代安娜, 張麗媛,2, 錢麗麗,2

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院1，大慶 163319) (黑龍江省農(nóng)產(chǎn)品加工與質(zhì)量安全重點實驗室2，大慶 163319)

玉米作為我國三大主糧之一，在收儲過程易受到曲霉屬和青霉屬的侵染而產(chǎn)生霉變[1，2]。糧食在儲藏過程中的霉變程度與含水率、溫度和濕度密切相關(guān)[3，4]。此外在糧食儲運過程中，添加防霉劑是防止霉變的有效手段之一，常用防霉劑是臭氧、磷化鋁熏蒸及有機酸，但有化學(xué)毒性殘留；造成環(huán)境二次污染和易使糧食中真菌產(chǎn)生抗性的缺點[5]。

植物精油(EOs)是從植物花、葉、果實等部位提取的植物次生代謝產(chǎn)物[6]。一般由醇類、酸類和酚類組成，作用機理復(fù)雜，難使病原菌產(chǎn)生抗性[7，8]，可作為一種天然提取物防腐劑[9，10]。目前開發(fā)利用的約300余種[11，12]，Prakash等[13]發(fā)現(xiàn)葛縷子精油可顯著減少黃曲霉毒素的產(chǎn)生。Prieto等[14]發(fā)現(xiàn)萬壽菊精油和百里香精油可有效抑制馬鈴薯赤霉病[14]，Ghabraie等[15]發(fā)現(xiàn)32種精油對4種致病菌和銅綠假單胞菌具有良好的抗菌活性[15]。此外也有研究表明黃曲霉、灰綠曲霉及青霉對丁香精油屬于高度敏感[16]，黑曲霉對八角茴香精油屬于中度敏感，對薄荷精油屬于低度敏感[17，18]。此外有研究將肉桂、花椒、八角茴香精油復(fù)配發(fā)現(xiàn)能有效抑制從紅提葡萄中分離的青霉菌、黑根霉及黑曲霉菌的生長[19]。此外將肉桂醛、檸檬醛、丁香酚和薄荷醇復(fù)合應(yīng)用在玉米儲藏上，可有效抑制黃曲霉生長，同時該精油復(fù)合物對霉菌抑制率(89%)，大于丙酸處理組(71.7%)[5]。而陳光勇等[20]將肉桂醛和百里香酚復(fù)合后對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果優(yōu)于山梨酸、苯甲酸、檸檬酸、丁酸鈉和丁酸甘油酯[20]。此外，與有機酸和丁酸類物質(zhì)相比，植物精油主要從天然植物的活性部位提取，來源天然，具有無毒、較強的抑菌性和環(huán)境友好的優(yōu)點，在抑制霉菌生長及毒素產(chǎn)生方面效果理想，是潛在用于玉米防霉，達到防止其霉變的有效物質(zhì)。而目前大多是研究單種植物精油抑制果蔬霉菌和致病菌，肉制品細菌生長和玉米及稻谷中某些霉菌生長，很少研制復(fù)合植物精油防止玉米及儲糧發(fā)生霉變。因此本實驗選擇6種植物精油，研究對玉米中分離的霉菌的抑制作用，為開發(fā)一種天然儲糧防霉劑，減少經(jīng)濟損失和保護消費者健康等方面提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

精油：薄荷精油、丁香精油、八角茴香精油、花椒精油、大蒜精油、橙皮精油。

干玉米粒、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)、孟加拉紅培養(yǎng)基、氯化鎂(分析純)、硝酸鈉(分析純)、丙酸(分析純)。

1.2 儀器與設(shè)備

LDZM-802KCS立式高壓蒸汽滅菌器，MJP-80型霉菌培養(yǎng)箱，SCB-1360型超凈工作臺，DGG-9140A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，THZ-82A水浴恒溫振蕩器。

1.3 方法

1.3.1 分離鑒定霉菌

1.3.1.1 玉米培養(yǎng)基及飽和鹽溶液

玉米培養(yǎng)基：采用含水量為20%和50%，稱取25 g干玉米粒平鋪到平皿，于121 ℃高壓滅菌15 min，向上述平皿內(nèi)加入1.3倍理論添加水量的滅菌蒸餾水，并于4 ℃冰箱內(nèi)放置2 d(每隔6 h搖動1次)，以便充分吸濕后達到平衡水分含量[21]。

飽和鹽溶液：無菌操作下向燒杯加入100 mL滅菌去離子水，并分別加入適量氯化鎂和硝酸鈉以形成實驗所需的相對濕度為30%和70%的環(huán)境，將燒杯用保鮮膜密封后，并在下一步實驗所需溫度的恒溫培養(yǎng)箱中放置2 d。

從冰箱中取出按上述操作制備好的不同水分含量的玉米培養(yǎng)基平皿，將平皿置于含有飽和鹽溶液的燒杯內(nèi)，每個燒杯中放置1個含玉米培養(yǎng)基的平皿，并將燒杯用保鮮膜密封后，分別于30 ℃和35 ℃條件下儲藏，并分別對儲藏2、4、6、8、10 d的玉米培養(yǎng)基中的優(yōu)勢霉菌進行分離培養(yǎng)。

1.3.1.2 霉菌分離和鑒定

無菌條件下，將按1.3.1.1步驟儲藏的玉米培養(yǎng)基放入裝有無菌水的錐形瓶中，振蕩20 min，進行梯度稀釋至合適濃度，取1 mL稀釋樣品到PDA培養(yǎng)基上，無菌涂布棒涂布均勻，28 ℃培養(yǎng)3～5 d，接種針挑取疑似霉菌菌落，在孟加拉紅培養(yǎng)基上做劃線分離，28 ℃純種培養(yǎng)3代以上后，接種于PDA培養(yǎng)基內(nèi)，于某公司鑒定菌株。

1.3.2 制備孢懸液

挑取純種培養(yǎng)三代以上的的霉菌菌落，28 ℃培養(yǎng)72 h，平皿內(nèi)加少許滅菌水，無菌涂布棒刮取孢子，滅菌水進行10倍稀釋，并用血球計數(shù)板計數(shù)，制成濃度為3.0～6.0×106CFU/mL的孢懸液。

1.3.3 體外抑菌實驗

采用濾紙片法測定植物精油的體外抑菌活性[22]。在超凈工作臺中向滅菌干燥后的培養(yǎng)皿(直徑90 mm)中倒入約20 mL PDA培養(yǎng)基，待冷卻凝固。吸取100 μL孢懸液到培養(yǎng)基表面，無菌涂布棒涂布均勻。

選用吸水性強的定性濾紙，用打孔器制作成小圓片(直徑6 mm)，121 ℃高壓滅菌烘干后，吸取10 μL精油滴加到干燥后的濾紙片上，用無菌鑷子將濾紙片貼在培養(yǎng)基上壓緊，每個培養(yǎng)皿上貼3片濾紙片做平行實驗(3片濾紙片呈三角狀排列且相距一定的距離)，重復(fù)3次實驗，同時以不做處理的空白培養(yǎng)基為對照，丙酸處理的培養(yǎng)基作為對照組，28 ℃培養(yǎng)72 h，測量抑菌圈的直徑，取3次結(jié)果平均值記錄數(shù)據(jù)。根據(jù)抑菌圈直徑的大小來判斷結(jié)果[23]，抑菌圈>15 mm為高度敏感，10 mm<抑菌圈<15 mm時為中度敏感，7 mm<抑菌圈<9 mm時為低度敏感，抑菌圈=0 mm為不敏感。

根據(jù)單種精油抑菌實驗及后續(xù)的最小抑菌濃度和最小殺菌濃度的實驗結(jié)果，選擇綜合抑菌效果好的四種精油進行復(fù)合，并吸取10 μL復(fù)合精油滴加到干燥后的濾紙片上后，在培養(yǎng)皿的中央放置1片濾紙片，其他操作步驟相同，28 ℃培養(yǎng)72 h，測量抑菌圈的直徑，重復(fù)3次實驗。

1.3.4 最小抑菌濃度(MIC)的測定

根據(jù)單種精油抑菌實驗結(jié)果，選擇5株霉菌表現(xiàn)為高度敏感的精油利用含毒介質(zhì)法進行MIC和MBC的測定[24，25]。將精油用95%乙醇分別梯度稀釋到50、25、12.5、6.25、3.125 μL/mL。在無菌培養(yǎng)皿中加人100 μL孢懸液和100 μL梯度稀釋的精油，倒入20 mL未凝固PDA培養(yǎng)基，充分混合。每組3皿，28 ℃培養(yǎng)。實驗中以95%乙醇和無菌水為對照。48 h后，觀察測試菌種的生長情況，以完全沒有菌落生長的最低濃度作為該精油的最小抑菌濃度(MIC)。

1.3.5 最小殺菌濃度(MBC)的測定

取2.3.4沒有長菌的平皿繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，取出觀察以完全沒有菌生長的最低濃度作為該精油的最小殺菌濃度(MBC)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用Microsoft Excel和SPSS 22.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行處理和方差分析。

2 結(jié)果分析

2.1 分離鑒別霉菌結(jié)果

在含水量為20%的玉米樣品，放置時間在2～8 d均出現(xiàn)黑色的菌落，在放置6 d時只有黑色菌落出現(xiàn)，在放置4 d出現(xiàn)綠色的菌落。含水量為50%的玉米樣品，放置時間在2～8 d均有黑色的菌落和黃色菌落產(chǎn)生，在放置第4 d時出現(xiàn)不同于水分含量為20%的深綠色菌落。

如圖1和圖2所示，將分離得到的5株優(yōu)勢菌株進行PCR擴增，同時獲得的ITS序列在NCBI中進行BLAST對比，5株菌株分別與Aspergillusniger(黑曲霉，MH511143.1)、Penicilliumchrysogenum(產(chǎn)黃青霉，MT141145.1)、Aspergillusflavus(黃曲霉，MT645322.1)、Aspergillusversicolor(雜色曲霉，MN416222.1)和Penicilliumexpansum(青霉，MK850332.1)同源性最高，相似度達到100%。黑曲霉生長快速，在糧食、植物及土壤中均可發(fā)現(xiàn)，極易通過空氣進行擴散，尤其是糧食水分含量高時易引起霉變。黃曲霉易在發(fā)霉的玉米和花生中發(fā)現(xiàn)，可以產(chǎn)生黃曲霉毒素危害人類及牲畜的健康。雜色曲霉產(chǎn)生雜色曲霉素(ST)普遍污染大米、玉米和小麥。青霉菌常見于變質(zhì)的果蔬、肉食和衣服上和糧食中，大多數(shù)為灰綠色，包括能夠產(chǎn)生青霉素的產(chǎn)黃青霉。

圖1 玉米中分離的霉菌

圖2 擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖

2.2 單種精油抑菌結(jié)果

圖3表示6種精油對這5種霉菌均具有一定的抑菌作用，其中丁香精油和大蒜精油的抑菌作用最明顯、可以看到出現(xiàn)很明顯的抑菌圈。薄荷、花椒和八角茴香精油對除黑曲霉外的霉菌表現(xiàn)出一定的抑制作用，橙皮精油對除黑曲霉和黃曲霉外的霉菌表現(xiàn)出一定的抑制作用。

注：a花椒精油；b丁香精油；c八角精油；d薄荷精油；e大蒜精油；f橙皮精油。圖3 單種精油對霉菌的抑菌效果

由表1可知，黑曲霉對丁香精油高度敏感；對大蒜精油中度敏感；對花椒、八角茴香、橙皮、薄荷精油不敏感；雜色曲霉對花椒、丁香、八角茴香精油高度敏感，對薄荷、大蒜、橙皮精油中度敏感；青霉菌對丁香、花椒、大蒜、薄荷、八角茴香精油高度敏感，對橙皮精油中度敏感；產(chǎn)黃青霉對丁香、大蒜精油高度敏感，對花椒、八角茴香、薄荷、橙皮精油中度敏感；黃曲霉對花椒、丁香、八角茴香精油高度敏感，對薄荷、大蒜精油中度敏感，對橙皮精油不敏感。同時上述霉菌對丙酸處理組均為高度敏感。

表1 單種精油對霉菌的抑菌圈直徑

通過對單種精油抑菌結(jié)果的分析，丁香、八角茴香、薄荷、花椒、大蒜精油及丙酸對5種玉米霉菌效果較好，但大蒜精油味道重且較難去除，會影響玉米的后續(xù)加工，而丙酸具有強烈刺激性氣味，對皮膚有刺激性，對容器、加工設(shè)備也有腐蝕性，因此不選擇大蒜精油和丙酸，而選擇丁香、花椒、八角茴香、薄荷精油進行復(fù)合，并進行抑菌實驗，這四種精油及丙酸的綜合抑菌能力大小依次為丁香>花椒>丙酸>八角茴香>薄荷，而且丁香精油和花椒精油的抑菌效果優(yōu)于八角茴香和薄荷精油，因此選擇這四種精油以MBC為精油濃度進行復(fù)合，得到復(fù)合精油1(丁香∶花椒∶八角茴香∶薄荷的體積比=1∶1∶1∶1)和復(fù)合精油2(丁香∶花椒∶八角茴香∶薄荷的體積比=2∶2∶1∶1)。

2.3 MIC的測定結(jié)果

精油MIC測定結(jié)果如表2所示。丁香精油對黑曲霉、雜色曲霉、青霉和產(chǎn)黃青霉的MIC為12.5μL/mL，對黃曲霉的的MIC為25 μL/mL。八角茴香對雜色曲霉和黃曲霉的MIC為25 μL/mL，對青霉的MIC為12.5 μL/mL?；ń肪蛯η嗝沟腗IC為12.5 μL/mL。大蒜精油對青霉的MIC為3.125μL/mL，對產(chǎn)黃青霉的MIC為12.5 μL/mL。薄荷精油對青霉的MIC為25 μL/mL。

表2 精油對5種霉菌的MIC測定

2.4 MBC的測定結(jié)果

精油對5株霉菌的MBC的測定結(jié)果如表3所示。丁香精油對黑曲霉和青霉的MBC為25 μL/mL、對雜色曲霉MBC為12.5 μL/mL，對產(chǎn)黃青霉和黃曲霉的的MBC為50 μL/mL。八角茴香對雜色曲霉和黃曲霉的MBC為50 μL/mL，對青霉的MBC為12.5 μL/mL。大蒜精油對青霉的MBC為12.5 μL/mL，對產(chǎn)黃青霉的MBC為25 μL/mL。薄荷精油對青霉的MBC為50 μL/mL。

表3 精油對5種霉菌的MBC測定

2.5 復(fù)合精油抑菌實驗結(jié)果

復(fù)合精油1和復(fù)合精油2對5種霉菌表現(xiàn)出明顯的抑制作用，尤其是對青霉菌，在培養(yǎng)基上沒有明顯的菌落生長；對產(chǎn)黃青霉，黑曲霉，黃曲霉和雜色曲表現(xiàn)一定的抑制作用，有較少的菌落出現(xiàn)在培養(yǎng)基上。同時由表4可知，5種霉菌均對復(fù)合精油1和復(fù)合精油2為高度敏感。抑菌能力大小依次為青霉菌>黃曲霉>產(chǎn)黃青霉>黑曲霉>雜色曲霉。而且復(fù)合精油對青霉的抑菌效果最佳，且這兩個復(fù)合精油抑菌效果基本相近，但精油抑菌成本較高，考慮到經(jīng)濟原因，因此選擇等體積比復(fù)合丁香，花椒，八角茴香，薄荷精油開發(fā)玉米防霉劑。

表4 復(fù)合植物精油對霉菌抑菌圈直徑

2.6 復(fù)合精油與單種精油實驗結(jié)果對比分析

將上述實驗所得到的復(fù)合精油1和復(fù)合精油2與單種精油抑菌圈判定的敏感度進行比對，由表5可發(fā)現(xiàn)5種霉菌對復(fù)合精油1和復(fù)合精油2的敏感度均為高度敏感，且均高于霉菌對單種精油的敏感度。由于精油經(jīng)過一定體積比的復(fù)合后可以起到協(xié)同增效的作用[26]，因此得到比單種精油更好的抑菌效果。

表5 復(fù)合植物精油與單種植物精油抑菌效果比較

3 結(jié)論

通過研究丁香，花椒，薄荷，八角茴香，大蒜，橙皮精油對黑曲霉、黃曲霉、雜色曲霉、青霉菌、產(chǎn)黃青霉的抑菌效果，發(fā)現(xiàn)丁香、八角茴香、薄荷、花椒、大蒜精油及丙酸對上述霉菌抑菌作用明顯，且抑菌能力大小依次為丁香>花椒>丙酸>八角茴香>薄荷，但大蒜精油味道重且較難去除，丙酸對皮膚有刺激性，對容器、加工設(shè)備有腐蝕性，因此選擇丁香、花椒、八角茴香、薄荷精油進行復(fù)合精油抑菌實驗。同時通過霉菌對相同劑量的單種植物精油和復(fù)合植物精油敏感程度的結(jié)果進行比對，得出復(fù)合精油1(丁香∶花椒∶八角茴香∶薄荷的體積比=1∶1∶1∶1)對黑曲霉、雜色曲霉、青霉菌、產(chǎn)黃青霉、黃曲霉的抑菌效果均比單種精油的抑菌作用明顯?？蔀閺?fù)合植物精油作為玉米及儲糧天然防霉劑的研究提供參考。