楊志強陳 路張雅茜夏先學

(川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院骨科,四川南充 637000)

骨肉瘤主要發(fā)生在兒童和青少年中,是最常見的原發(fā)性骨惡性腫瘤類型[1]。 目前,骨肉瘤的治療方法包括新輔助化療、外科手術(shù)切除、介入療法以及冷熱消融。 但是,由于肺轉(zhuǎn)移和對化療的耐藥性,骨肉瘤的5 年生存率很難達到80%[2]。 此外,目前批準的藥物表現(xiàn)出嚴重的副作用。 因此,需要在OS 治療中開發(fā)具有更高效率和降低毒性的新型藥物。 紫草素(shikonin,SK)是從中草藥紫草中提純的天然萘醌成分(化學結(jié)構(gòu)式如圖1 所示),具有廣泛的生物學活性,包括抗炎、增強機體免疫力等。研究表明,紫草素對口腔癌、肝細胞癌等均具有抑癌作用[3-5]。 繆明星等[6]發(fā)現(xiàn)SK 通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激蛋白抑制人骨肉瘤U2OS 細胞的增殖。 Yang 等[7]研究發(fā)現(xiàn) SK 通過上調(diào)骨肉瘤中的 caspase-3 和caspase-8 來促進阿霉素誘導的凋亡,Deng 等[8]研究發(fā)現(xiàn)SK 通過抑制MMP13 抑制骨肉瘤的浸潤。 上述研究結(jié)果表明SK 在骨肉瘤中主要是通過抗增殖、侵襲及促凋亡發(fā)揮抗癌作用,但SK 對骨肉瘤干細胞樣特征未曾報道。 本研究不僅發(fā)現(xiàn)SK 對骨肉瘤生長、侵襲的抑制作用,而且發(fā)現(xiàn)SK 抑制骨肉瘤的干細胞樣特征,并進一步證實SK 通過抑制PI3K/AKT 途徑發(fā)揮抗骨肉瘤的作用。

圖1 紫草素結(jié)構(gòu)式Figure 1 Structure formula of shikonin

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 細胞

人骨肉瘤細胞株MG-63、U2OS 和人成骨細胞HFOB1.19 購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)。所有細胞在含有10%FBS,100 U/mL 的青霉素和100 μg/mL 的鏈霉素的 DMEM 培養(yǎng)基中,于 37℃、5% CO2的潮濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.1.2 實驗動物

14 只 SPF 級雄性 BALB/c 裸鼠(4 ～ 5 周齡,15～18 g)由川北醫(yī)學院提供[SCXK(川)2018-18]。將裸鼠飼養(yǎng)于川北醫(yī)學院SPF 動物房中并在該處完成動物實驗[SYXK(川)2018-076],房間溫度控制在23℃～27℃,濕度維持在50%～60%,光照時間12 h,并喂以水和標準實驗室食物。 在實驗之前,所有小鼠適應環(huán)境1 周。 實驗經(jīng)北川動物倫理委員會審核批準(IACUC-20200316-03),所有實驗操作遵循3R 原則。

1.2 主要試劑與儀器

紫草素(＞97%,shikonin,SK)(貨號:E-0403)購自上海同田生物技術(shù)有限公司；胎牛血清(FBS)、鏈霉素和青霉素購自美國Gibco 公司；B27 購自美國Invitrogen；人表皮生長因子(EGF)人成纖維生長因子(bFGF)購自美國 Pepro Tech 公司；CCK-8 試劑盒、RIPA 裂解液、ECL 發(fā)光液和BCA 試劑盒購自上海碧云天公司；PVDF 膜購自美國Millipore 公司；兔抗B 細胞淋巴瘤2(Bcl-2)(ab182858)、B 細胞淋巴瘤2 相關(guān)的X 蛋白(Bax)(ab32503)、兔抗磷酸化磷脂酰肌醇 3-激酶(p-phosphoinositide 3-kinase,p-PI3K)(ab278545)、兔抗 SOX-2 抗體(ab92494),兔抗 OCT-4 抗 體 (ab200834)、 兔 抗 Nanog 抗 體(ab109250)、Ki67(ab92742)和 HRP 偶聯(lián)的山羊抗兔IgG 抗體(ab6721)購自英國Abcam 公司；兔抗β-肌動蛋白(β-actin)(＃4970)；兔抗胱天蛋白酶-3(caspase-3,cas3)(＃9662)、兔抗活化胱天蛋白酶-3(cleaved cas3)(＃9664)、兔抗蛋白激酶 B(protein kinase B,AKT)(＃9272)、兔抗 p-AKT(＃4060)和PI3K(＃4255)；胰島素樣生長因子1(IGF-1)(bs-4588P)購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。 iMark酶標儀及蛋白電泳設(shè)備(美國Bio-Rad)；Accuri C6流式細胞儀(美國BD Biosciences)；BX43 熒光顯微鏡(日本奧林巴斯公司)；TanoN5200 凝膠成像儀(上海天能公司)。

1.3 方法

1.3.1 CCK-8 試驗檢測細胞活力

將人成骨細胞HFOB1.19 及人骨肉瘤U2OS 和MG63 細胞接種到含有100 μL 完全培養(yǎng)基的96 孔板(每孔 5×103細胞)中,培養(yǎng) 24 h。 然后,用 100 μL 含有不同濃度SK 的新鮮培養(yǎng)基處理24 h 或用含有 SK 1 μmol/L 的培養(yǎng)基分別處理 24、48 和 72 h后,向每個孔中加入10 μL CCK-8,37℃孵育2 h,使用酶標儀測量450 nm 處的吸光度。

1.3.2 克隆形成實驗檢測細胞增殖

將骨肉瘤U2OS 細胞(每孔500 個細胞)接種到6 孔板中,培養(yǎng)過夜。 分別用 SK 0、0.01、0.1 和 1 μmol/L 處理48 h,再常規(guī)培養(yǎng)6 d。 用4%多聚甲醛固定細胞集落,然后用0.1%結(jié)晶紫染色,顯微鏡下觀察。

1.3.3 流式細胞檢測細胞凋亡

收集紫草素 SK 0、0.01、0.1 和 1 μmol/L 處理24 h 后的 U2OS 細胞,并用冷 PBS 洗滌 3 次,然后在暗室中孵育Annexin V-FITC(5 μL)和 PI(5 μL)15 min。 隨后,使用流式細胞儀分析細胞。

1.3.4 Western blot 檢測蛋白表達

使用冷RIPA 緩沖液裂解細胞,并在4℃離心,收集上清液。 BCA 蛋白質(zhì)測定試劑盒檢測蛋白質(zhì)濃度。 通過SDS-PAGE 分離等量(40 μg)的總蛋白質(zhì),并轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上,封閉膜并與相應的一抗(β-actin 1 ∶1000、Bcl-2 1 ∶2000、Bax 1 ∶1000、cleaved caspase-3 1 ∶1000、Ki67 1 ∶1000、p-AKT1 ∶2000、AKT 1 ∶1000、p-PI3K 1 ∶ 1000、 PI3K 1 ∶1000、SOX-2 1 ∶1000、OCT-4 1 ∶10000 和 Nanog 1 ∶1000)在4℃下孵育過夜,然后與辣根過氧化物酶偶聯(lián)的山羊抗兔IgG(1 ∶2000)在室溫下孵育2 h,通過ECL 發(fā)光液顯影,使用Image J 軟件進行條帶灰度值分析。

1.3.5 細胞成球?qū)嶒?/p>

將U2OS 細胞以2000 細胞/孔的密度接種到6孔超低附著板中,在含有1% B27 補充劑,10 ng/mL人 EGF 和 10 ng/mL 人 bFGF 的無血清 DMEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)。 1 周后,觀察球體并通過顯微鏡拍攝照片。

1.3.6 驗證SK 對U2OS 細胞的作用機制

將 U2OS 細胞分為對照組,SK 1 μmol/L 組,IGF-1 組和 SK 1 μmol/L+IGF-1 組,用 PI3K 途徑特異性激活劑 IGF-1(10 nmol/mL)將 IGF-1 和 SK 1 μmol/L+IGF-1 組中的細胞預處理12 h。 然后進行上述實驗。

1.3.7 移植瘤實驗

將約 3×106U2OS 細胞懸浮在 100 μL PBS 中,皮下接種到裸鼠的右側(cè)腹中。 注射后3 d,將小鼠隨機分為對照組,SK 2 mg/kg 組[9],每組7 只,SK 2 mg/kg 組每隔 1 d 腹膜內(nèi)注射 100 μL SK(2 mg/kg),對照組注射等量的生理鹽水。 每3 d 測量1 次腫瘤的長度和寬度,通過公式V=1/2(寬度2×長度)計算腫瘤體積。 實驗結(jié)束時,切除腫瘤并稱重。 固定腫瘤并包埋在石蠟中,切成薄片。

1.3.8 免疫組化染色檢測p-AKT 和Ki67 的表達

將組織切片在二甲苯中脫蠟,使用梯度乙醇水化,然后用3% H2O2處理15 min。 使用沸騰的檸檬酸鈉緩沖液(pH 6.0)提取抗原,10 min 后將組織切片與10%山羊血清孵育15 min,并與p-AKT(1 ∶100)和 Ki67(1 ∶500)的一抗在 4℃孵育過夜。 將載玻片用 PBS 洗滌3 次,使用二抗(1 ∶500)在37℃下孵育切片30 min,并用蘇木素復染細胞核。

1.3.9 TUNEL 染色檢測瘤組織細胞凋亡

將腫瘤組織切片脫蠟和水合后,用PBS 沖洗2次,然后在37℃下與20 μg/mL 蛋白酶K 一起孵育25 min,PBS 洗滌3 次。 按照制造商的說明,將所有切片與TUNEL 混合物一起孵育,顯微鏡下觀察組織切片。

1.4 統(tǒng)計學方法

使用GraphPad Prism 5 進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。 所有數(shù)據(jù)均顯示為至少3 次獨立實驗的平均數(shù)±標準差( ˉx±s),使用Student’st檢驗進行兩組之間的比較。P＜0.05 被認為具有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 SK 抑制骨肉瘤細胞增殖

如圖2A、2B 所示,SK 對人成骨細胞HFOB1.19無明顯細胞毒性,對骨肉瘤細胞MG63 和U2OS 均具有明顯的細胞毒性作用(P＜0.05),且隨著SK 濃度和處理時間的增加而增強。 選擇對SK 更為敏感的U2OS 細胞系,SK 濃度為 0、0.01、0.1 和1 μmol/L繼續(xù)研究。與 SK 0 μmol/L 組比較, SK 0.1 和1 μmol/L明顯抑制U2OS 細胞的克隆形成(圖2C)。

圖2 SK 對骨肉瘤細胞增殖的影響Note. A, Effect of different concentrations of SK on the viability of human osteoblasts and osteosarcoma cells. B, Effect of SK on the viability of human osteoblasts and osteosarcoma cells at different times. C,Colony forming rate of U2OS cells in each group. Compared with SK 0 μmol/L group,*P＜0.05.Compared with 0 h group,＃P＜0.05.Figure 2 Effect of SK on the proliferation of osteosarcoma cells

2.2 SK 促進骨肉瘤細胞凋亡

如圖 3 所示,與 SK 0 μmol/L 組比較,SK 0.1 和1 μmol/L 組 U2OS 細胞凋亡明顯增加(P＜0.05),Bax/Bcl-2 和cleaved cas3/cas3 比值均顯著上調(diào)(P＜0.05)。 SK 0.01 μmol/L 組無顯著性差異。

圖3 SK 對骨肉瘤細胞凋亡的影響Note. A, Flow cytometry was commended to detect the apoptosis rate of each group. B, Western blot was used to test the expression of apoptosis protein in each group. Compared with SK 0 μmol/L group,*P＜0.05.Figure 3 Effect of SK on apoptosis of osteosarcoma cells

2.3 SK 通過抑制PI3K/AKT 信號通路抑制骨肉瘤細胞生長

如圖 4 所示,與對照組比較,SK 1 μmol/L 組U2OS 細胞中PI3K 和AKT 蛋白磷酸化水平及Ki67表達水平顯著降低(P＜0.05),cleaved cas3/cas3 比值顯著上調(diào)(P＜0.05),IGF-1 組 PI3K 和 AKT 蛋白磷酸化水平及Ki67 和cleaved cas3/cas3 比值無顯著差異；與 SK 1 μmol/L 組比較,SK 1 μmol/L+IGF-1 組 p-AKT、p-PI3K 和 Ki67 蛋白表達明顯上調(diào)(P＜0.05),cleaved cas3/cas3 比值顯著下調(diào)(P＜0.05)。

圖4 SK 通過調(diào)控PI3K/AKT 信號通路對骨肉瘤細胞生長的影響Note. A, Western blot was performed to assay the protein expression in each group. B, Relative protein expression. Compared with the control group,*P＜0.05. Compared with the SK 1 μmol/L group,＃P＜0.05.Figure 4 Effect of SK on the growth of osteosarcoma cells by regulating the PI3K/AKT signaling pathway

2.4 SK 通過抑制PI3K/AKT 信號通路抑制骨肉瘤細胞的干細胞樣特征

如圖 5 所示,與對照組比較,SK 1 μmol/L 組U2OS 細胞成球數(shù)量減少,成球直徑減小(P＜0.05),SOX-2、OCT-4 和 Nanog 蛋白表達顯著下調(diào)(P＜0.05)；與 SK 1 μmol/L 組比較,SK 1 μmol/L+IGF-1 組U2OS 細胞成球數(shù)量增多,成球直徑增大(P＜0.05),SOX-2、OCT-4 和 Nanog 蛋白表達顯著上調(diào)(P＜0.05)。

圖5 SK 通過調(diào)控PI3K/AKT 信號通路對骨肉瘤細胞干細胞樣特征的影響Note. A, Cell spheroidization. B, Number of spheres of each group. C, Diameter of spheres of each group. D, Western blot was used to detect the expression of SOX-2, OCT-4 and Nanog protein in each group. E, Relative protein expression. Compared with the control group,*P＜0.05.Compared with the SK 1 μmol/L group,＃P＜0.05.Figure 5 Effect of SK on the stem cell-like characteristics of osteosarcoma cells by regulating the PI3K/AKT signaling pathway

2.5 SK 在體內(nèi)抑制骨肉瘤腫瘤的生長

如圖6 所示,與對照組比較,SK 2 mg/kg 組腫瘤質(zhì)量和體積明顯減小(P＜0.05),瘤組織中p-AKT和Ki67 的表達顯著降低(P＜0.05),凋亡細胞顯著增加(P＜0.05)。

圖6 SK 在體內(nèi)對骨肉瘤腫瘤生長的影響Note. A, Nude mouse transplanted tumor. B, Tumor volume. C, Tumor mass. D, p-AKT immunohistochemical staining. E, TUNEL staining was employed to measure tumor tissue cell apoptosis. F, Ki67 immunohistochemical staining. Compared with the control group,*P＜0.05.Figure 6 Effect of SK on the growth of osteosarcoma tumor in vivo

3 討論

輔助療法的出現(xiàn)和外科技術(shù)的進步,已使骨肉瘤患者的總生存率達到60%～75%[2]。 由于副作用和耐藥性的發(fā)展,目前的化學藥物受到限制。 因此,鑒定副作用較小的有效藥物對于骨肉瘤的治療至關(guān)重要。 SK 是中藥的主要活性成分之一,研究表明紫草素已被用作化療增敏劑,以增強傳統(tǒng)肝細胞癌化療藥物的抗癌作用,如三氧化二砷、多柔比星和順鉑[10-11]。 已有研究報道SK 通過抑制骨肉瘤細胞的侵襲和誘導凋亡在骨肉瘤中發(fā)揮著抑癌作用[7-8]。 本研究表明,SK 對人成骨細胞HFOB1.19為表現(xiàn)出明顯的細胞毒性,對骨肉瘤U2OS 和MG63細胞均表現(xiàn)出顯著的細胞毒性,且具有時間和濃度依賴性。 本研究結(jié)果表明SK 抑制U2OS 細胞增殖和骨肉瘤癌癥干細胞樣特征,誘導細胞凋亡,并進一步探究了SK 作用的相關(guān)分子機制。

Bax 是Bcl-2 家族的促凋亡成員,它形成的離子通道直接導致線粒體釋放細胞色素c,然后激活caspase-9 和 caspase-3,從而在末端誘導凋亡[12]。PI3K/AKT 途徑的激活可以促進各種人類癌癥的發(fā)展,例如卵巢癌、肺癌、黑色素瘤和淋巴瘤[13-14]。PI3K/AKT 途徑通過調(diào)節(jié)許多下游轉(zhuǎn)錄因子在癌癥的多個過程中(例如凋亡、增殖和轉(zhuǎn)移)起著至關(guān)重要的作用[15]。 我們發(fā)現(xiàn) SK 處理可誘導骨肉瘤U2OS 細胞明顯凋亡,并顯著上調(diào)cleaved cas3/cas3和 Bax/Bcl-2 比值。 此外,SK 明顯抑制 PI3K/Ak 通路激活及 Ki67 的表達,促進 cleaved cas3 表達,而PI3K 激活劑IGF-1 可顯著逆轉(zhuǎn)SK 對PI3K/AKT 通路及Ki67 表達的抑制以及SK 對cleaved cas3 的上調(diào)作用。 我們的體內(nèi)實驗結(jié)果表明SK 可明顯抑制體內(nèi)腫瘤的生長,降低瘤組織中p-AKT 和Ki67 的表達,誘導細胞凋亡。 因此,SK 可能是通過抑制PI3K/AKT 途徑抑制U2OS 細胞的生長,與之前的研究一致[16]。

越來越多的證據(jù)表明,骨肉瘤具有癌癥干細胞(CSC),這些亞群被認為與化學耐藥性,腫瘤轉(zhuǎn)移和復發(fā)有關(guān),這應該是開發(fā)新藥的有希望的目標[17-18]。 有證據(jù)表明PI3K/AKT 信號傳導途徑可調(diào)節(jié)干細胞標志物的表達以維持CSC 特性[19]。 多能干細胞因子,包括SOX-2、OCT-4 和Nanog,被確定為誘導多能干細胞形成的核心因子,并在維持正常和癌癥干細胞的干性中起關(guān)鍵作用[20]。 這些多能干細胞因子在癌細胞中的過表達被證明參與了腫瘤的發(fā)生,轉(zhuǎn)移和癌癥復發(fā)[21]。 我們的結(jié)果表明,SK 明顯抑制骨肉瘤干細胞樣性狀,細胞成球大小和直徑顯著減小,干細胞標記物 SOX-2、OCT-4 和Nanog 的表達顯著下調(diào),IGF-1 明顯逆轉(zhuǎn)SK 對干細胞樣特征的抑制作用。 因此,SK 可能是通過抑制PI3K/AKT 途徑抑制骨肉瘤干細胞樣特征。

基于體內(nèi)和體外實驗,該研究證明了SK 在骨肉瘤U2OS 細胞中發(fā)揮著抗癌作用,其潛在機制可能是通過抑制PI3K/AKT 途徑抑制U2OS 細胞的生長和干細胞樣特征并誘導細胞凋亡,提示SK 可能是抗人骨肉瘤的有前途的藥物。