鐘艷娟，盧 建，陳劍虹，閆 梅，黃紫娟

(1.惠州市第一婦幼保健院，廣東 惠州 516001；2.廣東省婦幼保健院胎兒遺傳醫(yī)學中心，廣東 廣州 510010)

目前，我國出生缺陷發(fā)生率為5.6%，每年新增出生缺陷數(shù)約90萬例。染色體疾病屬于嚴重新生兒出生缺陷，染色體非整倍體疾病及染色體致病性拷貝數(shù)變異是最常見的染色體疾病[1]。其中21三體綜合征、18三體綜合征占圍生期常染色體非整倍體的95%，一直是我國控制和預(yù)防出生缺陷的重點。然而，目前廣泛用于臨床的早中孕期血清學聯(lián)合篩查技術(shù)的檢出率為66%～80%，漏檢率為20%～34%，假陽性率為5%[2]。較高的漏診率導(dǎo)致染色體異?；純撼錾示痈卟幌拢o社會與家庭帶來沉重的精神和經(jīng)濟負擔。而過高的假陽性率給孕婦及家屬極大的心理壓力，增加不必要的介入性產(chǎn)前診斷手術(shù)，增加了正常胎兒的丟失風險。因此，目前急需一種無創(chuàng)、安全、高效的檢測方法，既可提高產(chǎn)前篩查的效率和質(zhì)量，又可避免有創(chuàng)介入性產(chǎn)前診斷造成的流產(chǎn)和感染風險。我國產(chǎn)前診斷技術(shù)專家組于2012年指出，無創(chuàng)DNA產(chǎn)前檢測(NIPT)技術(shù)是一種近似于診斷水平的產(chǎn)前篩查新技術(shù)[3]。近年來，NIPT在全國各地廣泛用于臨床，也積累了大量數(shù)據(jù)，為進一步探討NIPT在產(chǎn)前診斷中的實際臨床應(yīng)用價值，本研究對在廣東省惠州市第一婦幼保健院產(chǎn)前診斷中心進行NIPT的9 331例孕婦的檢測結(jié)果進行了統(tǒng)計分析，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1一般資料 選取2015年1月至2018年12月在廣東省惠州市第一婦幼保健院產(chǎn)前診斷中心因高齡妊娠、唐氏綜合征產(chǎn)前篩查結(jié)果異常及超聲檢查提示染色體異常軟指標等情況進行遺傳咨詢，經(jīng)知情同意和自愿選擇接受NIPT的9 331例孕婦作為研究對象，年齡16～49歲，平均(27.35±2.16)歲；孕周13～33周，平均(19±3.10周)；全部為單胎妊娠。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審批通過。

1.1.2排除標準 (1)孕周小于12周，體重指數(shù)大于40；(2)超聲檢查提示嚴重胎兒結(jié)構(gòu)異常；(3)曾接受過移植手術(shù)或干細胞治療；(4)1年內(nèi)接受過異體輸血、4周內(nèi)接受過異體細胞免疫治療等；(5)孕期合并惡性腫瘤；(6)夫妻雙方或一方有明確染色體異常；(7)妊娠合并嚴重內(nèi)、外科疾病，智力低下或精神類疾病者；(8)簽署本研究知情同意書。

1.2方法

1.2.1NIPT 采集孕婦靜脈血10 mL，置于游離DNA保存管，在4 ℃條件下1 600×g離心10 min取上清血漿，再次16 000×g離心10 min，血漿存放在-80 ℃冰箱。嚴格按照核酸提取試劑盒說明書提取胎兒游離DNA，經(jīng)聚合酶鏈反應(yīng)擴增得到DNA文庫，定量好的文庫經(jīng)Life Proton測序。依據(jù)生物統(tǒng)計學的原理將測序結(jié)果與人類基因組數(shù)據(jù)進行比對，由專用的無創(chuàng)分析管理系統(tǒng)軟件基于二元假設(shè)的Z-score值判斷標準分析胎兒染色體非整倍體的風險。

1.2.2介入性產(chǎn)前診斷 對NIPT提示高風險的孕婦經(jīng)產(chǎn)前診斷中心有資質(zhì)的?？漆t(yī)師進行遺傳咨詢，充分知情同意原則下進行介入性產(chǎn)前診斷，抽取羊水或臍血進行染色體核型分析及染色體微陣列分析(CMA)，確定染色體異常情況。

1.2.2.1染色體核型分析 采用貼壁細胞培養(yǎng)法培養(yǎng)后收獲、制片和G顯帶，全自動掃描儀掃描、拍照。常規(guī)計數(shù)20個核型，分析5個核型，嵌合體計數(shù)100個核型。依據(jù)人類細胞遺傳學國際命名體制(IscN2009)標準進行G顯帶染色體核型分析診斷。

1.2.2.2CMA檢測 使用美國Afffymetrix公司生產(chǎn)的Cytoscan 750k芯片對全基因組已知基因區(qū)域進行掃描，數(shù)據(jù)分析參照ECIPHER、ISCA、OMIM、DGV、UCSC等數(shù)據(jù)庫資料。判斷所檢出CNV的性質(zhì)，根據(jù)相應(yīng)的標準分為致病性CNV、可能致病性CNV、臨床意義不明確的CNV等。

1.2.3產(chǎn)前檢查及隨訪 對NIPT提示低風險及經(jīng)介入性產(chǎn)前診斷繼續(xù)妊娠的孕婦指導(dǎo)其定期產(chǎn)前檢查，孕中期Ⅲ級彩色多普勒超聲(彩超)檢查排除胎兒嚴重結(jié)構(gòu)異常，并追蹤全部孕婦的妊娠結(jié)局，分析無創(chuàng)檢測方法的檢出率、假陽性率和假陰性率等指標。

1.3統(tǒng)計學處理 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，采用描述性統(tǒng)計分析。

2 結(jié) 果

2.1進行NIPT的主要指征 9 331例孕婦中唐氏綜合征篩查高風險5 258例(56.35%)，唐氏篩查臨界風險1 623例(17.40%)，唐氏篩查低風險但單項指標異常的783例(8.40%)，唐氏篩查年齡高風險819例(8.78%)。其他指征(包括不良孕產(chǎn)史、未做唐氏篩查及超聲檢查提示染色體軟指標等)848例(9.09%)。

2.2NIPT與介入性產(chǎn)前診斷結(jié)果比較 9 331例孕婦進行NIPT提示染色體異常高風險245例(2.63%)，其中236例孕婦同意進行介入性產(chǎn)前診斷，其中21三體綜合征高風險86例，確診82例，陽性預(yù)測值為95.35%，假陽性率為0.04%，靈敏度為100.00%，特異度為99.96%；18三體綜合征高風險25例，確診16例，陽性預(yù)測值為64.00%，假陽性率為0.10%，靈敏度為100.00%，特異度為99.90%；13三體綜合征高風險19例，確診4例，陽性預(yù)測值為21.05%，假陽性率為0.16%，靈敏度為80.00%，特異度為99.84%；性染色體異常高風險45例，確診19例，陽性預(yù)測值為42.22%，假陽性率為0.28%，靈敏度為100.00%，特異度為99.72%；其他常染色體異常高風險67例，提示常染色體拷貝數(shù)變異，其中61例孕婦進一步產(chǎn)前診斷，檢出與無創(chuàng)DNA檢測結(jié)果相符的拷貝數(shù)變異18例，陽性預(yù)測值為29.51%，假陽性率為0.46%，靈敏度為78.26%，特異度為99.54%。見表1。NIPT對21三體和18三體的陰性預(yù)測值為100.00%，漏診率為0。所有確診的21、18、13三體綜合征均已終止妊娠，性染色體異常確診孕婦19例，其中3例孕婦(47，XXX 2例、47，XYY 1例)選擇保留胎兒，其他孕婦選擇終止妊娠。

表1 NIPT與介入性產(chǎn)前診斷結(jié)果比較

2.3NIPT篩查出的CNV陽性結(jié)果與介入性產(chǎn)前診斷結(jié)果比較 9 331例NIPT孕婦中除檢測21、18、13、性染色體的非整倍體疾病外，還檢測出其他常染色體異常高風險67例，提示為常染色體拷貝數(shù)變異，其中61例孕婦進一步產(chǎn)前診斷，檢出與無創(chuàng)DNA檢測結(jié)果相符的拷貝數(shù)變異18例，陽性預(yù)測值為29.51%，假陽性率為0.46%。9例未進行介入性產(chǎn)前診斷的孕婦中1例為NIPT提示21三體綜合征合并胎兒心臟畸形，直接選擇終止妊娠，2例為NIPT提示性染色體異常，孕期超聲檢查及追蹤到出生均未發(fā)現(xiàn)異常。6例為提示常染色體異常，其中2例后期超聲檢查提示胎兒結(jié)構(gòu)畸形直接終止妊娠，其余4例胎兒孕期超聲檢查及追蹤到出生均未發(fā)現(xiàn)異常。見表2。

表2 NIPT篩查出的CNV陽性結(jié)果與介入性產(chǎn)前診斷結(jié)果比較

續(xù)表2 NIPT篩查出的CNV陽性結(jié)果與介入性產(chǎn)前診斷結(jié)果比較

3 討 論

1997年香港中文大學盧煜明教授證實了孕婦外周血中存在胎兒游離DNA[4]，通過對胎兒游離DNA的生物信息分析，實現(xiàn)了獲取孕婦外周血便能對胎兒染色體患病風險進行檢測的無創(chuàng)的技術(shù)性突破。而目前胎兒標本進行染色體核型分析及CMA仍是診斷胎兒非整倍體疾病及染色體拷貝數(shù)變異的“金標準”。本研究9 331例孕婦進行NIPT，染色體異常高風險245例(2.63%)，其中21三體綜合征陽性預(yù)測值為95.35%，假陽性率為0.04%，靈敏度為100.00%，特異度為99.96%；18三體綜合征陽性預(yù)測值為64.00%，假陽性率為0.10%，靈敏度為100.00%，特異度為99.90%；13三體綜合征陽性預(yù)測值為21.05%，假陽性率為0.16%，靈敏度為80.00%，特異度為99.84%。結(jié)合隨訪結(jié)果，21三體綜合征及18三體綜合征無一例漏診。其中1例13三體綜合征漏診，該孕婦因唐氏篩查臨界風險于妊娠14周行NIPT，結(jié)果提示低風險。至妊娠22周行Ⅲ級彩超檢查提示胎兒多系統(tǒng)畸形，包括神經(jīng)系統(tǒng)和顏面部畸形，建議行羊膜腔穿刺術(shù)檢查胎兒染色體核型分析及CMA，提示胎兒部分13三體綜合征，告知預(yù)后不良，孕婦終止妊娠。隨后檢測母體外周血染色體發(fā)現(xiàn)，母親13號染色體部分缺失，導(dǎo)致胎兒13三體的漏診。因母親表型正常，并未在NIPT前檢查母親染色體。

本研究結(jié)果與國內(nèi)報道的統(tǒng)計數(shù)據(jù)基本一致。梁棟等[5]對4萬例游離DNA檢測產(chǎn)前篩查胎兒染色體非整倍體的研究結(jié)果顯示，NIPT明顯優(yōu)于母體血清學生化指標進行產(chǎn)前篩查的檢出率和假陽性率。雖然介入性產(chǎn)前診斷仍是染色體疾病的“金標準”，但不可避免有0.5%～1.0%的流產(chǎn)風險。因此，利用高通量測序平臺檢測胎兒21、18、13染色體非整倍體的方法已廣泛用于臨床[6]。迄今為止，全世界超過60個國家采用此項技術(shù)完成了75萬例以上的檢測[7]。自2012年來，由于NIPT的應(yīng)用而降低了40%～76%的介入性診斷[8]。

本研究9 331例孕婦中性染色體異常高風險45例，確診19例，陽性預(yù)測值為42.22%，假陽性率為0.28%；其他常染色體異常高風險67例，其中61例孕婦進一步產(chǎn)前診斷，檢出與無創(chuàng)DNA檢測結(jié)果相符的拷貝數(shù)變異18例，陽性預(yù)測值為29.51%，假陽性率為0.46%。在9 331份樣本中檢測出67例CNV，陽性率為0.74%，高于文獻報道的結(jié)果(0.21%)[9-10]，可能與不同的測序深度有關(guān)。18例經(jīng)CMA確診的拷貝數(shù)變異病例中致病性變異12例，夫妻雙方經(jīng)遺傳咨詢知情同意后選擇終止妊娠。3例可能致病CNV及3例臨床意義不明CNV均選擇保留胎兒，其中4對夫妻同意進行外周血CMA比對，3例發(fā)現(xiàn)其中一方與胎兒一致的CNV，為家族性變異。6例胎兒均已出生，目前隨訪至半年，未發(fā)現(xiàn)異常。

本研究9 331例孕婦進行NIPT，提示染色體異常高風險245例，其中236例孕婦同意進行介入性產(chǎn)前診斷，9例孕婦拒絕介入性產(chǎn)前診斷，其中2例NIPT提示21三體高風險，1例孕婦選擇直接終止妊娠；1例于妊娠24周Ⅲ級彩超檢查提示胎兒先天性心臟病，選擇終止妊娠；1例NIPT提示性染色體異常，孕婦拒絕產(chǎn)前診斷，繼續(xù)妊娠，孕期彩超未發(fā)現(xiàn)異常，目前出生后半年，隨訪家長自訴孩子體檢未見異常；最后6例NIPT提示胎兒染色體拷貝數(shù)變異，其中1例于孕32彩超檢查提示宮內(nèi)發(fā)育遲緩，估計胎兒體重小于第5百分位數(shù)，羊水過少，孕婦選擇終止妊娠；1例于孕34周彩超檢查發(fā)現(xiàn)胎兒重度腦積水而終止妊娠；1例于孕27周自然流產(chǎn)，流產(chǎn)物未進行染色體檢測；剩下3例孕婦繼續(xù)妊娠，孕期彩超檢查未發(fā)現(xiàn)異常，目前出生后3個月至半年，隨訪家長自訴孩子體檢未見異常。

NIPT檢測針對性染色體及其他染色體異常有稍高的假陽性率，導(dǎo)致假陽性的最常見原因是限制性胎盤嵌合體[11]，胎盤的限制性三體釋放到母體循環(huán)導(dǎo)致假陽性結(jié)果。胚胎自救的過程中將非整倍體細胞主動排斥到胎盤組織中，從而形成胎兒核型正常而部分胎盤組織細胞為異常的嵌合現(xiàn)象。而性染色體的假陽性更多是由于母體存在染色體異常，母體目標染色體出現(xiàn)片段重復(fù)或缺失，雖然本身沒有異常表型，只要變異片段大于500 kb即可導(dǎo)致假陽性的出現(xiàn)。袁珮等[12]報道，46例NIPT提示胎兒性染色體非整倍體高風險的孕婦中經(jīng)介入性產(chǎn)前診斷確診36例為假陽性，其中8例孕婦外周血染色體檢測提示孕婦本人染色體異常，異常率達22.22%。其他假陽性的原因包括母體惡性腫瘤及真性胎兒嵌合體等，但仍有2/3的假陽性結(jié)果無法解釋[13]。

綜上所述，NIPT是一種準確、高效的染色體非整倍體檢測方法，且隨著基因組測序技術(shù)的提高，NIPT除檢測出常見的21、18、13號染色體非整倍體及性染色體非整倍體外，還提供其他染色體拷貝數(shù)變異的信息，結(jié)合CMA技術(shù)可檢出50～100 kb以上的染色體異常，提高了染色體病的檢出率，為遺傳咨詢和生育指導(dǎo)提供了更精準的依據(jù)。