曾信豪謝東可鄭 皓徐 沛王小勇

(1.西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院兒外科,四川瀘州 646000；2.四川省出生缺陷臨床醫(yī)學研究中心,四川 瀘州 646000)

壞死性小腸結腸炎(necrotizing enterocolitis,NEC)是一種腸道炎癥性疾病,在新生兒群體中發(fā)病率、病死率均較高[1]。 NEC 極易引發(fā)新生兒腸穿孔、多器官衰竭、敗血癥等,甚至導致患兒死亡[2]。目前,臨床可以采取外科手術的方式治療NEC,但由于創(chuàng)傷大,術后并發(fā)癥多,術后死亡率仍較高,且較高的手術費會增加患者經濟壓力。 如何利用其他治療方式避免NEC 病情進展是新生兒外科醫(yī)生和內科醫(yī)生所需要共同面對的難題。 抗炎藥物、控制腸道菌群等藥物進行保守治療[3-4],可以規(guī)避臨床手術風險,但此類藥物耐藥性較強,不良反應多,且部分患者療效不佳。 苦杏仁苷(amygdalin)是苦杏仁的有效成分之一,又稱維生素B17,臨床上常用于治療祛痰止咳以及抗腫瘤的輔助治療,可有效改善咳喘、肺纖維化、抗高氧誘導肺損傷等呼吸疾病[5]。 相關研究表明,苦杏仁苷可用于治療緩解胃腸道疾病,提高機體免疫功能、抑制腸道炎癥、緩解腸組織損傷等[6]。 因此,本研究探討了苦杏仁苷對新生大鼠NEC 的保護作用,以期為臨床提供更多治療NEC 的方法。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

選擇7 日齡的健康 SD 大鼠共 60 只,SPF 級,雌雄不限,體重約15 g,購自西南醫(yī)科大學[SCXK(川)2018-17],飼養(yǎng)于西南醫(yī)科大學[SYXK(川)2018-065]。 經本院西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院倫理委員會批準(IACUC20201207)；實驗研究過程中符合3R 原則。 飼養(yǎng)條件:采用清潔層流架小環(huán)境控制飼養(yǎng)。 每 3 d 換 1 次墊料,每天 09:00 和 20:00 各飼喂1 次,自由飲水。 溫度控制在18℃～22℃,濕度50%～60%。

1.2 主要試劑與儀器

強化配方乳、組織及細胞裂解液(北京伊塔生物科 技 有 限 公 司, 批 號: 20200608、 20200512、20200416)；苦杏仁苷(上海韻泰信息科技有限公司,批號:20200226)；PMSF 蛋白酶抑制劑混合物(伊塔生物有限公司,批號:20200614)；細胞凋亡試劑盒(武漢益普生物科技有限公司, 批號:20200816)。 腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)、白細胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、白細胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)檢測試劑盒(北京索萊寶科 技 有 限 公 司, 批 號: 20201012、 20200924、20200916)；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)檢測試劑盒、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSHPx)檢測試劑盒(天津本生健康科技有限公司,批號:20200706、20200815、20200724)；辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG 抗體(北京百奧萊博,批號:BL0899)；β-actin 鼠單克隆抗體(北京百奧萊博,批號:WK347-XHA)。

Bio-Rad 多功能酶標檢測儀( 型號iMark680)； OLYMPUS 光 學 顯 微 鏡 ( 型 號BX60)；Bio-Rad SDS-PAGE 電泳儀和轉膜儀(型號Mini Protean 3 Cell)。

1.3 方法

1.3.1 動物模型建立和分組

將60 只出生7 d 的健康新生SD 大鼠按隨機數字表法分為對照組、模型組、苦杏仁苷低劑量組、苦杏仁苷中劑量組、苦杏仁苷高劑量組和柳氮磺嘧啶組,每組10 只。 利用配制代乳品(脂肪120 g/L、蛋白質75 g/L、乳糖28 g/L、熱量5.9 mJ/L)喂養(yǎng),每5 h 喂養(yǎng)1 次。 除對照組外,將其他組大鼠放入缺氧箱內,向箱內注入濃度100%的氮氣,當測氧儀每min 測得箱內氧氣濃度降為0 時開始計時,1 min 后關閉閥門,取出大鼠；5 min 后立即將其置于4℃冰箱中10 min 進行冷刺激,每天3 次；脂多糖10 mg/kg 灌胃,每天1 次,連續(xù)3 d 重復上述操作。 末次干預后第 2 天,低、中、高劑量組分別給予 20、40、80 mg/kg 苦杏仁苷,陽性對照組給予300 mg/kg 柳氮磺嘧啶,連續(xù)給藥5 d；模型組給予等體積的氯化鈉注射液；對照組則不予任何處理。 若造模后大鼠出現吐奶、腹脹、腹瀉、血便等癥狀,且HE 染色顯示腸組織病理損傷評分≥2 分為NEC 建模成功。

1.3.2 評估回盲部腸組織病理組織損傷及大鼠體重變化

末次人工喂養(yǎng)12 h 后,處死大鼠,記錄體重。取各組回盲部腸組織,利用4%的多聚甲醛固定,進行石蠟包埋切片處理,并將回盲部腸組織進行蘇木精-伊紅染色,觀察其病理學變化,根據參考文獻[7]對各組大鼠進行回盲部腸組織損傷評分:回盲部腸組織結構正常、絨毛及上皮均完整為0 分,回盲部腸組織黏膜固有層有輕微腫脹或分離為1 分；回盲部腸組織黏膜固有層中度腫脹分離為2 分；回盲部腸組織黏膜固有層重度腫脹分離,且黏膜下肌層水腫并伴局部絨毛脫落為3 分；腸壞死且回盲部腸組織絨毛消失為4 分。

1.3.3 TUNEL 法檢測腸組織細胞凋亡情況

將腸組織細胞處理為5 μm 切片,烤片30 min后,進行脫蠟水化處理,利用蘇木素染色1 min 后,蒸餾水沖洗,再用鹽酸乙醇分化10 s,沖洗,氨水返藍30 s 后,沖洗,伊紅染色20 s,乙醇脫水,利用二甲苯透明,最后封片。 用顯微鏡下觀察細胞染色情況。

將各組大鼠回盲部腸組織進行石蠟包埋切片處理,脫蠟至水,利用原位末端標記(TUNEL)法檢測大鼠腸組織細胞的凋亡情況,嚴格按照細胞凋亡試劑盒說明書步驟操作,最后用抗熒光淬滅劑封片液封片并鏡檢。

1.3.4 酶聯免疫法檢測炎癥因子

取回盲部腸組織,按照20 mg 加入100 μL 組織裂解液的比例加入組織裂解液和蛋白酶抑制劑(苯甲基磺酰氟),在4℃下,14000 r/min 離心10 min,取上層清液,采用酶聯免疫吸附試驗測定TNF-α、IL-6、IL-1β 水平,嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.3.5 酶聯免疫法檢測氧化應激水平

采用玻璃勻漿器,將各組盲部腸組織制成組織勻漿液,利用酶聯免疫吸附法檢測勻漿液中的GSHPx、SOD、MDA 含量,嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.3.6 Western blot 檢測 NLRP3/ASC/Caspase-1 信號通路

利用 Western blot 檢測 NOD 樣受體蛋白 3(NOD-like receptor protein 3,NLRP3)、凋亡相關斑點樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD,ASC)、活化半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase-1,ASC)蛋白表達水平。 采用細胞裂解液裂解,組織勻漿,4℃下14000 r/min 離心5 min,取上清提取各組回盲部腸組織總蛋白,嚴格按照操作說明進行。 采用BCA 法進行蛋白定量,取20 μg 蛋白進行SDS-PAGE 凝膠電泳,電轉至PVDF膜上,采用洗膜緩沖液洗膜并加一抗(NLRP3、ASC、cleaved cas1/cas1),4℃,孵育過夜,洗膜加羊抗兔IgG 二抗(1 ∶3000),搖床震蕩,于室溫下孵育 2 h。電化學發(fā)光顯影,用β-actin 作為內參,用凝膠圖象處理系統(tǒng)分析對比條帶強弱。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0 軟件進行數據分析,滿足正態(tài)性的計量資料均以平均數±標準差()表示,采用單因素方差分析比較組間差異,SNK-q比較多組兩兩組間差異,以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 苦杏仁苷劑量依賴性減輕腸組織病理組織損傷、增加大鼠體重

與對照組相比,模型組大鼠體重顯著下降,腸組織損傷評分顯著增加(P＜0.05)；與模型組相比,苦杏仁苷中、高劑量組、柳氮磺嘧啶組大鼠體重顯著上升,腸組織損傷評分顯著下降(P＜0.05),提示苦杏仁苷有抑制組織損傷的作用,并且劑量越高這種抑制作用越顯著。 見表1。

表1 苦杏仁苷劑量依賴性減輕腸組織病理組織損傷、增加大鼠體重()Table 1 Amygdalin dose-dependently reduces pathological tissue damage and increased body weight in rats

表1 苦杏仁苷劑量依賴性減輕腸組織病理組織損傷、增加大鼠體重()Table 1 Amygdalin dose-dependently reduces pathological tissue damage and increased body weight in rats

注:與對照組相比,*P＜0.05；與模型組相比,＃P＜0.05。Note. Compared with control group,*P＜0.05. Compared with model group,＃P＜0.05.

分組Groups劑量(mg/kg)Dose體重變化(g)Weight change腸組織損傷評分(分)Intestinal tissue injury score對照組Control group - 2.16±1.47 0.17±0.07模型組Model group - -14.99±6.66*3.32±0.55*苦杏仁苷低劑量組Amygdalin low-dose group 20 -14.80±6.86 3.22±0.70苦杏仁苷中劑量組Amygdalin middle-dose group 40 -4.55±4.21＃2.41±0.57?？嘈尤受崭邉┝拷MAmygdalin high-dose group 80 -1.59±1.25＃1.24±0.36＃柳氮磺嘧啶組Sulfasalazine group 300 0.59±1.37＃0.92±0.31＃

2.2 苦杏仁苷劑量依賴性抗細胞凋亡

HE 染色顯示腸組織細胞被染成紫紅色,腸組織細胞核被染成紫藍色。 對照組大鼠腸組織細胞橫紋清晰、結構完整、大小正常、排列整齊、灰白質分界清晰且核仁清晰可見；空白對照組和陰性對照組大鼠腸組織細胞顯著增大、組織內存在較多空腔、排列紊亂,間質增多,灰白質分界不清晰,有明顯成纖維細胞增生；陽性對照組大鼠腸組織細胞排列稍紊亂,間質稍增多,有少量成纖維細胞增生,見圖1。

圖1 腸組織HE 染色情況比較Figure 1 Comparison of HE staining of intestinal tissue

TUNEL 法檢測大鼠腸組織細胞顯示,與對照組(2.02%)相比,模型組的細胞凋亡率(45.45%)顯著升高(P＜0.05),與模型組相比,苦杏仁苷中劑量組(20.20%)、苦杏仁苷高劑量組(10.39%)、柳氮磺嘧啶組(7.58%)細胞凋亡率顯著下降(P＜0.05),見圖 2、表 2。

表2 苦杏仁苷劑量依賴性抗細胞凋亡(ˉx±s)Table 2 Amygdalin dose-dependently anti-apoptosis

圖2 腸組織細胞凋亡情況比較Figure 2 Comparison of cell apoptosis in intestinal tissue

2.3 苦杏仁苷劑量依賴性降低炎癥因子水平

與對照組相比,模型組的 TNF-α、IL-6、IL-1β 水平顯著升高(P＜0.05),與模型組相比,苦杏仁苷中劑量組、苦杏仁苷高劑量組、柳氮磺嘧啶組TNF-α、IL-6、IL-1β 顯著下降(P＜0.05),提示苦杏仁苷有抑制炎癥的作用,并呈現劑量依賴性。 見表3。

表3 苦杏仁苷劑量依賴性降低炎癥因子水平()Table 3 Amygdalin dose-dependently reduces the level of inflammatory factors

表3 苦杏仁苷劑量依賴性降低炎癥因子水平()Table 3 Amygdalin dose-dependently reduces the level of inflammatory factors

注:與對照組相比,*P＜0.05；與模型組相比,＃P＜0.05。Note. Compared with control group,*P＜0.05. Compared with model group,＃P＜0.05.

分組 Groups 劑量(mg/kg)Dose TNF-α(ng/mL) IL-6(ng/mL) IL-1β(ng/mL)對照組Control group - 79.87±14.70 138.05±12.51 96.64±13.37模型組Model group - 439.53±37.24* 579.07±58.39* 625.58±61.35*苦杏仁苷低劑量組Amygdalin low-dose group 20 394.45±31.85 425.29±34.72 563.80±53.36苦杏仁苷中劑量組Amygdalin middle-dose group 40 270.45±26.46＃ 371.73±32.25＃ 396.32±32.18?？嘈尤受崭邉┝拷MAmygdalin high-dose group 80 137.69±18.62＃ 309.74±23.38＃ 220.84±25.44＃柳氮磺嘧啶組Sulfasalazine group 300 98.49±17.64＃ 300.25±19.82＃ 169.79±12.32＃

2.4 苦杏仁苷劑量依賴性降低氧化應激水平

與對照組相比,模型組的 SOD、MDA、GSH-Px水平顯著升高(P＜0.05),與模型組相比,苦杏仁苷中、高劑量組和柳氮磺嘧啶組SOD、MDA、GSH-Px水平顯著下降(P＜0.05),提示苦杏仁苷有減緩氧化應激水平的作用,隨著劑量增加,減輕氧化應激水平的效果越顯著。 見表4。

表4 苦杏仁苷劑量依賴性降低氧化應激水平()Table 4 Amygdalin dose-dependently reduces oxidative stress levels

表4 苦杏仁苷劑量依賴性降低氧化應激水平()Table 4 Amygdalin dose-dependently reduces oxidative stress levels

注:與對照組相比,*P＜0.05；與模型組相比,＃P＜0.05。Note. Compared with control group,*P＜0.05. Compared with model group,＃P＜0.05.

分組Groups 劑量(mg/kg)Dose SOD(U/mg) MDA(U/mg) GSH-Px(U/mg)對照組Control group - 239.69±29.39 2.04±0.49 152.48±13.87模型組Model group - 86.62±10.19* 17.56±2.33* 54.90±2.57*苦杏仁苷低劑量組Amygdalin low-dose group 20 160.63±23.77 15.81±2.72 71.59±8.93苦杏仁苷中劑量組Amygdalin middle-dose group 40 188.08±15.91＃ 12.42±0.97＃ 96.22±6.96＃苦杏仁苷高劑量組Amygdalin high-dose group 80 223.59±25.51＃ 14.74±1.84＃ 109.03±11.67＃柳氮磺嘧啶組Sulfasalazine group 300 222.81±16.20＃ 8.54±1.36＃ 126.10±12.82＃

2.5 苦杏仁苷劑量依賴性降低 NLRP3、ASC、Caspase-1 蛋白表達

與對照組比,模型組的 NLRP3、ASC、Caspase-1表達水平顯著升高(P＜0.05),與模型組相比,苦杏仁苷中、高劑量組和柳氮磺嘧啶組 NLRP3、ASC、Caspase-1水平顯著下降(P＜0.05),說明苦杏仁苷可以通過調控 NLRP3、ASC、Caspase-1 等蛋白表達水平保護大鼠腸組織。 見圖3、表5。

表5 苦杏仁苷劑量依賴性降低NLRP3、ASC、Caspase-1 蛋白表達()Table 5 Amygdalin dose-dependently decreased NLRP3, ASC and Caspase-1 protein expression

表5 苦杏仁苷劑量依賴性降低NLRP3、ASC、Caspase-1 蛋白表達()Table 5 Amygdalin dose-dependently decreased NLRP3, ASC and Caspase-1 protein expression

注:與對照組相比,*P＜0.05；與模型組相比,＃P＜0.05。Note. Compared with control group,*P＜0.05. Compared with model group,＃P＜0.05.

分組Groups 劑量(mg/kg)Dose NLRP3 ASC Caspase-1對照組Control group - 0.02±0.01 0.01±0.01 0.01±0.01模型組Model group - 0.28±0.04* 0.26±0.06* 0.37±0.04*苦杏仁苷低劑量組Amygdalin low-dose group 20 0.25±0.04 0.25±0.05 0.33±0.05苦杏仁苷中劑量組Amygdalin middle-dose group 40 0.07±0.03＃ 0.11±0.04＃ 0.07±0.03?？嘈尤受崭邉┝拷MAmygdalin high-dose group 80 0.03±0.01＃ 0.04±0.02＃ 0.03±0.02＃柳氮磺嘧啶組Sulfasalazine group 300 0.02±0.01＃ 0.02±0.01＃ 0.02±0.02＃

圖3 腸組織細胞NLRP3、ASC、Caspase-1 蛋白表達圖譜Figure 3 Intestinal tissue cell NLRP3, ASC,Caspase-1 protein expression profile

3 討論

NEC 是新生兒期常見的嚴重消化道疾病,極低出生體重兒的 NEC 發(fā)病率為 7%,病死率可達30%[8]。 新生兒缺氧缺血、異常細菌定植、胎齡不足、配方奶喂養(yǎng)等被認為是NEC 發(fā)生的主要影響因素[9]。 苦杏仁苷取自于杏仁,在薔薇科植物的成熟干燥種子廣泛存在。 有研究顯示,苦杏仁苷有抗腫瘤、抑制炎癥、抑制組織損傷的作用[10-11]。 本研究結果顯示,與對照組相比,模型組大鼠體重顯著下降,腸組織損傷評分顯著增加；與模型組相比,苦杏仁苷中劑量組、苦杏仁苷高劑量組、柳氮磺嘧啶組大鼠體重顯著上升,腸組織損傷評分顯著下降,與上述研究結論相符,說明苦杏仁苷與柳氮磺嘧啶作用相近,可以抑制腸組織損傷恢復大鼠體重,且與苦杏仁苷濃度呈正相關。

苦杏仁苷在機體內通過白糖昔酶作用分解,從而釋放出氰化物,氰化物本身具有很強的細胞毒性,可抑制線粒體的功能,拮抗炎癥因子延緩細胞凋亡[10]。 有研究顯示,苦杏仁苷可以通過JAK2-STAT3 通路促進T 淋巴細胞增殖,進而縮短細胞分裂周期,增強細胞干擾和殺傷性細胞因子的分泌。 苦杏仁苷經抗 CEA-單抗-葡萄糖苷酶偶聯物特異激活后,可以促進癌細胞凋亡,對癌細胞具有靶向細胞毒作用[12]。 TUNEL 法檢測結果顯示,與對照組相比,模型組的細胞凋亡率顯著升高,與模型組相比,苦杏仁苷中劑量組、苦杏仁苷高劑量組、柳氮磺嘧啶組細胞凋亡率顯著下降。本研究說明苦杏仁苷可以改善細胞凋亡,且與苦杏仁苷濃度呈正相關。

本研究結果顯示,與對照組相比,模型組的TNF-α、IL-6、IL-1β 顯著升高；與模型組相比,苦杏仁苷中劑量組、苦杏仁苷高劑量組、柳氮磺嘧啶組TNF-α、IL-6、IL-1β 顯著下降。 TNF-α、IL-6、IL-1β常被作為臨床炎癥反應指標,對炎癥的發(fā)展有預示作用[13]。 既往研究顯示,腦組織損傷嚴重的大鼠伴隨血清中 IL-6、IL-1β、TNF-α 等炎癥因子水平升高,提示組織損傷可能與血清炎癥水平較高有關,當炎癥水平降低后,組織病理損傷和細胞凋亡發(fā)生好轉[14]。 有研究顯示,苦杏仁苷可以拮抗炎癥因子誘導、促進細胞的凋亡,苦杏仁苷對多種炎性疾病有緩解作用,可明顯降低炎性因子[15]。 結合本研究說明苦杏仁苷降低了腸組織細胞中的炎癥反應,促進腸道細胞恢復。

本研究結果顯示,與對照組相比,模型組的SOD、MDA、GSH-Px 水平顯著升高；與模型組相比,苦杏仁苷中劑量組、苦杏仁苷高劑量組、柳氮磺嘧啶組 SOD、MDA、GSH-Px 水平顯著下降。 既往研究顯示,苦杏仁苷可以通過抑制氧化應激及炎癥反應減輕肝纖維化[16]、抑制腫瘤的作用。 SOD、GSH-Px作為自由基解毒酶可以清除機體氧自由基,自由基清除與產生之間的平衡對機體正常運轉、抗衰老、抗病理變化起到重要作用,測定氧化應激反應的代謝產物MDA 可以進一步了解機體過氧化損傷的情況[17]。 本研究中 SOD、MDA、GSH-Px 水平顯著下降提示了,苦杏仁苷中可能通過抑制組織細胞的氧化應激反應緩解炎癥反應,保護腸組織。

本研究結果顯示,與對照組相比,模型組的NLRP3、ASC、Caspase-1 表達水平顯著升高；與模型組相比,苦杏仁苷中劑量組、苦杏仁苷高劑量組、柳氮磺嘧啶組NLRP3、ASC、Caspase-1 水平顯著下降。有研究顯示,ASC、Caspase-1 可導致NLRP3 的激活,參與組織損傷的發(fā)生、發(fā)展。 受體蛋白NLRP3、凋亡相關點樣蛋白 ASC、Caspase-1 均是 NLRP3 炎性小體的組成部分,收到外來刺激時,ASC 使 pro-Caspase-1 轉化為有活性的Caspase-1,進而促進pro-IL-1 和 pro-IL-18 向白細胞介素1(IL-1)、白細胞介素18(IL-18)轉化,增加了 IL-1、IL-18 含量,介導炎癥反應的發(fā)生[18-19]。 結合本研究結果說明苦杏仁苷可以通過調控 NLRP3、ASC、Caspase-1 來緩解炎癥反應,改善腸組織損傷。

綜上所述,苦杏仁苷對新生大鼠壞死性小腸結腸炎有一定保護作用,可以有效減少腸組織損傷、降低機體炎癥反應、氧化應激反應,減少腸組織細胞凋亡率,但具體的反應機制尚不夠明確,有待臨床進一步探究。