江凌峰， 周淑倩， 潘靖禹， 楊虎清， 陸國權(quán)， 李永新

(浙江農(nóng)林大學(xué)農(nóng)業(yè)與食品科學(xué)學(xué)院，臨安 311300)

甘薯[Ipomoeabatatas(L.) Lam.]屬塊莖類作物，是僅次于水稻、小麥、玉米的重要糧食作物[1]。甘薯具有較高的營養(yǎng)價值，富含微量元素和亞油酸等[2]。除食用以外，甘薯還可作為原料用于各類工業(yè)生產(chǎn)。甘薯是熱帶起源的作物，對儲藏溫度十分敏感，低溫容易造成冷害的發(fā)生，因此適宜的溫度對甘薯儲藏具有重要的作用和研究意義。閆海峰等[3]在75 d儲藏期內(nèi)測定甘薯失重率、干物率、可溶性總糖、淀粉、蛋白質(zhì)和維生素C的含量。楊正歌等[4]研究表明，儲藏過程中，蕎麥直鏈淀粉含量先下降再上升，淀粉膨脹度下降，且低溫條件儲藏時下降幅度更為明顯。陶向等[5]對不同甘薯品種的塊根在儲藏過程中淀粉含量的變化趨勢進(jìn)行了研究。

淀粉是影響甘薯食用品質(zhì)的重要因素之一，淀粉的理化性質(zhì)決定了其在各種應(yīng)用中的功能，例如，低直鏈淀粉含量的淀粉容易糊化并產(chǎn)生清晰的糊狀物，而高直鏈淀粉含量使淀粉有較高的回生傾向[8]。對不同儲藏溫度甘薯品質(zhì)變化以及甘薯儲藏過程中淀粉含量變化已大量的研究[5-7]，但針對新鮮甘薯儲藏后淀粉特性的變化卻鮮有報道。本實驗旨在研究不同溫度儲藏對甘薯淀粉含量及淀粉特性的影響，以期為甘薯儲藏及加工產(chǎn)業(yè)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

選取無病蟲害、無機(jī)械損傷，色澤、大小均勻、成熟度相近的新鮮“心香”甘薯用于實驗研究，將挑選好的甘薯設(shè)置3個分組，分別為4 ℃、13 ℃和20 ℃組，分別在3個不同溫度，75%濕度下儲藏0、7、14、21、28、42、56 d。由于42、56 d這2個時間點，尤其是56 d甘薯組織大面積壞死，RNA提取失敗，無法進(jìn)行GWD基因表達(dá)，故此指標(biāo)沒有42、56 d的實驗結(jié)果。

1.2 儀器與設(shè)備

MJX-280H恒溫培養(yǎng)箱，DGG-9053AD電熱恒溫鼓風(fēng)干烘箱，DSC-Q2000差示量熱掃描儀，T6新世紀(jì)紫外可見分光光度計，Step One PlusTMReal-Time PCR Instrument Thermal Cycling Block。

1.3 方法

1.3.1 甘薯淀粉制備

準(zhǔn)確稱取洗凈甘薯500 g，切成塊狀，放入打漿機(jī)，加適量水，間斷粉碎60 s，倒入100目紗袋，加0.5 L水洗提，另0.5 L水再洗提1次。將洗提液合并，過100目篩，靜置18 h (每6 h將上清液棄去，再加0.5 L水洗提，直至上清液澄清)。洗提干凈的淀粉置于50 ℃烘箱中干燥24 h，干燥后的淀粉研磨后過100目篩，入密封袋保存。

1.3.2 失重率測定

稱取5 kg甘薯鮮薯，稱質(zhì)量后置于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)保存，于不同的儲藏時間稱質(zhì)量。通過與原質(zhì)量對比計算，得到不同儲藏時間內(nèi)的失重率。

1.3.3 淀粉含量的測定

參考酸水解法測定淀粉。稱取鮮樣1.00 g于研缽，用5 mL 85%乙醇研磨成勻漿，再用25 mL乙醇分兩次清洗研缽將勻漿洗入50 mL離心管中，超聲30 min。然后在5 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心10 min后棄去上清液。加入20 mL 85%乙醇，旋渦振蕩均勻后再次離心，棄去上清液，取沉淀待測。在沉淀中加入6 mol/L 鹽酸溶液10 mL和蒸餾水14 mL，搖勻，沸水浴60 min。取出冷卻，將pH調(diào)至7.5左右后定容至100 mL容量瓶中，搖勻，DNS顯色后用紫外可見分光光度計于540 nm測吸光值，計算出實測淀粉含量。根據(jù)不同儲藏期甘薯的失重率可以計算出相對應(yīng)0 d的鮮薯質(zhì)量，再根據(jù)實測的淀粉含量計算出相對于鮮薯的淀粉含量。

淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)= 實測淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)×(1-失重率)

1.3.4 直鏈淀粉含量測定

參照 GB/T 15683—2008《大米直鏈淀粉含量的測定》，略加修改。稱取100 mg 提取后的甘薯淀粉加入1 mL無水乙醇充分潤濕樣品，再加入9 mL 1 mol/L NaOH溶液，于沸水浴中分散10 min，迅速冷卻后用蒸餾水定容至100 mL。吸取分散液1 mL于10 mL具塞試管中，再加入1 mL 1 mol/L乙酸溶液和0.5 mL碘液，用蒸餾水定容至10 mL后，靜置5 min，于620 nm處測定吸光值。

1.3.5 溶解度與膨脹度

準(zhǔn)確稱量0.50 g 提取后的淀粉樣品移入離心管中，加40 mL蒸餾水，振蕩均勻后85 ℃水浴30 min，取出后冷卻至室溫，4 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心20 min，將上清液輕輕倒出后記錄沉淀物質(zhì)量，再分別將上清液和沉淀物置于培養(yǎng)皿中130 ℃干燥至質(zhì)量恒定，溶解度(SA)和膨脹度(SP)計算公式為：

SA=(A/W)×100%

SP(g/g)=P/(W-A)

式中：P為離心管中沉淀濕質(zhì)量/g；A為上清液溶出物質(zhì)質(zhì)量/g；W為沉淀干燥質(zhì)量/g。

1.3.6 甘薯淀粉熱力學(xué)測定

準(zhǔn)確稱取一定量提取后的淀粉樣品并用微量進(jìn)樣器加入一定量的純水混勻于鋁坩堝中，使淀粉與水比值為3∶7。坩堝加蓋密封后，于室溫下平衡24 h，以空坩堝為參比，從20 ℃升溫至100 ℃，升溫速率10 ℃/min，通入氮氣速率50 mL/min。計算熱特征參數(shù)起始溫度T0、峰值溫度Tp、終止溫度Tc及熱焓(ΔH)。

1.3.7 甘薯淀粉酶活性測定

參考3,5-二硝基水楊酸法測定淀粉酶活性并加以修改。稱取1.00 g鮮樣，研磨勻漿，室溫靜置提取20 min，8 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心10 min，將上清液定容至100 mL，用于總淀粉酶、α-淀粉酶和β-淀粉酶的活性測定。酶活于540 nm波長下測定，以每分鐘生成麥芽糖的質(zhì)量為1個酶活單位[9]。

1.3.8 甘薯GWD基因家族篩選

利用GWD的保守結(jié)構(gòu)域(PF01326)結(jié)合HMMER 3.0軟件(http://hmmer.janelia.org/)檢索甘薯基因組數(shù)據(jù)庫，并通過Pfam(https://pfam.xfam.org/)和SMART(http://smart.embl.de/)進(jìn)行驗證其結(jié)構(gòu)域的存在，篩選比對得到甘薯GWD基因。從甘薯全基因組數(shù)據(jù)庫(https://ipomoea-genome.org/)得到甘薯的GWD蛋白序列和CDS序列。

1.3.9 甘薯GWD進(jìn)化樹構(gòu)建

為研究GWD基因系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，利用雙子葉植物擬南芥的淀粉磷酸化酶蛋白序列作為對比參考，使用軟件MEGA5.10對甘薯基因組中的GWD蛋白采用N-J法來制作淀粉磷酸化酶的系統(tǒng)進(jìn)化樹。N-J法需要選擇模型，而對于蛋白質(zhì)的序列來說，一般情況下應(yīng)采用泊松修正(Poisson Correction)模型。

1.3.10 葡聚糖-水合二激酶GWD基因表達(dá)測定

使用RNA，天根prep Pure Plant Plus Kit試劑盒(DP441)將甘薯RNA提取出后再利用RR047A-反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。應(yīng)用Step One Plus Real-Time PCR System擴(kuò)增儀將目標(biāo)引物基因進(jìn)行實時擴(kuò)增表達(dá)。

1.3.11 統(tǒng)計與分析

采用Origin 2017進(jìn)行圖表繪制。通過SPSS 20.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析(ANOVA)。用Duncan新復(fù)極差法做多重比較，差異顯著水平α=0.05。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同儲藏溫度下淀粉含量變化

甘薯的食味品質(zhì)與淀粉含量呈正相關(guān)，淀粉含量越高，食味品質(zhì)越好[10，11]。不同溫度下甘薯淀粉含量都會隨儲藏時間延長而降解，其中4 ℃下淀粉含量下降最快。剛收獲時心香甘薯有較高的淀粉含量，在前14 d的儲藏期內(nèi)淀粉含量下降緩慢。儲藏超過21 d后，4 ℃下甘薯中淀粉含量明顯低于13 ℃和20 ℃下儲藏甘薯。儲藏初期，13 ℃與20 ℃淀粉含量下降趨勢接近，但42 d后，13 ℃淀粉含量高于20 ℃，這可能是28 d后20 ℃呼吸作用加快淀粉降解速率導(dǎo)致的。結(jié)果表明4 ℃低溫儲藏促進(jìn)淀粉的降解，加速糖化，可能原因為：一是相關(guān)淀粉降解酶的活性增加，二是4 ℃下儲藏改變了淀粉結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致淀粉顆粒變小，加快了淀粉的降解速率[7]。儲藏28 d后4 ℃下甘薯已經(jīng)開始出現(xiàn)冷害癥狀，42、56 d尤為嚴(yán)重，其酚類化合物含量增加，細(xì)胞組織壞死，細(xì)胞液外滲并且出現(xiàn)水漬狀[12]，進(jìn)一步木質(zhì)化，失去食用品質(zhì)，這與林婕等[13]的研究結(jié)果相符。

注：同一時間不同字母表示差異顯著(P<0.05)，下同。圖1 不同儲藏時間及溫度對甘薯淀粉含量的影響

2.2 不同儲藏溫度下直鏈淀粉含量變化

甘薯儲藏過程中，直鏈淀粉含量變化如圖2所示。儲藏14 d內(nèi)，不同溫度間差異不明顯。隨儲藏時間延長，低溫儲藏組(4 ℃和13 ℃)甘薯直鏈淀粉含量明顯高于對照組(20 ℃)，直鏈淀粉比例升高，可能是低溫下支鏈淀粉降解更多的原因。

圖2 不同儲藏時間及溫度對甘薯直鏈淀粉含量的影響

淀粉的結(jié)構(gòu)、組成及其特性是決定其應(yīng)用的重要指標(biāo)，甘薯淀粉的結(jié)構(gòu)主要也是由直鏈淀粉和支鏈淀粉2種聚合物所構(gòu)成。直鏈淀粉比例對淀粉的熱力學(xué)特性有一定影響，其含量占比增大會導(dǎo)致糊化焓的下降[14]。直鏈淀粉與淀粉黏度特性也有一定的相關(guān)性，直鏈淀粉的增加會導(dǎo)致淀粉黏度的上升[15，16]。直鏈淀粉的含量還影響著淀粉分子之間的相互作用以及淀粉分子與其他食品原料(如多酚和脂類)之間的相互作用，以及在烹飪過程中淀粉分子的分解和再結(jié)合[17]，另外，直鏈淀粉的增加會導(dǎo)致淀粉回生速率加快[8]。

2.3 甘薯淀粉的溶解度及膨脹勢

淀粉的溶解度和膨脹勢反映了淀粉和水之間互相作用的大小，影響著甘薯淀粉及其制品的品質(zhì)，淀粉的溶解主要是直鏈淀粉從膨脹的顆粒中逸出[18]，可以用來評價淀粉鏈之間的交互作用程度，包括淀粉顆粒的非結(jié)晶區(qū)和結(jié)晶區(qū)域[19]。

不同儲藏溫度對儲藏后甘薯淀粉的溶解度如圖3a所示。隨著時間的延長，各個儲藏溫度下甘薯淀粉的溶解度逐漸下降，儲藏溫度對淀粉溶解度影響達(dá)到顯著水平(P<0.05)，與20 ℃相比，4 ℃和13 ℃下降更快。淀粉溶解度的下降有利于淀粉的回生[14]，低溫儲藏能加快采后甘薯淀粉的回生過程。

不同儲藏溫度對儲藏后甘薯淀粉的膨脹勢如圖3b所示。儲藏溫度對淀粉膨脹勢影響達(dá)到顯著水平(P<0.05)，儲藏28 d內(nèi)，4 ℃下降水平更快。出現(xiàn)這一現(xiàn)象的可能原因是儲藏后不溶性直鏈淀粉含量上升，淀粉粒晶體更加緊密，達(dá)到糊化溫度時，只是使微晶束有較大程度的松動，分子間仍有許多氫鍵未被拆開[20]，從而降低了水分子進(jìn)入淀粉微晶束的可能性，使得甘薯淀粉膨脹度呈現(xiàn)下降的趨勢。

圖3 不同儲藏時間及溫度對甘薯淀粉溶解度和膨脹勢的影響

2.4 不同儲藏溫度對淀粉熱特性影響

儲藏期間初始糊化溫度T0隨儲藏時間延長而減小，4、13 ℃低溫下變化更明顯，說明吸水膨脹特性減弱，加快淀粉糊化過程。淀粉糊化的過程實際是淀粉結(jié)晶的溶解，其中包括直鏈淀粉的浸出，結(jié)晶區(qū)域支鏈淀粉雙螺旋結(jié)構(gòu)的斷裂和分解[19]。

隨著儲藏時間的延長，淀粉糊化焓值ΔH逐漸下降，13 ℃儲藏下降更為明顯，28 d儲藏期內(nèi)4 ℃下糊化焓無明顯變化。甘薯淀粉的糊化溫度下降，熱焓值減小，這可能與甘薯淀粉顆粒的結(jié)晶區(qū)域縮小，淀粉顆粒內(nèi)部的束縛力逐漸減小有關(guān)[21]。糊化焓是淀粉糊化之前淀粉顆粒內(nèi)部分子鏈段有序性的衡量指標(biāo)，它是反映淀粉顆粒結(jié)晶度的重要參數(shù)，淀粉顆粒有序結(jié)構(gòu)破壞會導(dǎo)致糊化焓值下降[22]，由于甘薯的支鏈淀粉是其結(jié)晶區(qū)域的主要構(gòu)成部分，所以支鏈淀粉含量越少，直鏈淀粉含量越高，其糊化焓值越小[23]，這與本實驗結(jié)果相符。

表1 不同儲藏時間及溫度對甘薯淀粉熱力學(xué)特性的影響

2.5 不同儲藏溫度下甘薯淀粉酶活的變化

甘薯淀粉酶包含α-淀粉酶和β-淀粉酶，α-淀粉酶可隨機(jī)作用于淀粉中的α-1，4-糖苷鍵，生成葡萄糖、麥芽糖等還原糖，同時使淀粉的黏度降低；而β-淀粉酶可從淀粉的非還原性末端水解麥芽糖，使甘薯煮后具有甜味[24]。兩者共同作用于淀粉的降解。

由圖4可知，4、13 ℃兩組甘薯在56 d儲藏期間β-淀粉酶活性高于α-淀粉酶活性，而20 ℃組甘薯在儲藏28 d后β-淀粉酶活性逐漸接近直至高于α-淀粉酶活性。甘薯α-淀粉酶和β-淀粉酶在不同條件下淀粉降解過程中分別占據(jù)主要地位，項超等[25]的研究發(fā)現(xiàn)，甘薯在不同溫度蒸煮下β-淀粉酶起主導(dǎo)作用。本結(jié)果說明低溫儲藏甘薯在56 d儲藏期內(nèi)淀粉降解過程中β-淀粉酶起主導(dǎo)作用。

圖4 不同儲藏時間及溫度對甘薯α-淀粉酶、β-淀粉酶以及總淀粉酶活性的影響

不同儲藏溫度下總淀粉酶變化趨勢如圖4c所示，3組甘薯的總淀粉酶活性均呈先下降后上升的變化趨勢，可能是因為初期儲藏環(huán)境的改變導(dǎo)致總酶活性的下降，以14 d為轉(zhuǎn)折點，在14 d后總淀粉酶活性開始慢慢恢復(fù)初始水平。儲藏期間4 ℃總淀粉酶活性均高于另外2組，這一結(jié)果與楊明等[26]在研究不同儲藏溫度對馬鈴薯生理品質(zhì)的影響中的結(jié)果相符，原因可能是低溫糖化作用。數(shù)據(jù)結(jié)果顯示在56 d的儲藏內(nèi)20 ℃下甘薯總淀粉酶活性高于13 ℃。

總淀粉酶活與淀粉含量綜合分析可以得出淀粉含量與總淀粉酶活呈負(fù)相關(guān)，總淀粉酶活性高的4 ℃組淀粉含量低，這是因為淀粉降解主要是在淀粉酶的催化作用下轉(zhuǎn)化成糖。也有相關(guān)實驗證明低溫能夠促進(jìn)淀粉降解相關(guān)酶基因的表達(dá)。

2.6 甘薯GWD系統(tǒng)進(jìn)化分析

在生物學(xué)中，進(jìn)化樹建立是為了分析基因家族成員，得到物種起源進(jìn)化或親緣關(guān)系方面的信息，淀粉磷酸化可以改變淀粉顆粒表面有序的結(jié)構(gòu)，繼而促進(jìn)葡萄糖苷鍵之間的裂解[27]。AtGWD1位于質(zhì)體中，起到催化淀粉磷酸化反應(yīng)，與擬南芥臨時淀粉降解的起始有關(guān)[28]。通過圖5可以得出，GWD家族明顯分為兩支，即GWD1和GWD2，甘薯中的IbGWD1-1、IbGWD1-2的蛋白序列與擬南芥中AtGWD1的親緣關(guān)系較近。

注：At為擬南芥；Ib為甘薯。圖5 GWD基因的N-J法系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.7 葡聚糖-水合二激酶(GWD)在不同儲藏時間及溫度下表達(dá)情況

葡聚糖-水合二激酶(Glucan-water dikinase，GWD)是淀粉磷酸化酶，其參與的淀粉磷酸化過程是淀粉降解的第一步，也是淀粉降解前提，不僅在淀粉降解的進(jìn)程中有著至關(guān)重要的作用[29]，還可以改變淀粉的理化特性，使淀粉糊透光率增大、糊化溫度下降、凍融穩(wěn)定性與黏度升高和凝膠強(qiáng)度降低等[30]。本研究檢測了儲藏28 d內(nèi)GWD基因的表達(dá)情況。由圖6a可知，與收獲時相比，20 ℃儲藏28 d內(nèi)IbGWD1-1的表達(dá)量逐漸下降。而4、13 ℃儲藏下，IbGWD1-1基因相對表達(dá)量維持在較高水平。然而，4 ℃抑制了IbGWD1-2基因表達(dá)，而13、20 ℃下，IbGWD1-2表達(dá)水平相對穩(wěn)定(圖6b)。

圖6 不同儲藏時間及溫度下GWD1-1和GWD1-2的相對表達(dá)量

一般認(rèn)為，GWD負(fù)責(zé)將淀粉磷酸化，促進(jìn)淀粉降解。淀粉測定結(jié)果顯示低溫促進(jìn)淀粉降解，這可能跟低溫下IbGWD1-1被激活有關(guān)。從表達(dá)結(jié)果顯示，IbGWD1-1被低溫強(qiáng)烈誘導(dǎo)，因此IbGWD1-1可能與低溫誘導(dǎo)淀粉加速降解相關(guān)。

3 結(jié)論

不同儲藏溫度對甘薯淀粉特性有顯著影響。隨著儲藏時間的延長，淀粉含量逐漸下降，這與總淀粉酶活性和淀粉磷酸化酶IbGWD1-1表達(dá)量相關(guān)，且低溫儲藏(4、13 ℃)下在此過程中β-淀粉酶起主導(dǎo)作用。13 ℃儲藏下甘薯淀粉溶解度逐漸下降，直鏈淀粉含量緩慢上升，淀粉更易回生；糊化起始溫度以及熱焓值逐漸下降，淀粉穩(wěn)定性提高，可能原因是在13 ℃儲藏下甘薯淀粉顆粒的晶體結(jié)構(gòu)的無序化程度逐漸增加，結(jié)晶區(qū)內(nèi)的結(jié)合力減弱，導(dǎo)致淀粉糊化不再需要較高的溫度，從而造成糊化溫度降低，且熱焓值降低更為明顯。4 ℃淀粉降解快的另一個可能原因是4 ℃儲藏改變了淀粉結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致淀粉顆粒變小，加快了淀粉的降解速率。