馮 曦，張千千，丁志高，周 潔，趙碧清

(湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410208)

檵木葉為金縷梅科植物檵木Loropetalumchinense(R.Br.)Oliv.的干燥葉，是常用的民間藥，具有清熱解毒、收斂、止血的功效，用于治療燒、燙傷，外傷出血、吐血，崩漏，腹瀉[1]。《植物名實(shí)圖考》記載：檵木“搗爛敷刀刺傷，能止血”[2]。《湖南藥物志》中也有檵木藥用的記載[3]，其根、葉、花均可入藥。

白花檵木為檵木的別稱，在長(zhǎng)江中下游地區(qū)山野及丘陵灌叢中有廣泛分布，紅花檵木則由檵木變種而來，也是重要的民間藥用資源[4]。檵木中藥用活性成分包括揮發(fā)油[5-6]、鞣質(zhì)、黃酮類、木脂素類和萜類等[7]，其中黃酮類化合物是檵木葉中含量較高的一類物質(zhì)，含有槲皮素、山柰酚等[8]。有研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素具有抗氧化、抗炎、抗癌以及抗纖維化等藥理作用[9]，山柰酚具有抗癌、抗氧化、抗病毒、抗炎、抗菌以及降血糖等藥理作用[10]。目前，對(duì)檵木葉的研究較多[11-15]，但未見關(guān)于紅花檵木葉、白花檵木葉中槲皮素、山柰酚含量隨生長(zhǎng)期變化的研究，以及其含量差異比較的研究。由于白花檵木葉、紅花檵木葉的采收期并不明確，故本研究采用高效液相色譜法考察白花檵木葉、紅花檵木葉中兩種黃酮類成分槲皮素、山柰酚的含量，并研究其含量隨生長(zhǎng)期變化的情況，考察不同時(shí)期兩種檵木葉中槲皮素、山柰酚的含量差異，以確定白花檵木葉、紅花檵木葉的最佳采收期，也為紅花檵木葉能否替代白花檵木葉藥用提供可靠的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-20A高效液相色譜儀(日本島津公司)；CP214 型電子天平(萬分之一，奧豪斯儀器(常州)有限公司)；JE1002型電子天平(百分之一，上海浦春計(jì)量?jī)x器有限公司)；FW177中草藥粉碎機(jī)(天津市泰斯特儀器有限公司)；雙列式電熱恒溫水浴鍋(琴臺(tái)醫(yī)療器械廠)；AS系列超聲波清洗機(jī)(220 V/50 Hz)(天津奧特賽恩斯儀器有限公司)。

1.2 試藥

槲皮素對(duì)照品(批號(hào)：CHB190117，成都克洛瑪生物科技有限公司，純度≥98%)；山柰酚對(duì)照品(批號(hào)：CHB190127，成都克洛瑪生物科技有限公司，純度≥98%)；乙腈為色譜純，水為二次蒸餾水，其他試劑均為分析純。

不同月份的白花檵木葉、紅花檵木葉于2019年采自湖南中醫(yī)藥大學(xué)校園內(nèi)，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥鑒定教研室周小江教授鑒定為正品。

2 方法與結(jié)果

2.1 高效液相色譜法測(cè)定紅花檵木葉、白花檵木葉中槲皮素、山柰酚含量

2.1.1 色譜條件 Agilent Eclipse XDB-C18分析柱(4.6 mm×250 mm，5μm)；流動(dòng)相為乙腈-0.4%磷酸水溶液(30∶70)，等度洗脫，流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)360 nm；柱溫30 ℃?；旌蠈?duì)照液進(jìn)樣體積為10 μL，供試品溶液進(jìn)樣體積為20 μL，色譜見圖1。

注：1.槲皮素；2.山柰酚。

2.1.2 混合對(duì)照品溶液制備 精密稱取干燥至恒重的槲皮素、山柰酚對(duì)照品適量，分別加甲醇制成每1 mL含槲皮素1.38 mg、山柰酚1.65 mg的對(duì)照品貯備液。精密吸取各對(duì)照品貯備液適量，加甲醇稀釋成每1 mL中含槲皮素 27.6 μg、山柰酚33.0 μg的混合對(duì)照品溶液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.1.3 供試品溶液制備 精密稱取檵木葉細(xì)粉1.0 g于錐形瓶中，精密加入80%甲醇50 mL，稱定重量，加熱回流1 h，放冷，再稱定重量，以80%甲醇補(bǔ)足減失的重量，濾過，精密吸取續(xù)濾液25 mL于錐形瓶中，加入5%鹽酸10 mL及甲醇5 mL，水浴回流30 min，取出，放冷，轉(zhuǎn)移至50 mL量瓶中，定容，搖勻，過0.45 μm微孔濾膜，即得。

2.1.4 方法學(xué)考察 (1)線性關(guān)系考察。精密移取槲皮素、山柰酚對(duì)照品貯備液適量，依次逐級(jí)稀釋，定容，搖勻，配制得到6個(gè)濃度梯度的對(duì)照品混合溶液。按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，以對(duì)照品質(zhì)量為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，進(jìn)行回歸，見表1。表明兩組分在各自質(zhì)量范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 兩組分線性關(guān)系

(2)精密度試驗(yàn)。取“2.1.3”項(xiàng)下供試品溶液適量，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次。測(cè)得槲皮素、山柰酚峰面積RSD分別為1.42%、0.41%，均小于2.0%，表明儀器精密度良好。

(3)穩(wěn)定性試驗(yàn)。取“2.1.3”項(xiàng)下供試品溶液適量，分別于0、2、4、8、10、24 h進(jìn)樣，測(cè)得槲皮素、山柰酚峰面積RSD分別為0.86%、0.74%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

(4)重復(fù)性試驗(yàn)。精密稱取檵木葉樣品細(xì)粉1.0 g，共6份，按“2.1.3” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，測(cè)得槲皮素、山柰酚的含量RSD分別為1.77%、2.37%，說明該方法重復(fù)性良好。

(5)加樣回收率試驗(yàn)。取已知含有量樣品細(xì)粉0.5 g，共9份，分別加入高、中、低3種不同量的槲皮素、山柰酚對(duì)照品，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，計(jì)算兩組分回收率。見表2。

表2 兩組分加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.2 兩種檵木葉中槲皮素、山柰酚含量隨生長(zhǎng)期變化

于4月-10月的每月15日同時(shí)采摘兩種不同的檵木葉500 g，60 ℃干燥至干(控制含水量在4.5%～4.6%)，粉碎，過3號(hào)篩，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別精密吸取供試品20 μL，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，測(cè)得槲皮素、山柰酚含量，并計(jì)算其含量平均值及標(biāo)準(zhǔn)差。見表3。

表3 兩種檵木葉中槲皮素、山柰酚含量平均值及標(biāo)準(zhǔn)差 (n=3)

將不同月份兩種檵木葉中槲皮素、山柰酚的含量結(jié)果用直方圖表示，見圖2。

A.紅花檵木葉、白花檵木葉中槲皮素含量比較

并采用95%可信區(qū)間重疊法比較不同采收時(shí)間的兩種檵木葉中槲皮素、山柰酚的含量差異，見表4。

由表4可知，紅花檵木葉中槲皮素、山柰酚含量均是7月份最高(95%可信區(qū)間未重疊，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)，最佳采收期為每年7月份。

表4 兩種檵木葉中槲皮素、山柰酚含量95%可信區(qū)間重疊法

白花檵木葉中槲皮素含量是7月份最高，而5至6月份的白花檵木葉中山柰酚含量比其他月份高(95%可信區(qū)間未重疊，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)，5至6月份白花檵木葉中山柰酚含量95%可信區(qū)間重疊，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，故需白花檵木葉中槲皮素含量高時(shí)，則每年7月份采收最佳，如需白花檵木葉中山柰酚含量高，則宜于每年5至6月份采收。

2.3 兩種檵木葉中槲皮素、山柰酚含量差別比較

將不同生長(zhǎng)期的兩種檵木葉中槲皮素、山柰酚含量采用配對(duì)t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，見表5。

表5結(jié)果表明，紅花檵木葉中槲皮素含量遠(yuǎn)高于白花檵木葉中槲皮素含量，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.60，P=0.001 4)；白花檵木葉比紅花檵木葉中山柰酚含量更高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t=3.35，P=0.015 4)，由此可見，紅花檵木葉與白花檵木葉質(zhì)量差異較大，不能互相替換使用。

表5 兩種檵木葉中槲皮素、山柰酚含量差別的配對(duì)t檢驗(yàn)結(jié)果

3 討論

《中華人民共和國(guó)藥典》中并未收載檵木葉的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，故在文獻(xiàn)研究基礎(chǔ)上采用高效液相色譜法測(cè)定槲皮素、山柰酚的含量，并進(jìn)行了方法學(xué)考察。結(jié)果顯示，該實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性、穩(wěn)定性、精密度、加樣回收率皆達(dá)到定量分析要求，可用于本項(xiàng)研究。

采用95%可信區(qū)間重疊法[16]適于多組之間比較，簡(jiǎn)單明了，一目了然。由于實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)不隨機(jī)，故采用配對(duì)t檢驗(yàn)對(duì)兩種不同檵木葉中槲皮素、山柰酚進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

檵木葉一般于夏、秋季枝葉茂盛時(shí)采收，采收時(shí)間不具體，前期研究發(fā)現(xiàn)不同采收時(shí)間兩種檵木葉中槲皮素、山柰酚含量差異較大，本課題系統(tǒng)研究了4-10月的兩種檵木葉中槲皮素、山柰酚含量隨生長(zhǎng)期的變化情況，從而確定了兩種檵木葉的最佳采收期，同時(shí)比較了兩種檵木葉的質(zhì)量差異，從而確定紅花檵木葉、白花檵木葉不能替換使用。