曹中贊，蓋葉丹，陳美月，劉 梅，高 明，王皓宇，欒新紅

（沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與醫(yī)學(xué)學(xué)院，遼寧沈陽(yáng) 110161）

屬于叉頭基因（Forkhead）轉(zhuǎn)錄因子家族成員，參與調(diào)節(jié)包括細(xì)胞凋亡、增殖、分化、自噬等多個(gè)生理過(guò)程。利用外源FOXO3蛋白處理體外培養(yǎng)的雞卵泡顆粒細(xì)胞可使促凋亡相關(guān)基因表達(dá)量上升。利用攜帶基因的重組腺病毒感染體外培養(yǎng)的大鼠卵泡顆粒細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)會(huì)增加促凋亡蛋白Bim的表達(dá)。此外，還可以通過(guò)改變某些凋亡相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平影響自噬，當(dāng)過(guò)表達(dá)時(shí)可以促進(jìn)促凋亡基因的轉(zhuǎn)錄，由于自噬調(diào)控蛋白Beclin1錨定在Bim的BH3區(qū)域，與微管相關(guān)蛋白l輕鏈3（LC3）相連，一旦Bim被激活，Beclin1就會(huì)被釋放到細(xì)胞質(zhì)中啟動(dòng)自噬系統(tǒng)。被上游相關(guān)因子激活后，可以通過(guò)調(diào)控下游凋亡、自噬、增殖相關(guān)基因來(lái)調(diào)節(jié)動(dòng)物的生殖過(guò)程。在雞卵泡發(fā)育的各個(gè)階段中均有的表達(dá)，干擾表達(dá)時(shí)卵泡顆粒細(xì)胞中和表達(dá)量均顯著下降。卵泡顆粒細(xì)胞凋亡是卵泡發(fā)生閉鎖的重要而直接的因素。細(xì)胞自噬與凋亡關(guān)系密切，顆粒細(xì)胞的自噬通過(guò)影響凋亡直接參與卵泡發(fā)育各個(gè)階段的閉鎖。在豬卵巢中呈現(xiàn)卵泡發(fā)育階段特異性和細(xì)胞特異性表達(dá)，在卵泡的生長(zhǎng)和閉鎖過(guò)程中發(fā)揮重要作用。對(duì)健康、早期閉鎖和發(fā)展中閉鎖階段的豬卵泡顆粒細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)量的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在閉鎖卵泡中表達(dá)量顯著增加，且隨著閉鎖程度的加重不斷升高。目前關(guān)于基因在鵝卵泡顆粒細(xì)胞凋亡和自噬中可能發(fā)揮的作用還未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)構(gòu)建基因真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染至鵝卵泡顆粒細(xì)胞，檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞凋亡和自噬相關(guān)基因表達(dá)的影響，旨在為進(jìn)一步探討基因?qū)Z卵泡發(fā)育及閉鎖的調(diào)控作用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和樣品采集 產(chǎn)蛋期健康雌鵝取自遼寧省遼陽(yáng)市某種鵝場(chǎng)，頸部放血處死。剝凈腹部羽毛，打開(kāi)腹腔取出卵巢，采集等級(jí)卵泡，置于4℃預(yù)冷的PBS中清洗干凈，以便進(jìn)行后續(xù)顆粒細(xì)胞的分離。將剩余組織置于凍存管中，迅速放入液氮，后轉(zhuǎn)移至-80℃超低溫冰箱中保存。

1.2 主要試劑與儀器 pMD18-T克隆載體、PrimeScriptRT reagent Kit with gDNA Eraser、SYBRPremix Ex TaqII、T4 DNA連接酶、限制性?xún)?nèi)切酶III、I購(gòu)于寶生物工程（大連）有限公司；pcDNA3.1表達(dá)載體購(gòu)自Invitrogen公司；DH5大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞、2×Taq PCR MasterMix、質(zhì)粒小提和大提試劑盒購(gòu)于天根生化科技（北京）有限公司；Trizol試劑盒、DNA Marker、凝膠回收試劑盒購(gòu)于南京諾唯贊生物科技有限公司；M199培養(yǎng)基、雙抗購(gòu)于以色列BI生物公司；胎牛血清購(gòu)于杭州四季青有限公司；IV型膠原酶購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；LipoFiter轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)于漢恒生物科技（上海）有限公司。Myc標(biāo)簽抗體購(gòu)于碧云天生物技術(shù)有限公司；GAPDH抗體購(gòu)于巴基斯坦Santa Cruz公司；山羊抗兔二抗購(gòu)于美國(guó)Proteintech公司；ECL化學(xué)發(fā)光染料、硝酸纖維素膜、RIPA蛋白提取試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自北京普利萊基因技術(shù)有限公司。

-80℃超低溫冰箱（賽默飛世爾科技公司）；核酸蛋白分析儀、高速冷凍離心機(jī)（BECKMAN儀器有限公司）；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀、凝膠成像分析儀、PCR儀、電泳儀、Western Blot轉(zhuǎn)印制膠系統(tǒng)（伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司）；恒溫震蕩培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；二氧化碳培養(yǎng)箱（香港Heraeus有限公司）；全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（深圳博大博聚科技有限公司）；化學(xué)發(fā)光型凝膠成像系統(tǒng)（以色列DNR公司）。

1.3基因CDS序列的擴(kuò)增與克隆 根據(jù)GenBank上的鵝基因序列（XM_013175636.1）和pMD18-T載體以及pcDNA3.1載體上的多克隆酶切位點(diǎn)，應(yīng)用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，并在正、反向引物的5′端分別插入Hind III、Nhe I酶切位點(diǎn)。正向引物為5′-CTAGCTAGCGCCACCATGAACTCAATCCGGC AC-3′，反向引物為5′-CCCAAGCTTTCAGCCTGGTA CCCAACTC-3′，下劃線(xiàn)部分分別為III、I酶切位點(diǎn)。預(yù)期擴(kuò)增片段大小為1 404 bp。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行合成。

用Trizol試劑盒提取鵝卵巢組織總RNA，用核酸蛋白分析儀測(cè)定其濃度和純度。按照PrimeScriptRT reagent Kit with gDNA Eraser反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。以cDNA為模板，利用SYBRPremix Ex TaqII試劑盒和上述基因特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸90 s，30個(gè)循環(huán)；72℃再延伸10 min。對(duì)PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，用DNA膠回收試劑盒回收純化目的片段。將純化的目的基因PCR產(chǎn)物連接于pMD18-T克隆載體，轉(zhuǎn)化至DH5大腸桿菌，通過(guò)菌液PCR鑒定陽(yáng)性克隆，送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。

1.4真核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定 提取陽(yáng)性克隆菌液pMD18-T-質(zhì)粒。用III和I雙酶切pMD18-T-和pcDNA3.1質(zhì)粒，用凝膠回收試劑盒回收酶切產(chǎn)物，用T4 DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5感受態(tài)細(xì)胞，均勻涂布至含氨芐青霉素的LB瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)12 h。挑取單菌落進(jìn)行PCR和雙酶切鑒定，陽(yáng)性克隆菌液送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序，用NCBI上BLAST工具進(jìn)行序列分析。測(cè)序正確的克隆菌液用質(zhì)粒大提試劑盒提取質(zhì)粒備用。

1.5 鵝原代卵泡顆粒細(xì)胞的分離培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 取在PBS中清洗干凈的等級(jí)卵泡，用鑷子將卵泡外層的結(jié)締組織剝?nèi)ィ俅吻逑?，用眼科剪在卵泡血管少處剪一小口，稍微用力擠出卵黃，顆粒細(xì)胞層隨之而出。將顆粒細(xì)胞層置于裝有PBS的平皿中，洗凈卵黃成分，然后轉(zhuǎn)移到小燒杯中，加入IV型膠原酶，用眼科剪將顆粒細(xì)胞層剪碎，置于37℃消化5 min。用濾網(wǎng)過(guò)濾，濾液于室溫、1 000 rpm離心8 min。棄上清，加入適量的M199細(xì)胞培養(yǎng)液懸浮沉淀的細(xì)胞，再次室溫、1 000 rpm離心8 min，留取沉淀，加入1 mL含有10%胎牛血清的M199細(xì)胞培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀進(jìn)行計(jì)數(shù)，按照1×10個(gè)/mL細(xì)胞密度將細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)皿中，置于37℃、5% CO條件下培養(yǎng)。待細(xì)胞匯合度達(dá)到70%～80%時(shí)使用LipoFiter轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，具體步驟參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)設(shè)置對(duì)照組、pcDNA3.1空載體組和pcDNA3.1-組3個(gè)組，每組3個(gè)重復(fù)。

1.6 熒光定量PCR檢測(cè) 轉(zhuǎn)染后48 h收集各組細(xì)胞，用Trizol試劑盒提取細(xì)胞總RNA，檢測(cè)RNA質(zhì)量后，用PrimeScriptRT reagent Kit with gDNA Eraser進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)獲得cDNA，用SYBRPremix Ex TaqII試劑盒進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)及細(xì)胞凋亡和自噬相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司設(shè)計(jì)合成，具體引物信息見(jiàn)表1。反應(yīng)體系20 μL：2 μL cDNA模板（50 ng/μL），10 μL SYBR Ex Taq II（2×），上下游引物（10 μM）各0.8 μL，RNasefree ddHO 6.4 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性30 s；95℃變性10 s，60℃退火延伸30 s，40個(gè)循環(huán)。為內(nèi)參基因，用2法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。每組3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)樣本進(jìn)行3次重復(fù)分析。

表1 熒光定量PCR引物信息

1.7 Western Blot檢測(cè) 用RIPA蛋白提取試劑盒提取細(xì)胞總蛋白，用BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定。配制12%聚丙烯胺凝膠，每孔上樣20 μg，電泳條件為110 V、1.5 h，采用半干轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜條件為0.15 A、1.5 h。室溫條件下10%脫脂奶粉封閉1 h，TBST漂洗2次，4℃Myc抗體過(guò)夜孵育，TBST漂洗3次，室溫下二抗孵育1 h，TBST漂洗3次，用ECL發(fā)光液進(jìn)行顯影。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析 用SPSS 19軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行One-Way ANOVA分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。<0.05為差異顯著，<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 鵝基因CDS序列的克隆 提取鵝卵巢組織總RNA后，反轉(zhuǎn)錄生成cDNA，以cDNA為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增基因的CDS序列。將膠回收純化的PCR產(chǎn)物克隆到pMD18-T載體，進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，如圖1所示，在1 400 bp處出現(xiàn)目的條帶，片段大小與預(yù)期結(jié)果相符（基因的CDS長(zhǎng)度為1 404 bp），且無(wú)其他雜帶。測(cè)序結(jié)果經(jīng)BLAST比對(duì)與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中模板序列完全一致，表明成功獲得克隆質(zhì)粒pMD18-T-。

圖1 FOXO3克隆載體菌液PCR結(jié)果

2.2 鵝基因真核表達(dá)載體pcDNA3.1-的構(gòu)建及鑒定 以pcDNA3.1為骨架載體，III和I雙酶切pMD18-T-和pcDNA3.1，連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)篩選提取陽(yáng)性克隆質(zhì)粒，進(jìn)行III和I雙酶切鑒定，酶切后釋放出分別與空載體和目的片段相應(yīng)大小的條帶，結(jié)果與預(yù)期相符（圖2）。將雙酶切鑒定為陽(yáng)性的重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明pcDNA3.1-重組質(zhì)粒所插入的片段與的CDS序列相同，表明鵝基因的真核表達(dá)載體構(gòu)建成功。

圖2 pcDNA3.1-FOXO3重組質(zhì)粒雙酶切鑒定結(jié)果

2.3 鵝基因在卵泡顆粒細(xì)胞中的過(guò)表達(dá) 將過(guò)表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-轉(zhuǎn)染到鵝卵泡顆粒細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA，利用熒光定量PCR檢測(cè)重組質(zhì)粒表達(dá)情況。如圖3所示，pcDNA3.1-組基因的mRNA表達(dá)水平（1.40±0.14）高于 pcDNA3.1空載體組（1±0.084）和對(duì)照組（1±0.1）（<0.05），表明基因在鵝卵泡顆粒細(xì)胞中成功過(guò)表達(dá)。利用標(biāo)簽抗體進(jìn)行Western Blot檢測(cè)，如圖4所示，真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-在卵泡顆粒細(xì)胞中成功表達(dá)。

圖3 轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞FOXO3 mRNA表達(dá)水平

圖4 轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞FOXO3蛋白表達(dá)水平

2.4 鵝基因過(guò)表達(dá)對(duì)細(xì)胞凋亡和自噬相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平的影響 如圖5所示，基因過(guò)表達(dá)后，卵泡顆粒細(xì)胞中細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平均升高（<0.05）。而自噬相關(guān)基因LC3和Beclin1的mRNA表達(dá)水平均降低（<0.05）。

圖5 過(guò)表達(dá)FOXO3基因后細(xì)胞凋亡和自噬相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平

3 討 論

半胱天冬酶（Caspase）蛋白酶家族是細(xì)胞凋亡的主要下游效應(yīng)器，在Caspase家族中，Caspase3是凋亡的關(guān)鍵執(zhí)行分子和主要效應(yīng)分子。Caspase3的活化是不同細(xì)胞凋亡的共同途徑，機(jī)體內(nèi)主要的2種細(xì)胞凋亡途徑——線(xiàn)粒體途徑和死亡受體途徑都可以通過(guò)作用于Caspase3引起細(xì)胞凋亡。本研究將構(gòu)建的真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至鵝卵泡顆粒細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，Caspase3的mRNA表達(dá)水平顯著升高，這與豬、雞卵泡顆粒細(xì)胞中凋亡誘導(dǎo)因子的結(jié)論一致。

和同屬基因家族，該家族基因主要通過(guò)調(diào)節(jié)線(xiàn)粒體膜的電位和通透性來(lái)調(diào)控細(xì)胞凋亡。是促進(jìn)細(xì)胞凋亡的重要基因之一，過(guò)量表達(dá)可激活Caspase，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。基因是主要的抗凋亡基因，過(guò)量表達(dá)可以提高細(xì)胞對(duì)不利環(huán)境的抵抗力，抑制細(xì)胞發(fā)生凋亡。是的天然配體，屬于腫瘤壞死因子家族，系統(tǒng)是最典型的死亡受體凋亡途徑。與結(jié)合后激活細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的Caspase8，活化的Caspase8進(jìn)一步激活Caspase3，從而引發(fā)細(xì)胞凋亡。本研究對(duì)過(guò)表達(dá)后Caspase3的上游因子和進(jìn)行了mRNA表達(dá)水平的檢測(cè)，結(jié)果顯示較對(duì)照組相比，和表達(dá)量均明顯升高，這說(shuō)明可能調(diào)控卵泡顆粒細(xì)胞的凋亡過(guò)程，而這種調(diào)控作用可能是通過(guò)參與到介導(dǎo)的線(xiàn)粒體凋亡途徑和介導(dǎo)的死亡受體途徑中實(shí)現(xiàn)的。

LC3是一種與自噬過(guò)程有關(guān)的重要蛋白。LC3靶向定位于自噬體膜，參與自噬體的形成，被認(rèn)為是自噬體的標(biāo)志分子，其表達(dá)水平的高低可以直接反映出機(jī)體自噬發(fā)生的嚴(yán)重程度。Beclin1屬于Bcl-2蛋白家族，是真核生物細(xì)胞自噬機(jī)制的核心調(diào)控元件，參與自噬體的形成與成熟，其表達(dá)與細(xì)胞內(nèi)自噬體發(fā)生密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)某些外界因素激活使其活化時(shí)能夠增加自噬小體的形成和自噬相關(guān)基因如的表達(dá)，進(jìn)而直接參與到自噬反應(yīng)的調(diào)控中。除了參與卵泡顆粒細(xì)胞的凋亡和增殖外，還能調(diào)節(jié)顆粒細(xì)胞的自噬，利用神經(jīng)酰胺誘導(dǎo)形成卵巢癌細(xì)胞模型，發(fā)現(xiàn)表達(dá)量增加，LC3蛋白表達(dá)量明顯上升，自噬發(fā)生。也有研究表明，被PI3K-AKT信號(hào)通路磷酸化后失活，促進(jìn)了谷氨酰胺合成酶的合成，以谷氨酰胺合成酶依賴(lài)性方式阻止雷帕霉素靶蛋白（Mammalian Target of Rapamycin，mTOR）易位至溶酶體膜，進(jìn)而導(dǎo)致mTOR活性抑制，促進(jìn)了自噬的發(fā)生。因此，對(duì)自噬的影響如何還要根據(jù)其參與的調(diào)節(jié)途徑具體分析。在本研究中，將真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至鵝卵泡顆粒細(xì)胞后，和的mRNA表達(dá)水平均顯著下降。過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)后表達(dá)量上升，而B(niǎo)cl-2/Beclin1復(fù)合體是細(xì)胞自噬的一條重要激活通路，正常情況下Bcl-2與Beclin1結(jié)合能力較強(qiáng)，可以抑制Beclin1與其他自噬蛋白形成復(fù)合體，降低其對(duì)自噬的推進(jìn)作用，并且這條信號(hào)通路是獨(dú)立于AKT/的新型自噬通路，而本研究中的表達(dá)量上調(diào)很有可能激活了這條自噬調(diào)控通路，Bcl-2/Beclin1與介導(dǎo)的信號(hào)通路共同調(diào)節(jié)了卵泡顆粒細(xì)胞的自噬。

4 結(jié) 論

本研究成功構(gòu)建了鵝真核表達(dá)載體。鵝卵泡顆粒細(xì)胞過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，基因可影響鵝卵泡顆粒細(xì)胞中凋亡和自噬相關(guān)基因和的表達(dá)。本研究結(jié)果有望為進(jìn)一步探討基因?qū)Z乃至禽類(lèi)卵泡發(fā)育及閉鎖的作用奠定基礎(chǔ)。