張 燁，鄧 琦，魏 敏，付常清，張 旭*

(1.成都中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，四川 成都 611137；2.四川康和鼎盛大健康產(chǎn)業(yè)集團(tuán)有限公司，四川 成都 610000；3.四川斯力健農(nóng)業(yè)科技有限公司，四川 成都 641400)

明日葉(Angelica keiskei)為傘形科當(dāng)歸屬多年生草本植物，味甘，性溫，歸心、肝、大腸經(jīng)[1]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，其化學(xué)成分包括查爾酮、黃酮、香豆素、萜類等，具有增強(qiáng)人體免疫力、抗?jié)?、抗血栓、降膽固醇、降血脂、防癌變等功效?/p>

明日葉含有與人類健康密切相關(guān)的多種生理功效成分，極具開發(fā)價(jià)值。目前，我國(guó)明日葉僅南方種植產(chǎn)區(qū)種植，面積約1萬hm2，年產(chǎn)量500 kg左右[4]，其產(chǎn)品(明日葉保健茶、保健飲料、保健膠囊等)在市場(chǎng)流通[5]。近年來，已有研究采用多種色譜方法對(duì)明日葉化學(xué)成分進(jìn)行了化合物分離，但得到的化合物不超過20個(gè)；使用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)對(duì)明日葉進(jìn)行成分鑒定，僅鑒定了10余個(gè)查爾酮類成分。此外，關(guān)于明日葉的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究主要集中于查爾酮類化合物上，對(duì)明日葉質(zhì)量評(píng)價(jià)也以測(cè)定查爾酮類化合物中的4-羥基德里辛和黃色當(dāng)歸醇含量為主[14]。但明日葉化學(xué)成分復(fù)雜，僅少數(shù)查爾酮類成分難以對(duì)其質(zhì)量及藥效進(jìn)行全面、精準(zhǔn)地評(píng)價(jià)，且尚無關(guān)于明日葉的系統(tǒng)化學(xué)成分研究，基于此，建立一種靈敏、快速、準(zhǔn)確的方法全面分析鑒定明日葉中的化學(xué)成分，對(duì)其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升和藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究具有現(xiàn)實(shí)意義。

本實(shí)驗(yàn)采用超高效液相色譜-四極桿-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜(Ultra-High Performance Liquid Chromatography Coupled with Hybrid Quadrupole-Orbitrap High-Resolution Mass Spectrometry，UPLC-Q-Orbitrap HRMS)技術(shù)對(duì)明日葉的化學(xué)成分進(jìn)行快速分析，共鑒定了68個(gè)化合物，可為明日葉及其產(chǎn)品的質(zhì)量評(píng)價(jià)及藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供理論依據(jù)和方法學(xué)參考，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料

1.1 儀器

Vanquish型超高效液相色譜聯(lián)用Q-Exactive型四極桿-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜儀(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)，BT-40E型超聲波清洗器(成都雅源科技有限公司)，BAS124S型1/1萬電子天平和BT125Max型1/10萬分析天平(賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司)，SL-100型高速多功能粉碎機(jī)(上海冰都電器有限公司)。

1.2 藥品與試劑

對(duì)照品：均購(gòu)于成都埃法生物科技有限公司，包括補(bǔ)骨脂素、花椒毒素、異補(bǔ)骨脂素、佛手苷內(nèi)酯、7-去甲基軟木花椒素、異歐前胡素、水合氧化前胡素、甘草素、蔗糖(批號(hào)分別為AF9061521、AF9-022001、AF20071051、AF20060853、AF9121302、AF20021922、AF9111051、AF20050152、AF2007-1052，質(zhì)量分?jǐn)?shù)均≥98%。甲醇、甲酸均為色譜純，分別購(gòu)自美國(guó)Fisher公司和德國(guó)CNW科技公司；水為純凈水，購(gòu)自杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司。

1.3 藥材

明日葉(批號(hào)：20200603)購(gòu)于四川斯力建農(nóng)業(yè)科技有限公司，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院龍飛副教授鑒定為多年生草本植物傘形科當(dāng)歸屬明日葉(Angelica keiskei)的干燥莖葉。

2 方法

2.1 色譜條件

WatersACQUITY UPLC BEH-C18色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)；流動(dòng)相為0.1%甲酸溶液(A)-甲醇(B)，梯度洗脫：0-6 min，20%B～50%B；7-12 min，65% B～75% B；13-23 min，90% B～100% B；23-28 min，100%B；流速：0.15 mL/min；柱溫：30 ℃，進(jìn)樣量：3 μL。

2.2 質(zhì)譜條件

采用電噴霧離子源(ESI)，正、負(fù)離子監(jiān)測(cè)模式；質(zhì)量掃描范圍m/z100～1 500；裂解電壓(+)3.50 kV、(-)3.00 kV；鞘氣流速35 L/min；輔助氣流量10 L/min；離子傳輸管溫度320 ℃；輔助氣溫度350 ℃；掃描模式：Full MS/dd-MS2；Full MS分辨率70 000，dd-MS2分辨率17 500。MS/MS模式時(shí)，正離子模式下的碰撞能分別為20、40、60 eV，負(fù)離子模式下的碰撞能分別為20、40、60 eV。

2.3 供試品溶液制備

將干燥的明日葉粉碎，稱取適量本品粉末(過二號(hào)篩)約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，稱定重量，浸泡1 h，超聲處理(250 W、40 kHz)30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，進(jìn)樣前用0.22 μm 微孔濾膜濾過。

2.4 對(duì)照品溶液配制

取補(bǔ)骨脂素、花椒毒素、異補(bǔ)骨脂素、佛手苷內(nèi)酯、7-去甲基軟木花椒素、異歐前胡素、水合氧化前胡素、甘草素、蔗糖對(duì)照品適量，加甲醇超聲溶解，定容至25 mL，配置成質(zhì)量濃度約為0.05 mg/mL的單一對(duì)照品溶液置于4 ℃冰箱中保存，進(jìn)樣前過0.22 μm微孔濾膜。

2.5 數(shù)據(jù)處理

將高分辨質(zhì)譜采集的原始數(shù)據(jù)導(dǎo)入Thermo Compound Discover(CD)3.0分析軟件進(jìn)行初步計(jì)算，設(shè)置CD向?qū)?、?chuàng)建方法模板，建立未知化合物的鑒定流程，對(duì)采集的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行峰對(duì)齊和峰提取，結(jié)合mzCloud、mzVault、Chemspider網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)及本地中藥成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)OTCML，將提取得到的分子離子色譜峰、同位素峰擬合出可能的分子式，與特征碎片離子信息實(shí)測(cè)譜圖進(jìn)行匹配。對(duì)匹配出的結(jié)果設(shè)置過濾參數(shù)：峰面積閾值80 000，一級(jí)及二級(jí)質(zhì)量偏差不得大于5×10-6，匹配度分值高于80，從而初步篩選得出明日葉中可能存在的化合物。對(duì)篩選得到的離子及數(shù)據(jù)庫(kù)中的化合物信息與相關(guān)文獻(xiàn)或?qū)φ掌愤M(jìn)行比對(duì)，進(jìn)行化合物分析鑒定[15]。

3 結(jié)果

3.1 UPLC-Q-Orbitrap HRMS分析結(jié)果

取上述供試品溶液，按“2.2項(xiàng)下條件”對(duì)明日葉甲醇提取液在正離子模式下的總離子流色譜見圖1；在負(fù)離子模式下的總離子流色譜見圖2。在正、負(fù)離子模式下，供試品溶液分離效果及離子化效率良好。

圖1 明日葉甲醇提取液UPLC-Q-Orbitrap HRMS正離子模式總離子流色譜

圖2 明日葉甲醇提取液UPLC-Q-Orbitrap HRMS負(fù)離子模式總離子流色譜

3.2 UPLC-Q-Orbitrap HRMS鑒定結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)從明日葉中共鑒定了68個(gè)化合物，包含12個(gè)查爾酮類，17個(gè)黃酮類，18個(gè)香豆素類，1個(gè)萜類，2個(gè)寡糖類，5個(gè)氨基酸類，6個(gè)有機(jī)酸類，7個(gè)其他類化合物，其中34個(gè)成分首次從明日葉中鑒定得到。對(duì)明日葉甲醇提取液進(jìn)行正離子模式分析鑒定的成分見表1；負(fù)離子模式分析鑒定的成分見表2。

表1 明日葉甲醇提取液UPLC-Q-Orbitrap HRMS正離子模式總離子流色譜

表2 明日葉甲醇提取物UPLC-Q-Orbitrap HRMS負(fù)離子模式數(shù)據(jù)及成分鑒定

3.3 UPLC-Q-Orbitrap HRMS化學(xué)成分的質(zhì)譜解析

3.3.1 查爾酮類化合物的裂解特征 查爾酮類化合物是明日葉主要活性成分[5]。本實(shí)驗(yàn)從明日葉甲醇提取液中共鑒定了12個(gè)查爾酮類化合物，包括7種黃色當(dāng)歸醇以及其他5種查爾酮苷元。在質(zhì)譜碎裂過程中，查爾酮類化合物的斷裂方式主要發(fā)生RDA裂解和丟失HCHO等中性離子。以化合物39為例，正離子模式下形成質(zhì)子化準(zhǔn)分子離子[M+H]+m/z339.1593，預(yù)測(cè)其分子式為C21H22O4，在二級(jí)質(zhì)譜中可見其發(fā)生RDA裂解，形成碎片離子[M+H-C4H8]+m/z283.096 6，[1，3A+H]+m/z181.049 7，[1，4B+H]+m/z163.039 1，[1，4B+H-HCHO]+m/z133.028 6。根據(jù)化合物的二級(jí)質(zhì)譜裂解特征，經(jīng)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索并與文獻(xiàn)比對(duì)，推斷其為4-羥基德里辛，裂解規(guī)律見圖3。

圖 3 4-羥基德里辛質(zhì)譜裂解途徑

3.3.2 黃酮類化合物裂解特征 黃酮類化合物在植物界分布廣泛[2]，在植物體內(nèi)其大部分與糖結(jié)合成苷類或以碳糖基的形式存在，也有以游離形式存在的。本實(shí)驗(yàn)從明日葉甲醇提取液中共鑒定了17個(gè)黃酮類化合物，包括8種黃酮苷及9種黃酮苷元，其中，甘草素經(jīng)與對(duì)照品比對(duì)而準(zhǔn)確鑒定。黃酮類化合物在質(zhì)譜條件下的斷裂方式主要有CO、CO2、H2O等中性離子丟失與1，3A+、0，2A+、1，3B+、0，2B+等RDA裂解及糖基的斷裂[16]。以化合物23為例，正離子模式下形成質(zhì)子化準(zhǔn)分子離子[M+H]+m/z257.080 9，預(yù)測(cè)其分子式為C15H12O4，在二級(jí)質(zhì)譜中可見其發(fā)生RDA裂解，形成碎片離子[1，4B-H2+H]+m/z147.044 2，[1，3A+H]+m/z137.023 5，[1，4B-H2+H-CO]+m/z119.049 5。根據(jù)化合物的二級(jí)質(zhì)譜裂解特征，經(jīng)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索及與對(duì)照品保留時(shí)間比對(duì)，鑒定其為甘草素，裂解規(guī)律見圖4。

圖 4 甘草素質(zhì)譜裂解途徑

3.3.3 香豆素類化合物的裂解特征 香豆素類化合物是明日葉的藥效成分之一[2]。本實(shí)驗(yàn)從明日葉甲醇提取液中共鑒定了18個(gè)香豆素類化合物，包括4種簡(jiǎn)單香豆素，8種線性香豆素，2種角型呋喃香豆素，2種線性吡喃香豆素和2種角型吡喃香豆素。香豆素類化合物由于有較好的共軛系統(tǒng)，在ESI電噴霧質(zhì)譜中，其斷裂方式主要有CO、CO2等中性離子的丟失。例如：化合物18在正離子模式下形成質(zhì)子化準(zhǔn)分子離子[M+H]+m/z305.102 1，預(yù)測(cè)其分子式為C16H16O6，二級(jí)質(zhì)譜中可見[M+H-C5H10O2]+m/z203.033 9，[M+H-C5H10O2-CO-CO]+m/z147.044 2，[M+H-C5H10O2-CO-CO2]+m/z131.049 4。根據(jù)化合物的二級(jí)質(zhì)譜裂解特征，經(jīng)過數(shù)據(jù)庫(kù)檢索及與對(duì)照品保留時(shí)間比對(duì)，鑒定其為水合氧化前胡素，裂解規(guī)律見圖5。

圖5 水合氧化前胡素質(zhì)譜裂解途徑

3.3.4 萜類化合物的裂解特征 明日葉中萜類成分也具有藥理作用[2]。本實(shí)驗(yàn)從明日葉中鑒定了1個(gè)萜類化合物，化合物35在正離子模式下形成質(zhì)子化準(zhǔn)分子離子[M+H]+m/z235.169 4，預(yù)測(cè)其分子式為C15H22O2，二級(jí)質(zhì)譜中可見[M+H-O]+m/z219.137 5，[M+H-O-C3H4]+m/z179.106 8。根據(jù)化合物的二級(jí)質(zhì)譜裂解特征，經(jīng)過數(shù)據(jù)庫(kù)檢索及與文獻(xiàn)比對(duì)，推斷其為Ashitabaol A，裂解規(guī)律見圖6。

圖 6 Ashitabaol A質(zhì)譜裂解途徑

3.3.5 寡糖類化合物的裂解特征 本實(shí)驗(yàn)從明日葉中共鑒定了2個(gè)寡糖類化合物。寡糖類二級(jí)質(zhì)譜裂解特征主要為丟失H2O。以化合物43為例，負(fù)離子模式下形成準(zhǔn)分子離子[M-H]-m/z341.108 9，預(yù)測(cè)其分子式為C12H22O11，二級(jí)質(zhì)譜中可見[M-H-C6H10O5]-m/z179.055 6，[M-H-C6H10O5-H2O]-m/z161.044 9，根據(jù)化合物的二級(jí)質(zhì)譜裂解特征，經(jīng)過數(shù)據(jù)庫(kù)檢索及與對(duì)照品保留時(shí)間比對(duì)，鑒定其為蔗糖，裂解規(guī)律見圖7。

圖7 蔗糖質(zhì)譜裂解途徑

3.3.6 氨基酸類化合物的裂解特征 本實(shí)驗(yàn)從明日葉中共鑒定了5個(gè)氨基酸類化合物。二級(jí)質(zhì)譜裂解特征主要為丟失NH3、HCOOH中性離子。以化合物4為例，正離子下可形成質(zhì)子化準(zhǔn)分子離子[M+H]+m/z166.086 2，預(yù)測(cè)其分子式為C9H11NO2，二級(jí)質(zhì)譜中可見[M+H-NH3]+m/z149.059 7，[M+H-HCOOH]+m/z120.081 0，[M+H-NH3-HCOOH]+m/z103.0547，根據(jù)化合物的二級(jí)質(zhì)譜裂解特征，經(jīng)過數(shù)據(jù)庫(kù)檢索及與文獻(xiàn)[17]比對(duì)，推斷其為苯丙氨酸，裂解規(guī)律見圖8。

圖8 苯丙氨酸質(zhì)譜裂解途徑

3.3.7 有機(jī)酸類化合物的裂解特征 本實(shí)驗(yàn)從明日葉中共鑒定了6個(gè)有機(jī)酸類化合物，二級(jí)質(zhì)譜裂解特征主要丟失H2O、CO2中性離子。例如，化合物58在負(fù)離子模式下形成準(zhǔn)分子離子[M-H]-m/z201.112 7，預(yù)測(cè)其分子式為C10H18O4，二級(jí)質(zhì)譜中可見[M-H-H2O]-m/z183.102 1，[M-H-H2O-CO2]-m/z139.112 0，根據(jù)化合物的二級(jí)質(zhì)譜裂解特征，經(jīng)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索及與文獻(xiàn)[18]比對(duì)，推斷其為癸二酸，裂解規(guī)律見圖9。

圖9 癸二酸質(zhì)譜裂解途徑

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)基于UPLC-Q-Orbitrap HRMS技術(shù)，選擇流動(dòng)相0.1%甲酸溶液-甲醇梯度洗脫，并對(duì)明日葉中的化學(xué)成分進(jìn)行了分析鑒定。通過比較明日葉中的化合物在正、負(fù)離子模式下的總離子流圖，發(fā)現(xiàn)正、負(fù)離子模式下均有較好的響應(yīng)，較為全面地闡明了明日葉的化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)，可為其質(zhì)量評(píng)價(jià)及藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供理論依據(jù)和方法學(xué)參考。

從鑒定結(jié)果看，本實(shí)驗(yàn)從明日葉中初步鑒定了68個(gè)化合物，其化學(xué)成分大致分為7大類，其中查爾酮類、黃酮類、香豆素類成分具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎、抗病毒、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗糖尿病、降血壓、降膽固醇和改善神經(jīng)系統(tǒng)功能等藥理活性[5]，提示明日葉極具開發(fā)前景。與已報(bào)道的明日葉化學(xué)成分研究相比，34個(gè)成分首次從明日葉中鑒定得到，進(jìn)一步豐富、完善了明日葉的化學(xué)成分庫(kù)。此外，已鑒定的花椒毒素、美洲花椒素、佛手酚和絲立尼亭等香豆素類化合物，葛根素等黃酮類化合物質(zhì)譜響應(yīng)值高，且這些化合物分別具有降糖、抗炎[25]、防癌[26]等藥理活性，可考慮作為明日葉質(zhì)量評(píng)價(jià)的候選指標(biāo)。