鄭雅瑩, 馬挺軍

(北京農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院，北京 102206)

藜麥?zhǔn)寝伎埔荒晟荼倦p子葉植物，原產(chǎn)于南美洲的安第斯山脈，具有數(shù)千年的種植歷史[1]。藜麥被聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織認(rèn)定為唯一能滿足人體基本營養(yǎng)需求的單一植物[2]，因為藜麥中含有豐富的高質(zhì)量蛋白質(zhì)，氨基酸組成均衡，并且相較于真谷物，藜麥不含麩質(zhì)蛋白，適合乳糜瀉患者食用；藜麥中膳食纖維含量豐富，適合減肥人群食用；藜麥中含有多不飽和脂肪酸，如亞油酸和α-亞麻酸等；藜麥也是礦物質(zhì)和維生素的重要來源；同時，藜麥中含有多種生物活性成分，如多酚類、黃酮類、γ-氨基丁酸、蛻皮激素等[3,4]。有研究表明，藜麥具有抗氧化、降血糖、抑菌等[5,6]活性，因此藜麥被列為全球十大健康營養(yǎng)食物之一。

蛻皮激素屬于一類天然多羥基類固醇，被人們廣泛熟知是其在昆蟲體內(nèi)具有控制蛻皮和繁殖的類固醇激素，但植物中所含有的蛻皮激素被證明對哺乳動物和人類具有多種生物活性，如抗氧化、抗肥胖、抗炎、降血糖、促進蛋白質(zhì)合成等活性[7]。藜麥?zhǔn)俏ㄒ缓兄参锿懫ぜに氐募俟任?，藜麥中的蛻皮激素主要分為兩大類，C-27和C-28植物蛻皮激素。β-蛻皮激素(又稱20-羥基蛻皮激素，20-hydroxyecdysone)是藜麥C-27植物蛻皮激素中最主要的物質(zhì)，含量為0.184～0.484 mg/g，還含有一些微量單體屬于C-28植物蛻皮激素，如羅漢松甾酮A等[8]。結(jié)構(gòu)式如圖1所示。

圖1 藜麥中主要蛻皮激素化合物結(jié)構(gòu)式

藜麥經(jīng)溶劑超聲提取后得到β-蛻皮激素粗提物，含有糖類、黃酮多酚以及皂苷等雜質(zhì)，需要進一步純化得到蛻皮激素[9]。目前蛻皮激素的分離純化方法有溶劑萃取法、大孔吸附樹脂法、硅膠柱層析法等[10]。溶劑萃取法雖然可以對粗提物中的成分進行有效分離，但需要使用大量有機溶劑，存在污染環(huán)境，危險并且有害健康等不足；大孔吸附樹脂法具有理化性質(zhì)穩(wěn)定，易于再生，安全且價格低廉等優(yōu)點，但其產(chǎn)品純度不高，需要進一步純化；硅膠柱層析法可進一步提高產(chǎn)物的純度，純化效果好。朱向東等[11]通過大孔吸附樹脂法純化露水草中的β-蛻皮激素；杜月等[12]運用大孔吸附樹脂、硅膠柱層析方法分離純化祁州漏蘆花，得到蛻皮激素；歐陽文等[13]采用層析法對土牛膝抗炎活性成分進行分離，通過核磁鑒定所得化合物為β-蛻皮激素。

國內(nèi)對藜麥蛻皮激素的研究較少，本文探討大孔吸附樹脂-硅膠柱層析對藜麥β-蛻皮激素的分離純化并對比純化前后藜麥β-蛻皮激素的抗氧化活性，為藜麥蛻皮激素的進一步研究和在功能食品中利用提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

β-蛻皮激素標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%)；“冀藜l號”藜麥；大孔吸附樹脂(AB-8、D101、HPD600、ADS-7、S-8)；硅膠(300-400目)

甲醇(色譜純)、2,4,6-三(2-吡啶基)-1,3,5-三嗪(TPTZ)、DPPH、抗壞血酸(VC)；甲醇(分析純)、三氯甲烷(分析純)、無水乙醇；硫酸亞鐵、氯化鐵、乙酸鈉。

表1 大孔吸附樹脂的型號及物理性能

1.2 儀器與設(shè)備

DH-101型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，小型高速粉碎機；電子分析天平，KQ-700E型超聲波清洗器，TDZ5M型臺式低速離心機，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(RE-2000)，常規(guī)冷凝裝置，SH B-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵，真空冷凍干燥機，高效液相色譜，LabTech UV9100D紫外分光光度計，WD-9403B紫外分析儀。

1.3 方法

1.3.1 藜麥蛻皮激素提取

藜麥洗凈干燥、除雜、粉碎、過60 目篩，按1∶14 g/mL的料液比加入60%的乙醇，于30 ℃、700 W、40 kHz下超聲30 min，4 000 r/min離心10 min，取上清液，旋蒸至無醇味，冷凍干燥，得到β-蛻皮激素粗提物(純度為5.06%)。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及蛻皮激素含量測定

以β-蛻皮激素為標(biāo)準(zhǔn)品，準(zhǔn)確配制0.005、0.01、0.02、0.04、0.08 mg/mL的β-蛻皮激素標(biāo)準(zhǔn)溶液，根據(jù)色譜圖中峰面積計算β-蛻皮激素含量，實驗重復(fù)3次，計算平均值，以色譜圖中峰面積為縱坐標(biāo)y，以待測樣品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)x繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線?；貧w方程為y=2×107x+9 075.5(R2=0.999 7)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出蛻皮激素的含量。

采用高效液相色譜法檢測，色譜柱：XDB-C18(4.6×250 mm，5 μm)；流動相∶甲醇∶水=40∶60；流速：0.8 mL/min；檢測波長：246 nm；柱溫:31 ℃；進樣量：10 μL。

1.3.3 樹脂預(yù)處理

將大孔吸附樹脂于95%乙醇中浸泡24 h，去離子水洗至無醇味；于5%鹽酸溶液中浸泡4 h，去離子水洗至中性；于5%氫氧化鈉溶液中浸泡5 h，去離子水洗至中性，備用。

1.3.4 最佳大孔吸附樹脂的篩選

將藜麥β-蛻皮激素粗提物溶于250 mL去離子水中，配制成一定濃度的藜麥β-蛻皮激素溶液。準(zhǔn)確稱取3 g樹脂加入裝有10 mL藜麥β-蛻皮激素溶液的錐形瓶中，于水浴振蕩器中(26 ℃，120 r/min)吸附24 h，采用HPLC法測定濾液中的藜麥β-蛻皮激素含量。在吸附平衡的樹脂中加入10 mL 70%的乙醇溶液，于水浴振蕩器中(26 ℃，120 r/min)解吸24 h，將濾液旋干，加入2 mL甲醇重溶，采用HPLC法測定β-蛻皮激素質(zhì)量濃度。大孔吸附樹脂的吸附率和解吸率計算公式為：

式中：C0、C1分別為吸附前與吸附后溶液中β-蛻皮激素質(zhì)量濃度/mg/mL；C2為解吸液中β-蛻皮激素質(zhì)量濃度/mg/mL。

1.3.5 D101型大孔吸附樹脂吸附動力學(xué)曲線

稱取預(yù)處理后的D101型大孔吸附樹脂3 g，置于25 mL錐形瓶中，加入10 mL質(zhì)量濃度為25.0mg/mLβ-蛻皮激素粗提液，搖勻，放入水浴恒溫振蕩器中振蕩(26 ℃，120 r/min)。按時取樣，測定β-蛻皮激素含量，以時間為橫坐標(biāo)，吸附量為縱坐標(biāo)繪圖，得到D101型大孔吸附樹脂的靜態(tài)吸附動力學(xué)曲線。

1.3.6 D101型大孔吸附樹脂動態(tài)吸附解吸實驗

取10 g預(yù)處理后的D101型大孔吸附樹脂濕法裝柱，將粗提物配制成不同濃度的溶液上樣至大孔吸附樹脂，以吸附率為指標(biāo)。分別考察上樣質(zhì)量濃度(5、25、45 mg/mL)和上樣流速(1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL/min)對藜麥β-蛻皮激素吸附效果的影響。每10 mL收集1組流份，采用高效液相色譜法測定上樣液及流出液中β-蛻皮激素質(zhì)量濃度，繪制泄漏曲線，確定上樣濃度以及最佳上樣流速。

在最佳吸附條件下，D101型大孔吸附樹脂吸附飽和后，經(jīng)去離子水洗至流出液澄清，以β-蛻皮激素質(zhì)量濃度為指標(biāo)，分別考察乙醇體積分?jǐn)?shù)(10%、30%、50%、70%、90%)和解吸流速(1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL/min)對β-蛻皮激素解吸效果的影響。每30 mL收集1組流出液，測定β-蛻皮激素質(zhì)量濃度，繪制動態(tài)洗脫曲線，確定最佳洗脫劑體積分?jǐn)?shù)和流速。

1.3.7 硅膠柱層析純化及純度測定

取50 g硅膠(300～400目)濕法裝柱，將大孔吸附樹脂后樣品用甲醇配制成質(zhì)量濃度為100 mg/mL的溶液上樣，以三氯甲烷-甲醇(8∶1→5∶1→4∶1)為洗脫劑，以7 mL/min流速進行梯度洗脫，收集洗脫液，每30 mL收集1管。將收集組分分別薄層點樣，合并相同組分，減壓回收溶劑，產(chǎn)物濃縮至干，甲醇重溶后采用高效液相色譜測定含量。按公式計算純度：

式中：m1為產(chǎn)物中蛻皮激素質(zhì)量/g；m0為產(chǎn)物質(zhì)量/g。

1.3.8 抗氧化活性測定1.3.8.1 總抗氧化能力(T-AOC)

配制0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mmol/L FeSO4標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別取0.1 mL加入0.3 mL去離子水和3 mL FARP工作液(10 mmol/L TPTZ、20 mmol/L FeCl3、0.3 mol/L醋酸鈉緩沖溶液以1∶1∶10混合，預(yù)熱至37 ℃)。搖勻后37 ℃放置4 min，于593 nm處測定吸光度值。以FeSO4濃度為x軸，吸光度為y軸，公式為y=0.562x+0.144 6，R2=0.999 8。樣品的總抗氧化能力以每克樣品的FeSO4濃度表示，單位為mol/g。

1.3.8.2 DPPH自由基清除實驗

將2 mL待測液及2 mL DPPH溶液置于具塞試管中，搖勻，放置30 min。以無水乙醇為空白，用紫外分光光度計于517 nm測其吸光度記為Ai；2 mL樣品與2 mL無水乙醇混合溶液的吸光度記為Aj；2 mL DPPH溶液與2 mL無水乙醇混合溶液的吸光度記為Ac。

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳大孔吸附樹脂的篩選

多種因素都可能會影響大孔吸附樹脂對化合物的分離，如樹脂的極性、比表面積和孔徑大小等[14]。由圖2可知，5種樹脂的吸附率差異較??；而解吸率方面，D101和HPD600型樹脂的解吸率相對較高，高于其他3種大孔吸附樹脂，尤其是D101型大孔吸附樹脂的解吸率高達(dá)80.72%。D101是非極性樹脂，HPD600為極性樹脂，2種樹脂的比表面積相近，但是平均孔徑D101小于HPD600，由此可以推斷出樹脂的極性和孔徑對β-蛻皮激素的吸附解吸過程影響較大。綜合吸附率和解吸率2個指標(biāo)，選擇D101型大孔吸附樹脂進行后續(xù)實驗。

圖2 不同大孔吸附樹脂對吸附率和解吸率的影響

2.2 D101型大孔吸附樹脂吸附動力學(xué)曲線

D101型大孔吸附樹脂對β-蛻皮激素的吸附屬于快速平衡型，在吸附的起始階段吸附量迅速增加，很快達(dá)到吸附平衡。60～200 min吸附量隨時間延長迅速增加，可能是由于開始時樹脂表面活性吸附位點較多，吸附速率較快；在200 min后，吸附量趨于平穩(wěn)，可能是由于蛻皮激素從樹脂表面進入樹脂內(nèi)部孔徑時受到一定阻力[15]。200 min達(dá)到吸附平衡，因此選擇最佳吸附時間為200 min。

2.3 D101型大孔吸附樹脂動態(tài)吸附解吸結(jié)果

2.3.1 上樣濃度對吸附效果影響分析

由圖3所示，隨著收集流份的增加，藜麥β-蛻皮激素質(zhì)量濃度逐漸增大。當(dāng)上樣質(zhì)量濃度為5 mg/mL時，在流出液達(dá)到100 mL時才出現(xiàn)泄漏，并一直保持低濃度泄漏；上樣濃度為25 mg/mL時，80 mL開始出現(xiàn)泄漏；上樣質(zhì)量濃度為45 mg/mL時，40 mL就開始出現(xiàn)泄漏，但在此濃度下β-蛻皮激素在水中的溶解性變差。因此，為提高樹脂利用率，避免樣品溶液的浪費，選擇25 mg/mL為最佳的上樣質(zhì)量濃度。

圖3 泄漏曲線

2.3.2 吸附流速對吸附效果影響分析

動態(tài)吸附過程中流速是影響樹脂吸附率的主要因素[16]。當(dāng)上樣流速在1.0～2.0 mL/min范圍內(nèi)，隨上樣流速的增加，吸附率變化較?。簧蠘恿魉俑哂?.0 mL/min后，吸附率下降，是因為流速過大，樣液中藜麥蛻皮激素與樹脂接觸不夠充分，引起樣液流失，導(dǎo)致吸附量下降。因此，為提高效率，選用最佳的上樣流速為2.0 mL/min。

2.3.3 解吸劑體積分?jǐn)?shù)對解吸效果影響分析

由圖4可以看出，在5、25、45 mg/mL質(zhì)量濃度下，都是30%乙醇洗脫劑可以解吸得到最高的蛻皮激素質(zhì)量濃度。當(dāng)上樣質(zhì)量濃度為25 mg/mL時，30%乙醇部分的蛻皮激素質(zhì)量濃度為225.3 μg/mL。β-蛻皮激素易溶于乙醇，其結(jié)構(gòu)中含有多個羥基，所以也能溶于水。因此，30%乙醇為最佳的洗脫劑濃度。崔娜等[17]采用SP825-L型大孔吸附樹脂，對川牛膝的正丁醇萃取物以不同乙醇濃度梯度洗脫，50%乙醇洗脫得到蛻皮激素。這可能是由于川牛膝中蛻皮激素類化合物結(jié)構(gòu)與藜麥中有所不同，從而導(dǎo)致化合物的極性不同，乙醇洗脫劑濃度有所差異。

注：1～5 BV為去離子水；6～10 BV為10%乙醇；11～15 BV為30%乙醇；16～20 BV為50%乙醇；21～25 BV為70%乙醇；26～30 BV為90%乙醇。圖4 洗脫曲線

2.3.4 解吸流速對解吸效果影響分析

解吸流速在1.5～2.0 mL/min范圍內(nèi)時，隨流速增加，β-蛻皮激素解吸率逐漸上升；在2.0～3.5 mL/min范圍內(nèi)時，隨流速增加，β-蛻皮激素解吸率逐漸下降，這是由于解吸劑與大孔吸附樹脂接觸時間較短，無法起到充分解吸β-蛻皮激素的作用。因此，為保證解吸劑與樹脂充分接觸，選用最適解吸流速為2.0 mL/min。

2.4 硅膠柱層析純化及純度測定

柱層析前先用薄層層析篩選適合的展開劑，具有節(jié)約時間、操作簡便的特點[18]。以三氯甲烷-甲醇梯度(8∶1→5∶1→4∶1)洗脫，根據(jù)硅膠柱層析流份的薄層色譜結(jié)果(見圖5)，可確定V(三氯甲烷)∶V(甲醇)=4∶1的前90 mL含有β-蛻皮激素，合并洗脫液得到β-蛻皮激素組分。

圖5 薄層色譜圖

藜麥β-蛻皮激素粗提物經(jīng)過大孔吸附樹脂-硅膠柱層析純化后，藜麥β-蛻皮激素的純度由5.06%提高至40.78%，液相色譜圖見圖6，雜峰相對較少，仍需要進一步純化。

圖6 液相色譜圖

2.5 體外抗氧化活性測定

2.5.1 總抗氧化能力的測定

由圖7可知，隨著藜麥β-蛻皮激素的純度提高，總抗氧化能力逐漸增加。藜麥β-蛻皮激素純化前和純化后產(chǎn)物總抗氧化能力分別為(0.44±0.01)mol/g和(6.46±0.46) mol/g，部分純化后總抗氧化能力提高14.68倍，相當(dāng)于VC總抗氧化能力的42.60%。

圖7 蛻皮激素抗氧化能力比較

2.5.2 DPPH自由基清除能力

隨著β-蛻皮激素溶液濃度的增大，清除率不斷上升。純化后的藜麥β-蛻皮激素在質(zhì)量濃度為0.3 mg/mL時，清除率已經(jīng)達(dá)到86.11%。由圖7可知，藜麥β-蛻皮激素純化前和純化后產(chǎn)物對DPPH自由基清除率的IC50值分別為(1.611±0.015) mg/mL和(0.155±0.010) mg/mL，純化后產(chǎn)物DPPH自由基清除能力為純化前10.39倍，相當(dāng)于VC清除DPPH自由基能力的4.37%。純化后的藜麥β-蛻皮激素具有更強的DPPH自由基清除能力，這可能是由于β-蛻皮激素為清除自由基作用的主要化合物，因此藜麥β-蛻皮激素純度提高，DPPH自由基清除能力增強。

3 結(jié)論

采用D101型大孔吸附樹脂為柱層析的填料，以30%乙醇體積分?jǐn)?shù)洗脫，得到純度為12.12%的蛻皮激素。進一步采用硅膠為柱層析填料，以不同比例的三氯甲烷-甲醇為洗脫劑進行梯度洗脫，在V(三氯甲烷)∶V(甲醇)=4∶1洗脫部位得到β-蛻皮激素，經(jīng)HPLC鑒定純度為40.78%。純化后總抗氧化能力和DPPH自由基清除能力分別比純化前提高14.68倍和10.39倍；純化后總抗氧化能力和DPPH自由基清除能力分別為VC的42.60%和4.37%。

本研究優(yōu)化的藜麥β-蛻皮激素分離純化方法，雖然能夠提高蛻皮激素的純度，但與預(yù)期的純度還有很大差距，需要使用反相ODS柱色譜、制備液相色譜進一步的純化，為鑒定結(jié)構(gòu)，闡明結(jié)構(gòu)與功效關(guān)系提供理論基礎(chǔ)。同時可繼續(xù)深入探究β-蛻皮激素的抗氧化機理，為藜麥蛻皮激素功能性食品的開發(fā)提供理論支撐。