōu)株、20180814-1優(yōu)株、良圓、0807-1優(yōu)株、松風本、大烏圓、紅核、八一早、烏龍嶺。

圖1 基于SSR標記的85份龍眼種質資源的UPGMA聚類分析

2.3 85份龍眼種質資源指紋圖譜的構建

本研究選取7對SSR標記構建85份龍眼種質資源的指紋圖譜，結果如表4所示：7對龍眼SSR標記可以完全將85份龍眼種質資源區(qū)分開來，原本被認為同一資源的蜀冠和實生蜀冠被證實為不同資源。單獨使用一個引物就可以將10份資源分開，其中LY2引物可以單獨將實生遲熟、大個圓、依多、潘通、越南四季、河垌廣眼、早白露7個資源分開；LY4引物可以單獨將實生脆肉、遲龍眼2個資源分開；LY6引物可以單獨將旺高堂分開；LY7引物可以單獨將紅核、0807-04優(yōu)株分開；同時使用LY2引物和LY3引物可以將古山二號、實生蜀冠、石硤、白花木、瀘早分開；同時使用LY2引物和LY4引物可以將龍憂、后巷本、雞卵眼、水眼、20180725優(yōu)株分開；同時使用LY2引物和LY8引物可以將紅匣臻、駝背木、公媽本、立冬本、桂花味、洲頭本、0806優(yōu)株分開。

表4 基于7對SSR引物的85份龍眼資源的指紋圖譜

續(xù)表4

3 討論與結論

隨著生物技術的快速發(fā)展，使用分子標記作為品種鑒定、輔助育種、遺傳多樣性研究成為主要的技術手段。與常用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測技術相比較，熒光標記的毛細管電泳技術具有檢測結果穩(wěn)定、高效、準確等優(yōu)點，已成為鑒定種質資源多樣性的主要手段。目前，還沒有利用毛細管電泳對龍眼種質資源進行檢測和指紋圖譜分析。本研究中，通過優(yōu)化毛細管電泳的試驗條件，統(tǒng)一進樣的PCR產(chǎn)物濃度，優(yōu)化SSR標記的引物，降低毛細管電泳的誤差，建立了一套基于SSR熒光標記的毛細管電泳技術的龍眼資源分子指紋技術體系。

SSR分子標記因其簡單的操作及穩(wěn)定可靠的結果成為分子標記中應用最為廣泛的一種。除胡文舜[23]使用EST-SSR技術對無患子科5個近源屬的種質遺傳多樣性進行分析外，尚未有使用SSR分子標記技術對龍眼種質資源多樣性進行分析的報道。本研究中，筆者從前期自主開發(fā)的21對SSR引物中篩選7對引物用于龍眼遺傳多樣性分析及指紋圖譜構建。7對SSR引物的平均多態(tài)性信息量(PIC)為0.439，其中只有LY2、LY4、LY8引物的PIC>0.5，盡管使用7對引物可以將85份龍眼資源完全分開，但是對于更大群體的遺傳多樣性分析尚且不能滿足，需要進一步開發(fā)更多的適用于龍眼資源分析的SSR引物。

龍眼遺傳多樣性不高的原因可能是長期的無性繁殖和人工選育減少了品種之間的種質資源交流，基因分化逐漸減少，育種材料的遺傳基礎日益狹窄。本研究中85份龍眼資源分為8個類群，來自泰國的潘通、伊多、來自越南四季被聚為一類，其結果與曾黎輝[31]使用ISSR對51份龍眼資源進行聚類獲得的結果一致。洪自同[32]利用ISSR分子標記技術將35份龍眼樣品分為以烏龍嶺、東壁、立冬本為代表的3類群體，本研究中烏龍嶺、立冬本、東壁、赤殼也被劃分為3個獨立的群體。易干軍[7]使用AFLP分子標記、林同香[33]使用RAPD分子標記、曾黎輝[31]使用ISSR分子標記對龍眼種質資源都進行過聚類分析，獲得不同的聚類結果，表明使用不同的分子標記技術獲得的龍眼種質資源聚類結果會有差異。

分子指紋圖譜是資源的身份證，具有唯一性，是品種鑒定、登記、保存的重要憑證。鄭珊等[34]使用11對ISSR引物對40個龍眼品種的遺傳多樣性進行分析，并建立了數(shù)字DNA指紋圖譜，不過其鑒定的品種大多為福建本地品種，其遺傳多樣性較低，易于鑒定。本研究構建了85份來自泰國、越南及中國廣東、廣西、福建、海南等地區(qū)的龍眼資源的指紋圖譜，基本覆蓋了來自我國龍眼主產(chǎn)區(qū)的大部分資源，對于指導龍眼資源的分類，鑒定及合理利用具有重要意義。

本研究利用龍眼SSR分子標記技術，對85份龍眼資源進行群體多樣性分析和指紋圖譜構建。7對SSR引物共檢測到29個等位基因，平均每對引物可檢測等位基因4.14個。7對SSR引物可完全將85份龍眼資源完全分開，遺傳距離范圍為0.00～0.635，表明龍眼資源之間的遺傳距離較低。在遺傳距離0.635處，85份龍眼資源被分為8個類群。龍眼資源遺傳多樣性的分析及遺傳圖譜的建立為龍眼種質資源的鑒定，特別是為生產(chǎn)上許多同名異物和同物異名的亂象鑒定提供了有效手段。