李 磊劉建勛任鈞國付建華

(中國中醫(yī)科學院西苑醫(yī)院基礎醫(yī)學研究所,國家中醫(yī)心血管病研究中心,中藥藥理北京市重點實驗室,北京 100091)

實驗動物模型是指以實驗動物為載體,模擬醫(yī)學、生命科學、食品安全和軍事醫(yī)學等科學研究,以及生物醫(yī)藥和健康產品研發(fā)中應用的與人類疾病、功能紊亂發(fā)生機制和臨床表現高度相似的生物樣本。 中醫(yī)藥動物模型指用于中醫(yī)藥相關研究中的動物模型,其廣泛應用于中醫(yī)藥的現代化研究,在揭示中醫(yī)藥基礎理論、中藥作用機制、中藥新藥研究等方面發(fā)揮了重要作用,同時也豐富了動物疾病模型[1]。 目前用于中醫(yī)藥研究的疾病動物模型已有上百種,在中醫(yī)證候動物模型、病證結合動物模型等方面也取得了長足的發(fā)展,但由于中醫(yī)臨床證候本質尚未明確、動物模型驗證手段缺乏、動物模型的臨床相關性較差等問題依然存在,中醫(yī)證候、病證結合動物模型仍然是制約中醫(yī)藥現代化的瓶頸問題。 筆者概述了中醫(yī)藥疾病動物模型研究的歷程、模型建立思路及評價方法,對研究中存在的問題進了討論,為建立適合中醫(yī)藥特點的疾病動物模型提供參考。

1 中醫(yī)藥動物模型發(fā)展歷史

中國古代就有用動物觀察驗證中藥作用以及中藥治療家畜疾病的記載。 北宋《本草衍義》:“有人以自然銅飼折翅胡雁,后遂飛去。 今人(以之治)打撲損?！泵鞔F醫(yī)學專著《元亨療馬集》創(chuàng)立了八證論,即寒證論、熱證論、虛證論、實證論、表證論、里證論、邪證論、正證論,用于動物疾病的中醫(yī)辨證論治。1923 年,陳克恢用實驗動物進行一系列的實驗,發(fā)現麻黃堿具有增加心肌收縮力、促進血管收縮、舒張支氣管、中樞神經興奮等作用,確認了麻黃堿的興奮交感神經作用,開創(chuàng)了現代中藥藥理研究的先河[2]。1960 年,鄺安堃發(fā)現過量使用腎上腺皮質激素的小白鼠一系列病態(tài)與中醫(yī)陽虛證的臨床特征基本相似:體重下降、萎靡、耐寒力低,1963 年又發(fā)現助陽藥物附子、肉桂、肉蓯蓉、淫羊藿等能減輕或糾正這種狀態(tài)[3]。 自從中醫(yī)陽虛證動物模型建立后,國內外學者開始致力于具有中醫(yī)藥特色的證候動物模型研究,其中具有代表性的是腎虛證、脾虛證及血瘀證動物模型。 隨著中西醫(yī)結合研究的發(fā)展,病證結合動物模型體現了臨床辨病辨證相結合,被認為是中醫(yī)藥現代研究中比較理想的動物模型[4]。 近年來,劉建勛提出了病證結合動物模型擬臨床研究的思路和方法(見圖1),即在臨床文獻的基礎上,分析證候臨床表現和實驗室客觀指標變化的特點,選擇恰當動物模型誘發(fā)因素在實驗動物進行模擬,以最大可能模擬中醫(yī)臨床實際操作過程,從四診表現和臨床客觀變化特征兩方面評價病證結合動物模型的可靠性,采用病證結合動物模型對復方中藥功效和主治進行擬臨床評價[5-6]。 該研究模式被認為促進了中醫(yī)基礎與臨床研究的密切結合,標志著病證結合動物模型的研究達到了一個新的高度[7]。

圖1 病證結合動物模型擬臨床研究Figure 1 Clinically derived study on an animal model combining disease and syndrome

2 中醫(yī)藥動物模型的建立

中醫(yī)藥動物模型根據造模的因素可以分為單因素造模和復合因素造模,根據造模的病因特點可以分為西醫(yī)疾病動物模型、證候動物模型以及病證結合動物模型。 不同的病因建立的模型均有一定的優(yōu)勢和存在的問題(見表1),總體來說病證結合動物模型即有西醫(yī)疾病的病理特點,又有中醫(yī)證候的特征,能實現中醫(yī)和現代醫(yī)學的結合,逐漸成為中醫(yī)藥動物模型發(fā)展的方向。

表1 中醫(yī)藥研究中的動物模型Table 1 Animal model in the research of traditional Chinese medicine (TCM)

2.1 西醫(yī)疾病動物模型

西醫(yī)疾病動物模型是最早在中醫(yī)藥科研中應用的一類疾病動物模型,至今在中醫(yī)藥的研究中仍有廣泛的應用,也是很多中醫(yī)證候模型、病證結合動物模型的基礎。 采用模擬西醫(yī)病因病理施加于實驗動物,復制出西醫(yī)的疾病動物模型,如采用冠脈結扎復制大鼠心肌缺血(再灌注)模型,在此基礎上用中醫(yī)藥進行干預,可以開展中藥作用機制、中藥藥效物質基礎、針灸療效評價等研究[8-9]。 這類模型具有較好的確認性、可控性和重復性,實驗指標明確可靠,實驗結果可信,容易被國際醫(yī)學界所認同。 實驗動物除了整體動物之外,還包括實驗動物的某一部分:器官、組織、細胞等。 因此,采用實驗動物來源的離體器官模型、組織模型,細胞株模型等進行的研究也應屬于疾病動物模型的一部分,如離體心臟缺血-再灌注模型、心肌細胞缺氧復氧模型等。 離體疾病動物模型排除了神經和體液因素的影響,可控制性強,可以相對獨立地觀察某一個因素(比如某種中藥提取物)對器官的直接作用,在深入探索中藥作用機制及有效物質的發(fā)現等方面做出了一定貢獻[10]。 西醫(yī)疾病動物模型有可以直接和現代醫(yī)學接軌的特點,便于西醫(yī)、中西醫(yī)結合以及生物醫(yī)藥相關學科人員開展中醫(yī)藥研究,可以預計在今后還會有學者繼續(xù)采用西醫(yī)疾病動物模型開展中醫(yī)藥研究。 然而,西醫(yī)疾病動物模型在中醫(yī)藥研究中的應用存在著較為突出的問題,越來越多的研究人員認為應該用更具有中醫(yī)特色的疾病動物模型進行中醫(yī)藥研究。

采用西醫(yī)疾病動物模型研究中醫(yī)藥會面臨著兩個主要的問題:一是模型與臨床患者不一致,二是容易脫離中醫(yī)理論。 第1 個問題是西醫(yī)疾病動物模型的普遍性問題,即使研究西藥同樣存在。 如臨床上最常見的冠心病和腦卒中,其病理基礎是動脈粥樣硬化,冠心病和腦卒中是長期動脈粥樣硬化、器官血流灌注不足的引發(fā)的,心臟和腦的內源性保護物質可能消耗殆盡或異常誘導。 然而大多數的西醫(yī)疾病動物模型是在沒有動脈粥樣硬化的動物上結扎冠脈或機械阻斷腦血流建立的,這就可能存在藥物對實驗動物心肌梗死、腦卒中有效,但對臨床上動脈粥樣硬化基礎上發(fā)展起來的冠心病、腦卒中無效[11]。 第2 個問題是西醫(yī)疾病動物模型在中醫(yī)藥領域應用的特殊性問題,即缺少中醫(yī)藥理論的指導,疾病動物模型的制作與中醫(yī)學的治病因素、發(fā)病機制有較大差異,在模型評價指標方面也缺乏中醫(yī)藥的特色。

2.2 西醫(yī)病因病理造模的證候動物模型

依據西醫(yī)的病因病理,施加化學、物理或生物等因素,造成實驗動物的組織器官損傷,復制出類似于中醫(yī)臨床證候的動物模型。 這類模型中最常見的為化學藥物干預方法造模,如大鼠皮下注射腎上腺素后全血及血漿粘度、紅細胞壓積、血漿纖維蛋白原等指標均明顯升高,血液流變性呈“濃、粘、凝、聚”狀態(tài),復合臨床血瘀證特征,是較為常用的血瘀證模型[12]。 利血平是一種用于高血壓治療的腎上腺素能神經抑制藥,其不良反應常見腹瀉、腹痛、大便次數增多、食欲缺乏等,可用于消化道潰瘍動物模型的建立,給予利血平建立大鼠脾虛證模型常用于四君子湯、理中丸、參苓白術散等中藥復方的療效及作用機制研究[13]。

西醫(yī)病因病理建立的證候動物模型操作簡便、模型穩(wěn)定,與現代醫(yī)學研究結果具有可比性。 然而這類動物模型也存在著一定的爭議,有學者認為用西藥所造成的病理狀態(tài)或中毒反應來模擬證候的表象與中醫(yī)證候理論有較大差距,難以模擬人體證候的本質[14]。 也有研究人員認為,臨床上中醫(yī)證候構成的主要因素是臨床表現,而不是病因。 因此,中醫(yī)證候動物模型建立的關鍵在于造模動物所產生的病變和中醫(yī)證候表現是否能反映中醫(yī)證的特點[15]。

2.3 中醫(yī)病因病機造模的證候動物模型

依據中醫(yī)傳統(tǒng)的病因病機理論,模擬中醫(yī)證候的形成原因,將六淫外邪、勞逸失度、飲食不節(jié)等治病因素施加在實驗動物上,模擬出與證候表現基本類似的動物模型,如將大鼠置于冰水造成寒凝血瘀模型、恐傷腎的腎虛模型以及飲食失節(jié)的脾虛證模型等。 除了單因素模擬中醫(yī)病因病機,多因素復合造模能縮短造模時間、提高造模的效率與質量。 例如,采用疲勞、饑餓及受寒同時作用于小鼠,由于勞則氣耗、饑則傷脾、傷脾則寒邪內襲,可建立虛寒證模型。 通過模擬中醫(yī)病因病機建立的證候動物模型,突出了中醫(yī)藥理論的指導,一定成程度上體現了中醫(yī)辨證論治的特點,除藥物研究之外還可用于中醫(yī)證候研究,有學者在證候動物評價中引入了舌象、脈象等中醫(yī)特色的觀察指標,使得研究更加貼近中醫(yī)臨床實際。

此類證候動物模型的不足之處在于,中醫(yī)傳統(tǒng)病因病機不一定能直接造出相應的證候動物模型。中醫(yī)的病因大多是非特異性的治病因素,同一病因可能導致多個不同證候,而多種病因又可導致同一種證候。 如給動物施加冰水游泳因素,動物可能會出現寒邪犯肺而形成表證,也可能出現寒凝血瘀證,還可能由于游泳耗氣出現氣虛證。 這會影響實驗動物的同質性,降低動物模型的規(guī)范性和可重復性[16]。 同時,由于中醫(yī)臨床證候本質研究尚處于探索階段,中醫(yī)證候的規(guī)范和評價標準體系尚未建立,這也造成了動物模型的中醫(yī)證候屬性判別的難度。

2.4 病證結合動物模型

傳統(tǒng)意義的病證結合是指中醫(yī)辨病與中醫(yī)辨證的結合,現代的病證結合是在中西醫(yī)結合體系下,在西醫(yī)的辨病的基礎上結合中醫(yī)辨證論治。 為適應中醫(yī)臨床辨病與辯證相結合的實際情況,建立病證結合動物模型也日益受到關注,并逐漸成為中醫(yī)實驗動物模型發(fā)展的新領域。 常見的病證結合動物模型制備思路有兩種:單純西醫(yī)疾病動物模型觀測法,西醫(yī)病因病理復合中醫(yī)病因病機造模法[17]。

有學者認為,疾病與證候不可完全割裂看待,疾病發(fā)展過程本身就存在著中醫(yī)證候的變化。 在建立西醫(yī)疾病動物模型基礎上,觀察疾病形成過程中的證的演變及疾病模型建立后表現的中醫(yī)證型,進而確定某一特定的病證結合模型。 例如,馮玄超等[18]通過結扎大鼠左冠狀動脈前降支建立心力衰竭模型,術后4 周模型組大鼠心功能下降,術后多時點動態(tài)觀察顯示模型大鼠呼吸頻率增加,口唇、耳廓、足部顏色逐漸紫暗,運動距離及速度降低,研究者將該模型術后第7～28 天辨證為氣虛血瘀證。 這類動物模型人為干預因素較少,模型的穩(wěn)定性和可靠性較高。 在臨床診療中,由于中西醫(yī)認識角度的不同,同一患者西醫(yī)給出疾病診斷為冠心病,中醫(yī)可給出證候診斷為氣虛血瘀證,上述動物模型在一定程度上模擬了臨床實際診療中病證統(tǒng)一、病證一體的特點[19]。

西醫(yī)病理復合中醫(yī)病因建立病證結合動物模型根據“病”、“證”因素施加順序可分為:先證后病、先病后證及病證同步。 一部分學者認為應采用先病后證的模式,原因是病模型的穩(wěn)定性較好,證相對于病具有不穩(wěn)定性,在病模型的制作過程中很難確保證不會受到影響而引起證型的變化,對于病來說,變化的可能性相對較小,也與臨床診斷先辨病再辨證的思路相吻合。 如楊碩等[20]采用冠狀動脈結扎后,配合饑餓、游泳等4 周的方法造成了氣虛血瘀證慢性心衰模型。 但在實際研究過程中,有不少病證結合的模型是以先證后病或病證同步的模式制作,并且順利制成了相應模型。 如王磊沙等[21]采用力竭游泳加睡眠剝奪建立大鼠氣虛血瘀證動物模型,在此基礎上向頸內動脈注射栓塞微球導致多發(fā)型腦梗死形成腦梗氣虛血瘀證模型。 武曲星等[22]同步采用睡眠剝奪復合免疫法建立免疫性血小板癥氣不攝血證模型。 此類模型吸收了中、西醫(yī)在造模方面的成功經驗,發(fā)揮了各自學科對病證產生的致病特色,有利于中西醫(yī)結合理論研究的發(fā)展。 然而,由于中西醫(yī)理論存在差異,兩者結合的切入點相對較少。 同時,中醫(yī)證候是疾病某一階段病因、病位、病理的概括,缺乏邏輯關系的將西醫(yī)病理因素和中醫(yī)病因因素強行疊加,可能造成證候與期待建立模型證候的階段性不一致。

病證結合動物模型即具備中醫(yī)證候的特點,又有西醫(yī)疾病的病理改變,較單純的西醫(yī)疾病模型和單純證候模型更符合中醫(yī)藥的理論和臨床實際。然而,病證結合動物模型仍然存在著與單純證候模型一樣的證候認定障礙問題,也存在著單純西醫(yī)疾病模型與臨床患者不一致問題。 例如,在小型豬左冠狀動脈前降支放置Ameroid 縮窄環(huán)制成冠心病小型豬氣虛血瘀證模型,該模型需要開胸手術放置縮窄環(huán)與臨床冠心病實際發(fā)生有很大差異[23]。 針對病證結合動物模型建立過程中存在忽略了中醫(yī)臨床對模型建立和評價的指導作用等問題,劉建勛及研究團隊提出了病證結合動物擬臨床研究思路與方法。 在擬臨床病證結合動物研究思路的指導下,結合前期冠心病痰瘀互結證文獻和臨床研究的結果,在小型豬高脂血癥的基礎上,采用心導管介入的方法造成冠脈前降支血管內皮損傷,促使內膜下的脂質沉積和動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展。 通過脂質代謝,心肌缺血面積改變、心肌和冠脈組織病理學分析對冠心病小型豬模型進行評價。 同時將中醫(yī)反映痰多體胖的體重指數、舌象RGB 三原色分析、脈象的無創(chuàng)血流動力學分析、胸痛的體表心電圖等用于證候評價,建立的動物模型無論在冠心病客觀檢查方面,還是在痰瘀互結證的證候客觀化指標方面都與臨床非常吻合[24-26]。 該研究模式受到越來越多行業(yè)內的借鑒,如郭文鶴等[27]參照相關資料及文獻研究,結合動脈粥樣硬化病因病機的演變規(guī)律,發(fā)病機制的現代研究,用冰水浴,灌胃脂肪乳和尾靜脈注射牛血清蛋白復合誘導方法建立了動脈粥樣硬化氣滯血瘀證大鼠模型,該模型與患者臨床癥狀和體征表現相近。

3 中醫(yī)藥動物模型的評價

西醫(yī)疾病動物模型多采用現代醫(yī)學的評價指標體系,其模型評價因缺乏中醫(yī)藥特色在中醫(yī)藥研究領域的受到較多質疑。 中醫(yī)證候動物模型評價研究已有30 余年的歷史,1987 年陳小野[28]就提出了中醫(yī)證候動物模型評價5 方面依據:癥狀(本證)、病因(正證)、治療(反證)、相關因素(佐證)和客觀指標(佐證)。 當前,中醫(yī)證候動物模型評價研究中,通過對動物模型進行“四診”信息的采集,參照臨床診斷、辯證的方法來辨識動物模型的證候是中醫(yī)證候模型評價的主要手段。 同時,將臨床和基礎研究中能夠較客觀地反映證候特征的客觀指標、特異性指標,體現到動物模型評價中[29]。 如利用心電圖變化反應動物心肌缺血情況,根據動物體重、抓力、曠場活動等程度不同進行半定量評分反應動物的飲食、體力、活動度等表現。 通過宏觀辯證與客觀指標結合可以對動物模型進行較為有效的證候評價,然而上述方法仍存在癥狀選擇判定尚無統(tǒng)一標準,與臨床已形成的全國辯證標準也存在著差異,理化指標選擇帶有主觀性,特異性差且具有直接臨床證據的較少等問題。

以方測證作為動物模型宏觀辯證、客觀指標辯證方法的補充,廣泛的應用在中醫(yī)證候動物模型研究中。 如宋紅等[30]以大黃法、游泳力竭法、饑餓法多因素復合建立了脾氣虛證大鼠模型,在造模因素撤去后大鼠消瘦、大便溏泄、倦怠乏力等脾氣虛證癥狀仍存在,血清木糖濃度、CPK 等客觀指標未見明顯改善,而給予黃芪建中湯動物則得到了恢復,研究者認為這是一種經得起藥物反證、可行而穩(wěn)定的脾氣虛證造模方法。 有學者對病證結合動物模型藥物反證是只選用單一方藥提出了質疑,認為方劑具有多效性,沒有設置“方不對證”治療組,得出的結論缺乏說服力。 因此,在開展以方測證研究時除了使用方證相應藥物外,還應根據造模的具體因素,選擇療效可靠、功效明確但與動物模型方證不應的經典方劑進行對照研究[31]。 筆者比較了丹蔞片(方證相應)和生脈膠囊(方證不相應)對于小型豬冠心病痰瘀互結證的影響[32],結果顯示用于痰瘀互結證胸痹的丹蔞片可顯著降低動物血脂水平、改善血液流變學、減小梗死面積、保護心功能、改善中醫(yī)四診評分；而用于氣陰兩虛證冠心病的生脈膠囊雖然也有一定的療效,如改善心功能,改善血液流變學及降低舌象和脈象評分,但在作用效果不及丹蔞片,而且在血脂代謝、心梗面積及主癥和兼癥評分等方面更是受益甚小。

隨著現代科學技術的發(fā)展,越來越多的研究技術應用到中醫(yī)證候模型評價中,如基因組學、代謝組學、蛋白質組學等“組學”技術能彌補以往采用少數幾個觀察指標評價的不足,可以與臨床患者相關數據進行比對進一步增加動物模型的可信性。 如苗蘭等[33]采用冠狀動脈球囊拉傷結合高脂飼料喂養(yǎng)建立中國小型豬痰瘀互結證冠心病模型,發(fā)現模型組冠狀動脈組織與正常組相比共有蛋白差異點35 個,14 個上調點,17 個特異表達點,另外有 4 個點發(fā)生未知修飾變化,認為發(fā)現的差異蛋白可能與痰瘀互結證冠心病的形成、發(fā)展相關。 李靜等[34]采用結扎大鼠左冠狀動脈前降支方法制備冠心病血瘀證模型,利用超高效液相色譜-質譜聯用技術檢測尿液樣本小分子內源代謝物,發(fā)現冠心病血瘀證模型大鼠尿液代謝組學出現改變,涉及能量代謝失衡,以及氨基酸代謝,糖代謝,嘌呤代謝紊亂及脂質堆積等多個層面。 蛋白質組、基因組學、轉錄組學及宏基因組等多層面的組學數據并非相互獨立,任一單組學都不足以系統(tǒng)地闡釋中醫(yī)藥疾病動物模型與臨床實際的對應關系。 多組學聯合具有系統(tǒng)性、關聯性、動態(tài)性、整體性等優(yōu)勢,為中醫(yī)藥研究提供了新的平臺,給了我們更多研究復雜疾病和中醫(yī)證候的思路[35]。 目前,中醫(yī)藥多組學聯合多集中在臨床研究,隨著系統(tǒng)生物學研究的日漸普及,可以預計多組學聯合也將是中醫(yī)疾病動物模型研究的必然趨勢。 很多非傳統(tǒng)生命科學領域的技術也運用到實驗動物研究中,如無線遙測技術可采集實驗動物清醒狀態(tài)下的連續(xù)生理信號[36]；計算機視覺技術和模式識別技術、使分析實驗動物復雜行為模式成為可能[37]；有研究顯示人工智能程序具有類似哺乳動物一樣的尋路能力,研究人員甚至認為在將來可以用人工智能代替實驗動物來進行研究[38]。探索將這些新技術、新方法應用于建立和評價適合中醫(yī)藥特點動物模型可能是中醫(yī)藥動物研究的發(fā)展方向。

4 展望

一個好的疾病動物模型須盡可能滿足與人類疾病比較的“三性”特征,即發(fā)病機理同源性、行為表象一致性、藥物治療預見性,同時具有創(chuàng)建易行性、重現性與經濟性的特點[11]。 因此,與臨床緊密結合是中醫(yī)藥研究用疾病動物模型建立和評價中最重要的一個環(huán)節(jié),在今后的研究中應繼續(xù)加強動物模型與臨床的相關性分析。 在傳統(tǒng)的動疾病物模癥狀、體征、客觀指標等“像不像”研究基礎上,運用現代生物信息學、組學等技術開展疾病動物模型生物學基礎“像不像”的研究。

病證結合動物模型的建立研究是連接中醫(yī)基礎和臨床的橋梁與紐帶,是深化證候認識的方法,同時也是有效中藥的篩選、藥物作用機制深入研究的手段。 然而,病證結合動物模型的建立和評價仍存在不少不足或者可探索之處,如絕大多數制造的是一病一證的病證結合模型。 即圍繞一種現代醫(yī)學疾病,疊加中醫(yī)干預因素后制作一個證的動物模型。 如冠心病氣虛血瘀證、高血壓肝陽上亢證模型、2 型糖尿病氣陰兩虛證模型等等。 這些病證結合模型研究中幾乎很少從同種疾病的不同證候差異、不同病的同種證候異同角度進行過探索[39]。 因此,運用比較醫(yī)學思想構建病證結合動物模型,通過對比、優(yōu)選建立規(guī)范化、系統(tǒng)化的病證結合動物模型體系可能是今后中醫(yī)藥疾病動物模型的研究方向。

完美的動物模型幾乎是不存在的,選擇最適合的實驗動物模型開展中醫(yī)藥研究是必然的方式。雖然有部分學者認為動物不能開口說話沒有主訴,難以采集四診資料,對中醫(yī)證候、病證結合動物模型持懷疑和否認態(tài)度。 但是,大多數中醫(yī)藥研究人員還是堅持中醫(yī)動物模型是具有可行性的,能在一定程度上模擬中醫(yī)臨床的實際。 目前,西醫(yī)疾病動物模型尚未做到完全模擬西醫(yī)臨床患者,對具有中醫(yī)藥動物模型要求成熟規(guī)范、面面俱到就顯得過于苛刻。 通過妥善設計和仔細觀察,具有中醫(yī)藥特色的疾病動物模型無疑是可以用于中醫(yī)藥理論和應用研究的。 相信隨著科技的發(fā)展和中醫(yī)藥研究的深入,具有中醫(yī)藥特色的證候動物模型、病證結合動物模建立與評價的重視程度和研究水平將不斷提高,這對于擴大中醫(yī)藥的國際認可度、明確中醫(yī)證候本質、創(chuàng)新中藥開發(fā)等方面具有巨大的學術價值和經濟意義。