尹尚瑾 黃禮明 常寶珠 姚宇紅 李秀軍 陳 濤 宋 娟 陳孟豪

1貴州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院血液科，貴陽(yáng) 550003 2鄭州工業(yè)應(yīng)用技術(shù)學(xué)院，河南新鄭 451100

急性白血病(acute leukemia，AL)完全緩解后復(fù)發(fā)是困擾其治愈的一大難題，其中微小殘留白血病(minimal residual disease in leukemia，MRD-L)是復(fù)發(fā)的根源所在[1]。樹突細(xì)胞(dendritic cells，DC)可提呈白血病抗原，使抗白血病的特異性T細(xì)胞啟動(dòng)應(yīng)答。MRD-L狀態(tài)下各種細(xì)胞因子水平紊亂，以及機(jī)體內(nèi)環(huán)境發(fā)生改變對(duì)DC的轉(zhuǎn)化及功能產(chǎn)生不利影響，引起免疫功能下降、殘留的白血病細(xì)胞逃逸機(jī)體免疫。因此，徹底清除白血病患者體內(nèi)的MRD是改善AL患者生活質(zhì)量并延長(zhǎng)無(wú)病生存期的重要措施。本研究在中醫(yī)藥理論指導(dǎo)下，以扶正透毒、祛毒為治療原則，探討加味青蒿鱉甲湯對(duì)急性髓性白血病完全緩解(acute myelogenous leukemia complete remission，AML-CR)患者CD34+源DC誘導(dǎo)過(guò)程中IL-6水平的影響，以期明確加味青蒿鱉甲湯治療MRD的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 臨床標(biāo)本來(lái)源

選取貴州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院血液科及貴州省人民醫(yī)院血液科化療后達(dá)到血液學(xué)完全緩解的AML-CR患者8例，患者符合《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》[2]中的診斷標(biāo)準(zhǔn)，且經(jīng)細(xì)胞學(xué)、免疫學(xué)、分子生物學(xué)和遺傳學(xué)確診為AML，年齡18～65歲，性別不限，患者知情并簽署知情同意書。

1.2 主要試劑及設(shè)備

人淋巴細(xì)胞分離液(天津?yàn)蠊?，RPMI 1640(美國(guó)GBICO公司)，CD34+細(xì)胞免疫磁珠分選試劑盒(瑞士DYNAL公司)，F(xiàn)MS樣絡(luò)氨酸激酶3(Flt-3)、白細(xì)胞介素-3(IL-3)、血小板生成素(TPO)、干細(xì)胞生長(zhǎng)因子(SCF)、重組粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)均來(lái)自美國(guó)Prepro Tech公司；重組人α-干擾素(IFN-α)、白細(xì)胞介素-4(IL-4)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)均來(lái)自上海primefene公司；CD80、CD83、CD86、CD1a、HLA-DR抗體由美國(guó)BioLegend公司提供。IL-6 ELISA檢測(cè)試劑盒(武漢華美公司)；水純化裝置(SZ-97自動(dòng)三重純水整蒸餾器)；電熱鼓風(fēng)干燥箱(101-1 AB型，天津偉泰斯特)；全自動(dòng)高壓滅菌鍋(MLS-3020，日本三洋)；倒置顯微鏡(奧林巴斯IX71)；二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo，3111型)；低溫離心機(jī)(TD24-WS，新湘儀)；自動(dòng)酶標(biāo)檢測(cè)儀(ELX800，美國(guó)通用)；流式細(xì)胞儀(BD Facscalibur)；3 D搖床(KB-7007，海門其林貝爾公司)；15 mL、50 mL離心管，25 cm2培養(yǎng)瓶以及6孔板等均來(lái)自美國(guó)CORNING公司。

1.3 加味青蒿鱉甲湯含藥兔血清制備

煎取加味青蒿鱉甲湯(黃芪、黃精、青蒿、鱉甲、白花蛇舌草、半枝蓮等)原藥并濃縮藥液濃度至2 g/mL，室溫冷卻后置于4℃冰箱備用。將12只新西蘭兔(4月齡、體質(zhì)量約2 kg、來(lái)自貴陽(yáng)鵬程農(nóng)業(yè)科技有限公司)隨機(jī)分成4組：加味青蒿鱉甲湯高、中、低劑量組及空白組，每組3只，參照《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》[3]人-兔體表面積等效劑量比換算后得出加味青蒿鱉甲湯灌胃高、中、低劑量分別為10 g/kg、5 g/kg、2.5 g/kg；灌胃連續(xù)3天，每天2次(于每日早晚進(jìn)食前)，空白組正常飲食不予特殊處理。于最后1次灌胃2 h后在無(wú)菌條件下行心臟取血，將取得的血清用微孔濾過(guò)膜(0.45 μm)過(guò)濾除菌后，在超凈臺(tái)內(nèi)分裝，標(biāo)記、凍存于-20℃冰箱。

1.4 CD34+細(xì)胞體外提取、擴(kuò)增

用PBS將抽取的AML-CR患者骨髓以1∶1稀釋、混勻后，并按2∶1的比例將骨髓貼壁勻速緩慢地加入裝有人淋巴分離液的15 mL離心管內(nèi)，置于離心機(jī)中以2000 r/min離心20 min后，提取白膜層并移入新的15 mL離心管內(nèi)，予PBS按3∶1的比例稀釋、混勻后于離心機(jī)內(nèi)以1500 r/min離心10 min后取出，棄上清，再次予PBS按上述比例稀釋、混勻后于離心機(jī)內(nèi)以1500 r/min離心10 min后取出，棄上清，所得即為骨髓單個(gè)核細(xì)胞(BMNC)，用1 mL 10% FCS RPMI 1640稀釋后混勻備用。將100 μL CD34+免疫磁珠用2 mL EDTA液在磁珠架上清洗干凈后棄上清，將收集的BMNC與免疫磁珠充分混勻。于4℃條件下放置于搖床上震蕩孵育30 min后，靜置于磁架上1 min，棄上清。用2 mL PBS洗滌后置于磁珠架上，棄上清，此步驟重復(fù)3次后加入100 μL磁珠清洗液、1 mL 10% FCS RPMI 1640培養(yǎng)基混勻后置于搖床上室溫下震蕩孵育40 min，再加入2 mL PBS充分混勻加強(qiáng)洗磁珠，于磁珠架上靜置2 min，收集上清液于無(wú)菌離心管內(nèi)。如此反復(fù)3次，將所收集的細(xì)胞懸液以1000 r/min離心5 min后棄上清，以3 mL 10% FCS RPMI 1640培養(yǎng)混勻細(xì)胞后移入新的5 mL EP管中，于磁架上靜置2 min，用新的15 mL離心管收集剩余液體，重懸得到CD34+細(xì)胞。將提取獲得的CD34+細(xì)胞用移液器加入25 cm2培養(yǎng)瓶中，并在培養(yǎng)瓶中加入Flt3、IL-3、TPO、SCF等細(xì)胞因子，在培養(yǎng)瓶中進(jìn)行CD34+細(xì)胞擴(kuò)增，擴(kuò)增時(shí)間為5～7天，隔天需半量換液，換液同時(shí)需補(bǔ)充等量培養(yǎng)基及擴(kuò)增因子。

1.5 DC誘導(dǎo)

CD34+細(xì)胞擴(kuò)增5～7天后，在顯微鏡下觀察到其細(xì)胞數(shù)量呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后離心，并補(bǔ)充5 mL 10%FCS RPMI 1640培養(yǎng)基，將其等分加入6孔培養(yǎng)板中，用培養(yǎng)液調(diào)整每孔細(xì)胞數(shù)約1×106/mL，將6孔培養(yǎng)板分為5組，分別加入含藥兔血清及細(xì)胞因子以誘導(dǎo)DC，具體分組如下：?jiǎn)渭兗?xì)胞因子組(A組)、正常兔血清+細(xì)胞因子(B組)、加味青蒿鱉甲湯低劑量+細(xì)胞因子組(C組)、加味青蒿鱉甲湯中劑量+細(xì)胞因子組(D組)、加味青蒿鱉甲湯高劑量+細(xì)胞因子組(E組)；其中含藥兔血清濃度為200 μL/mL，細(xì)胞因子濃度分別為IFN-α 100 ng/mL，GM-CSF 100 ng/mL，IL-4 50 ng/mL，TNF-α 100 ng/mL。誘導(dǎo)9天，誘導(dǎo)期間每3～4天進(jìn)行半量換液，并補(bǔ)充等量的10% FCS RPMI 1640培養(yǎng)基、細(xì)胞因子及兔血清，各組在培養(yǎng)第7天半量換液后均加入TNF-α促進(jìn)DC成熟。

1.6 IL-6檢測(cè)

在DC誘導(dǎo)過(guò)程中的第0天、第6天、第9天分別吸取上清液1 mL置于已標(biāo)記好的1.5 mL無(wú)菌EP管中，于-20℃條件下保存?zhèn)溆茫凑誆LISA試劑盒說(shuō)明書于酶標(biāo)儀檢測(cè)IL-6的光密度值并計(jì)算其水平。

1.7 DC鑒定

在倒置顯微鏡下觀察DC的大小、形態(tài)并記錄；使用自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀將細(xì)胞數(shù)量調(diào)整至5×105～1×106/mL，用15 mL試管分別收集6孔板中的細(xì)胞，再用PBS溶液洗滌6孔板3次并收集洗滌液，經(jīng)2000 r/min離心5 min后，以2 mL 10% FCS RPMI 1640培養(yǎng)基重懸混勻細(xì)胞后取1 mL于小EP管中，開蓋于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜后分別加入CD83、CD86、CD80、CD1a、HLA-DR抗體各5 μL，再加入細(xì)胞100 μL，充分混勻后放置20 min，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)DC表面分子CD83、CD86、CD80、CD1a及HLA-DR的表達(dá)率。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 CD34+細(xì)胞數(shù)量及擴(kuò)增情況

經(jīng)免疫磁珠提取的CD34+細(xì)胞數(shù)量以及經(jīng)培養(yǎng)擴(kuò)增后的CD34+細(xì)胞數(shù)量分別為(4.13±1.76)×104個(gè)/mL和(5.23±1.67)×106個(gè)/mL。

2.2 DC形態(tài)觀察

隨著DC誘導(dǎo)天數(shù)的增加，在擴(kuò)增培養(yǎng)第3天細(xì)胞表面變得不規(guī)則、毛糙，并相互成簇出現(xiàn)聚集現(xiàn)象；見圖1。培養(yǎng)第6天時(shí)，細(xì)胞胞體增大，聚集增多，細(xì)胞表面突起變粗、變長(zhǎng)，猶如樹杈狀分枝；見圖2。在第9天時(shí)細(xì)胞胞體明顯增大，突起增多，基本形成具有典型成熟形態(tài)的DC；見圖3。

A(×200倍)；B(×400倍)圖1 擴(kuò)增培養(yǎng)第3天DC形態(tài)

A(×200倍)；B(×400倍)圖2 擴(kuò)增培養(yǎng)第6天DC形態(tài)

A(×200倍)；B(×400倍)圖3 擴(kuò)增培養(yǎng)第9天DC形態(tài)

2.3 IL-6含量比較

CD34+細(xì)胞誘導(dǎo)成DC的過(guò)程中隨著時(shí)間的推移各含藥血清+細(xì)胞因子組、正常血清+細(xì)胞因子組及單純細(xì)胞因子組中IL-6的水平都隨著DC誘導(dǎo)成熟天數(shù)的增加而逐漸升高(P<0.05)；在同一時(shí)間內(nèi)各含藥血清+細(xì)胞因子組IL-6濃度均較正常血清+細(xì)胞因子組、單純細(xì)胞因子組升高(P<0.05)。在相同時(shí)間內(nèi)各含藥血清組中，加味青蒿鱉甲湯高劑量+細(xì)胞因子組與加味青蒿鱉甲湯中劑量+細(xì)胞因子組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與加味青蒿鱉甲湯低劑量+細(xì)胞因子組相比，加味青蒿鱉甲湯高劑量+細(xì)胞因子組、加味青蒿鱉甲湯中劑量+細(xì)胞因子組中IL-6濃度均明顯升高(P<0.05)；正常血清+細(xì)胞因子組、單純細(xì)胞因子組之間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組IL-6含量比較

2.4 DC表面分子表達(dá)比較

CD80、CD83、CD86、CD1a、HLA-DR表面分子在各含藥血清+細(xì)胞因子組、正常血清+細(xì)胞因子組及單純細(xì)胞因子組中均可表達(dá)，但CD80的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；CD83、CD86、HLA-DR表達(dá)在各含藥血清+細(xì)胞因子組中均較正常血清+細(xì)胞因子組、單純細(xì)胞因子組高(P<0.05)，而含藥血清高、中、低劑量+細(xì)胞因子組之間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，正常血清+細(xì)胞因子組、單純細(xì)胞因子組之間比較，差異亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；含藥血清中劑量+細(xì)胞因子組與低劑量+細(xì)胞因子組中CD1a的表達(dá)較高劑量+細(xì)胞因子組、正常血清+細(xì)胞因子組、單純細(xì)胞因子組高(P<0.05)，而含藥血清中劑量+細(xì)胞因子組與低劑量+細(xì)胞因子組之間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，含藥血清高劑量+細(xì)胞因子組與正常血清+細(xì)胞因子組、單純細(xì)胞因子組之間比較，差異亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組DC表面分子表達(dá)比較

3 討論

中醫(yī)認(rèn)為，AL的發(fā)生與機(jī)體正氣虛弱、邪毒入血傷髓有關(guān)，正氣虛弱是本病發(fā)生的內(nèi)因；加之抗癌藥物的攻伐使正氣進(jìn)一步受損，以致患者完全緩解后仍然正氣不足?；熓茿ML的主要治療手段，但其對(duì)白血病細(xì)胞的殺滅呈對(duì)數(shù)級(jí)，并不可能徹底殺滅白血病細(xì)胞。而且由于血-腦、血-睪丸等屏障的存在，化療藥物難以到達(dá)腦、睪丸等部位，所以腦、睪丸等部位可能殘留有白血病細(xì)胞；這些殘留的白血病細(xì)胞是導(dǎo)致AL復(fù)發(fā)的主要原因?；熕幬镌谟行籽〖?xì)胞的同時(shí)也強(qiáng)烈抑制機(jī)體的免疫功能，因此AL患者存在著免疫功能紊亂?；熀蠡颊邫C(jī)體免疫功能進(jìn)一步下降，使正常的免疫監(jiān)視功能遭到破壞，殘存在血液、骨髓、腦膜、睪丸等部位的少量白血病細(xì)胞容易引起AL復(fù)發(fā)；中醫(yī)認(rèn)為這些病位屬于至陰之分，因此可以認(rèn)為，AL完全緩解后的基本病機(jī)特點(diǎn)是“正氣虛弱，余毒伏陰”。針對(duì)這一病機(jī)特點(diǎn)，既要扶助正氣，也需祛除余毒。同時(shí)，由于余毒深伏陰分，尚需將陰分余毒透出陽(yáng)分以清解。因此，扶正透毒祛毒之法切合AL完全緩解后的病機(jī)特點(diǎn)。

本研究選用“入陰透邪”經(jīng)典方青蒿鱉甲湯，將伏于陰分的毒邪透出陽(yáng)分而祛除。《溫病條辨》指出：“邪氣深伏陰分，混處氣血之中，不能純用養(yǎng)陰，又非壯火，更不得任用苦燥。故以鱉甲蠕動(dòng)之物，入肝經(jīng)至陰之分，既能養(yǎng)陰，又能入絡(luò)搜邪；以青蒿芳香透絡(luò)，從少陽(yáng)領(lǐng)邪外出”，該方以青蒿、鱉甲為君，生地、知母為臣并佐以丹皮而成。在透除毒邪的同時(shí)加用扶正祛毒藥物，以恢復(fù)機(jī)體正氣、抵御外邪，并將透出的毒邪祛除而達(dá)到“正足邪自祛、邪祛正自安”。扶正藥物選用黨參、黃芪、白術(shù)、茯苓、女貞子、旱蓮草，具有益氣健脾、滋補(bǔ)肝腎之功效，可使氣血得補(bǔ)，正氣存內(nèi)而邪不可干，從而增強(qiáng)機(jī)體的抵抗力。祛毒藥物選用祛毒解毒抗癌的半枝蓮、大青葉、白花蛇舌草、重樓，主要針對(duì)緩解期殘留的余毒及化療藥物攻伐之毒。青蒿鱉甲湯與扶正祛毒藥物合用可使透邪與養(yǎng)陰并存，扶正與祛邪并進(jìn)，能使臟腑功能得以調(diào)整、正氣得以恢復(fù)、余毒得以清除，從而提高機(jī)體免疫力，恢復(fù)患者正常的免疫功能。

DC作為特異性免疫應(yīng)答的始動(dòng)者，其可提呈大量抗原肽/MHCⅠ類分子復(fù)合物、抗原肽/MHCⅡ類分子復(fù)合物，并能高表達(dá)CD80、CD86等共刺激分子及某些黏附分子；DC能在這些分子信號(hào)作用下使T細(xì)胞活化、增殖并發(fā)揮其功能。DC在人體內(nèi)分布廣泛，除腦以外的全身各個(gè)臟器均有分布，但其數(shù)量極少。AML-CR患者因?yàn)榘籽〖?xì)胞的浸潤(rùn)以及化療的損傷等多種因素導(dǎo)致免疫功能減弱，包括DC數(shù)量的減少、功能的減退。加之白血病細(xì)胞的腫瘤免疫原性減弱或抗原調(diào)變而出現(xiàn)免疫抑制，使得殘留于患者體內(nèi)的白血病細(xì)胞難以清除。因此如何增加并完善白血病患者體內(nèi)的DC數(shù)量及功能，使其有效提呈腫瘤抗原，從而發(fā)揮免疫監(jiān)視作用對(duì)于改善AML-CR的預(yù)后具有重要意義。

本研究結(jié)果顯示，隨著DC誘導(dǎo)時(shí)間的進(jìn)展，在倒置顯微鏡下發(fā)現(xiàn)細(xì)胞表面逐漸變得毛糙、不規(guī)則，并聚集增多，第9天左右時(shí)可呈現(xiàn)成熟的DC形態(tài)，即細(xì)胞表面如樹突狀；為更好地了解DC的成熟情況，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)對(duì)DC的表面抗原CD80、CD83、CD86、CD1a、HLA-DR進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示：各組含藥血清+細(xì)胞因子組均能高表達(dá)CD83、CD86、HLA-DR，但CD80的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；CD1a在含藥血清中劑量組與低劑量組中的表達(dá)明顯高于高劑量組、正常血清+細(xì)胞因子組及單純細(xì)胞因子組。高劑量組CD1a的表達(dá)明顯低于中、低劑量組可能與CD1a對(duì)中藥復(fù)方有較低的濃度依賴有關(guān)，抑或與樣本量較少有一定的關(guān)系。含藥血清組與正常血清+細(xì)胞因子組、單純細(xì)胞因子組相比能更好地誘導(dǎo)DC成熟，考慮與含藥血清的有效成分能調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)環(huán)境，從而改變DC所處微環(huán)境中的相關(guān)細(xì)胞因子含量有關(guān)。以上提示加味青蒿鱉甲湯能促進(jìn)AML-CR患者CD34+細(xì)胞向DC轉(zhuǎn)化。

細(xì)胞因子具有廣泛的生物學(xué)活性，在機(jī)體的自穩(wěn)、防衛(wèi)和免疫調(diào)控等方面扮演著重要角色。細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)失衡會(huì)使機(jī)體內(nèi)環(huán)境發(fā)生紊亂，影響DC的分化成熟，從而不能有效地發(fā)揮抗原提呈功能，使得腫瘤細(xì)胞逃避免疫監(jiān)視，并導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生及發(fā)展。成熟的DC能分泌IL-1、IL-6、IL-12、TNF-α、IFN-α等細(xì)胞因子及多種趨化因子。IL-6作為眾多細(xì)胞因子中的一員，能促進(jìn)細(xì)胞增殖、分化。在誘導(dǎo)DC的第0、6、9天通過(guò)ELISA法對(duì)IL-6的含量進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，IL-6的含量隨著時(shí)間的遞增而逐漸增多，各含藥血清組均較對(duì)照組明顯升高，表明加味青蒿鱉甲湯含藥血清在誘導(dǎo)CD34+源DC成熟過(guò)程中可能促進(jìn)了DC分泌IL-6。其機(jī)制可能是加味青蒿鱉甲湯能直接調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)環(huán)境，改善細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)失衡狀態(tài)，從而促進(jìn)DC分泌IL-6。有研究[4]發(fā)現(xiàn)IL-6能讓單核細(xì)胞來(lái)源的DC上MHC-Ⅱ類分子及CD86的表達(dá)明顯提高。Saijo Y等[5]發(fā)現(xiàn)IL-6能刺激腫瘤細(xì)胞表達(dá)抗原，并且能誘導(dǎo)DC分化，刺激細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞增殖而殺傷腫瘤細(xì)胞。故推測(cè)加味青蒿鱉甲湯含藥血清在誘導(dǎo)CD34+源DC成熟過(guò)程中分泌IL-6的同時(shí)，IL-6又能以正反饋的方式促進(jìn)DC的分化成熟。研究證實(shí)IL-6有廣泛的生物學(xué)作用，其能加強(qiáng)B細(xì)胞的增殖、分化，并可分泌抗體，參與炎癥反應(yīng)及抗瘤效應(yīng)，并能增強(qiáng)細(xì)胞毒性T細(xì)胞及自然殺傷細(xì)胞的抗腫瘤活性。前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該方含藥血清對(duì)K562細(xì)胞的殺傷作用較細(xì)胞因子組大，并能更好地促進(jìn)DC提呈抗原，更明顯地刺激細(xì)胞毒性T細(xì)胞活化、增殖，并高效、特異地殺傷靶細(xì)胞[6]。加味青蒿鱉甲湯刺激細(xì)胞毒性T細(xì)胞活化、增殖及對(duì)靶細(xì)胞的特異性殺傷，是否通過(guò)增加IL-6的含量而發(fā)揮其作用是值得進(jìn)一步思考的問(wèn)題。