房巧燕 袁 昊 陶 鳳

肺動(dòng)脈高壓(pulmonary hypertension，PH)是一種以肺動(dòng)脈壓和肺血管阻力進(jìn)行性增加為特征的疾病。在極少數(shù)情況下，PH可導(dǎo)致嬰兒發(fā)生右心衰竭并死亡[1]。缺氧被認(rèn)為是PH發(fā)病的危險(xiǎn)因素之一[2]。肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(pulmonary artery smooth muscle cell，PASMC)是血管系統(tǒng)的重要組成部分，在低氧反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用，其功能失調(diào)與PH的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[3-4]。近年的研究[5]結(jié)果表明，慢性缺氧誘導(dǎo)的PASMC凋亡抑制和增殖增強(qiáng)是低氧性肺動(dòng)脈高壓(hypoxic pulmonary hypertension，HPH)發(fā)生的主要原因。罹患HPH新生兒的病死率較高，故亟須尋找治療該疾病的潛在靶點(diǎn)。微核糖核酸(microRNA, miRNA)是一種非編碼小RNA，通過與靶基因3’-非翻譯區(qū)(3’-UTR)結(jié)合負(fù)向調(diào)節(jié)基因的表達(dá)[6]。已有研究[7]結(jié)果表明，多種miRNA參與HPH的發(fā)生、發(fā)展，其中miRNA-124(簡稱miR-124)在缺氧處理的PASMC中表達(dá)下調(diào)，并具有抗增殖和促分化作用[8]，提示干預(yù)miR-124可能具有治療HPH的作用。本研究擬構(gòu)建HPH新生大鼠模型，探討miR-124過表達(dá)對(duì)HPH新生大鼠血管重塑的影響，并探究miR-124與Jagged2的靶向關(guān)系及其對(duì)split多毛增強(qiáng)子1(hairy and enhancer of split 1，Hes-1)蛋白表達(dá)的影響，以期為HPH的臨床診療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 60只體重為15～25 g的7日齡Wistar雄性新生大鼠購自廣州中醫(yī)藥大學(xué)，許可證號(hào)為SYXK(粵)2019-0144。所有動(dòng)物均飼養(yǎng)于溫度為25 ℃、濕度為55%的環(huán)境中，12 h明暗周期循環(huán)，提供充足的食物和水進(jìn)行適應(yīng)性飼養(yǎng)。按照3R[減少(reduction)、替代(replacement)、優(yōu)化(refinement)]原則進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，符合國家實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物倫理保護(hù)標(biāo)準(zhǔn)及相關(guān)法規(guī)。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑 NO測定試劑盒(貨號(hào)：A013-2-1)、內(nèi)皮素(endothelin，ET)測試盒(貨號(hào)：H093)和血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ，Ang Ⅱ)測試盒(貨號(hào)：H185)均購自南京建成生物工程研究所。miR-124激動(dòng)劑(agomir)與miR-124 陰性對(duì)照(NC)由廣州市銳博生物科技有限公司合成。H-E染色試劑盒(貨號(hào)：C0105)購自上海碧云天生物科技有限公司。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒(貨號(hào)：D0010)購自北京索萊寶生物科技有限公司。Jagged2一抗(貨號(hào)：2205)和Hes-1一抗(貨號(hào)：11988)均購自美國Cell Signaling Technology公司。

1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器 MP160型16通道生理儀購自美國BIOPAC公司，光學(xué)顯微鏡購自日本Nikon公司，酶標(biāo)儀Fax-20100購自美國INStat公司，蛋白凝膠成像儀和電泳儀均購自美國Bio-Rad公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 動(dòng)物分組及模型制備 將48只Wistar新生大鼠隨機(jī)分為常氧組、低氧組(低氧刺激)、miR-124組(低氧刺激+miR-124 agomir)和miR-124 NC組(低氧刺激+miR-124 NC)，每組12只。miR-124組和miR-124 NC組分別于大鼠尾靜脈注射200 μg/kg的miR-124 agomir和miR-124 NC ，每日1次，連續(xù)6 d；末次注射24 h后，除常氧組大鼠予正常飼養(yǎng)外，其余3組大鼠均置于氧氣(O2)體積分?jǐn)?shù)為0.1的常壓低氧艙中，每天8 h，連續(xù)放置28 d。采用右心導(dǎo)管法檢測各組大鼠的右心室收縮壓(right ventricular systolic pressure，RVSP)：首先切開大鼠頸部皮膚，分離右頸外靜脈，將含肝素鈉的導(dǎo)管緩慢插入靜脈中，行至右心室時(shí)將導(dǎo)管末端連接探測儀，觀察波形并調(diào)整導(dǎo)管位置，待波形典型且穩(wěn)定后記錄，應(yīng)用PowerLab軟件分析數(shù)據(jù)[9]。若低氧組大鼠RVSP較常氧組明顯增高，則證實(shí)HPH大鼠模型建立成功[10]。

1.4.2 樣本采集 缺氧暴露28 d后，腹腔內(nèi)注射10%烏拉坦(10 mg/kg)麻醉各組大鼠，使用壓力信號(hào)采集系統(tǒng)記錄平均肺動(dòng)脈壓(mPAP)。打開大鼠胸腔，分離右心室，計(jì)算右心室肥大指數(shù)[右心室與左心室加室間隔的濕重比：RV/(LV+S)]。迅速取出肺組織，左肺置于4%多聚甲醛中固定，右肺液氮速凍后置于-80 ℃中保存。收集腹主動(dòng)脈血液樣本，離心，取上清液，置于-20 ℃中保存。

1.4.3 肺組織病理學(xué)檢測 將固定在4%多聚甲醛中的肺組織，經(jīng)脫水透明和浸蠟包埋處理，制備成厚度為4 μm的石蠟切片，行H-E染色。于光學(xué)顯微鏡下觀察并拍攝大鼠肺小動(dòng)脈的病理學(xué)變化。應(yīng)用Image-pro Plus 6.0軟件測量肺動(dòng)脈的外徑(external diameter，ED)、內(nèi)壁厚度(medial-wall thickness，MT)、內(nèi)側(cè)橫截面積(medial cross-sectional area，MA)、管腔橫截面積(vessel lumen cross-sectional area，VA)和總動(dòng)脈橫截面積(total arterial cross-sectional area，TAA)。計(jì)算肺血管MT與ED的比值(即MT%)、MA與TAA的比值(即MA%)，以評(píng)估肺動(dòng)脈血管重塑的程度。

1.4.4 血管活性物質(zhì)檢測 根據(jù)測定試劑盒說明書的步驟，測定血清NO、ET和Ang Ⅱ水平。

1.4.5 雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-124與Jagged2的靶向關(guān)系 應(yīng)用TargetScan軟件分析，預(yù)測miR-124與Jagged2 3’-UTR的結(jié)合位點(diǎn)。于無菌條件下分離出大鼠肺動(dòng)脈，切除結(jié)締組織，制備成原代PASMC懸液，連續(xù)傳代、培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期，接種于96孔培養(yǎng)板上，將細(xì)胞分為miR-124 模擬物(mimics)+Jagged2 野生型(WT)組、miR-124 NC+Jagged2 WT組、miR-124 mimics+Jagged2突變型(MUT)組和miR-124 NC +Jagged2 MUT組，每組含3個(gè)重復(fù)樣本，采用pmirGLO熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒行共轉(zhuǎn)染處理。轉(zhuǎn)染48 h后，應(yīng)用雙熒光素酶檢測試劑盒檢測各組PASMC熒光強(qiáng)度。

1.4.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn) 使用RNA提取試劑盒從大鼠肺組織勻漿中提取總RNA。應(yīng)用NanoDrop分光光度計(jì)測定RNA的水平和純度，PrimeScript RT試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，共45個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸1 min。采用2-ΔΔCT法對(duì)組織中miR-124及Jagged2 mRNA的表達(dá)量行相對(duì)定量分析。引物序列見表1，miR-124和Jagged2 mRNA分別以U6和β-actin作為內(nèi)參。

表1 引物序列

1.4.7 免疫印跡實(shí)驗(yàn) 從肺組織勻漿中提取總蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)水平應(yīng)用Pierce BCA蛋白測定試劑盒進(jìn)行定量。應(yīng)用7.5%～12.0%含十二烷基硫酸鈉的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白質(zhì)樣品，后將蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。在室溫下，以5%脫脂牛奶封閉含目的蛋白質(zhì)的PVDF膜1 h后，在4 ℃下，將PVDF膜與Jagged2、Hes-1、β-actin一抗(稀釋倍數(shù)為1∶1 000)分別共同孵育過夜。以TBST溶液洗滌PVDF膜4次后，在室溫下，將PVDF膜與二抗共同孵育1 h，清洗并曝光顯色。以β-actin為內(nèi)參蛋白質(zhì)，分析目的蛋白質(zhì)的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1 miR-124對(duì)HPH大鼠右心循環(huán)和肺動(dòng)脈血管重塑的影響 與常氧組相比，低氧組和miR-124 NC組大鼠的mPAP、右心室肥大指數(shù)、MT%和MA%均顯著升高(P值均<0.05)。與低氧組和miR-124 NC組相比，miR-124組大鼠的mPAP、右心室肥大指數(shù)、MT%和MA%顯著降低(P值均<0.05)。低氧組與miR-124 NC組間上述指標(biāo)的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)。見表2。

A 常氧組 B 低氧組 C miR-124組 D miR-124 NC組圖1 4組HPH大鼠肺動(dòng)脈病理學(xué)變化(H-E染色，×400)

表2 miR-124對(duì)HPH大鼠右心循環(huán)和肺動(dòng)脈血管重塑的影響

2.2 miR-124對(duì)HPH大鼠肺動(dòng)脈病理學(xué)變化的影響 肺組織H-E染色結(jié)果顯示，常氧組大鼠肺動(dòng)脈壁完整光滑，細(xì)胞分布整齊、致密，管壁薄而均勻，肌層未見增厚；與之相比，低氧組和miR-124 NC組大鼠肺動(dòng)脈壁明顯增厚，管腔變窄，細(xì)胞排列紊亂，呈現(xiàn)肺動(dòng)脈重塑特征。與miR-124 NC組相比，miR-124組大鼠的肺動(dòng)脈壁增厚程度明顯減輕，管腔狹窄不明顯。見圖1。

2.3 miR-124對(duì)HPH大鼠血清NO、ET和Ang Ⅱ水平的影響 與常氧組相比，低氧組和miR-124 NC組大鼠血清ET和Ang Ⅱ水平均顯著升高(P值均<0.05)，NO水平顯著降低(P<0.05)。與低氧組和miR-124 NC組相比，miR-124組大鼠血清ET和Ang Ⅱ水平顯著均顯著降低(P值均<0.05)，NO水平顯著升高(P<0.05)。低氧組與miR-124 NC組間上述NO、ET和Ang Ⅱ水平的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)。見表3。

表3 miR-124對(duì)HPH大鼠血清中NO、ET和Ang Ⅱ水平的影響

2.4 miR-124對(duì)大鼠肺組織HPH相關(guān)mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)的影響 與常氧組相比，低氧組和miR-124 NC組大鼠肺組織的miR-124水平均顯著降低(P值均<0.05)，Jagged2 mRNA和Jagged2、Hes-1蛋白質(zhì)水平均顯著升高(P值均<0.05)。與低氧組和miR-124 NC組相比，miR-124組大鼠的miR-124水平顯著升高(P值均<0.05)，Jagged2 mRNA和Jagged2、Hes-1蛋白質(zhì)水平均顯著降低(P值均<0.05)。低氧組與miR-124 NC組間上述數(shù)值的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)。見表4和圖2。

1 常氧組 2 低氧組 3 miR-124組 4 miR-124NC組圖2 各組大鼠肺組織的Jagged2、Hes-1蛋白質(zhì)表達(dá)情況

表4 miR-124對(duì)HPH大鼠肺組織miR-124及靶基因的影響

2.5 miRNA-124與Jagged2靶向關(guān)系的預(yù)測與驗(yàn)證 預(yù)測結(jié)果顯示，Jagged2 3’-UTR序列上存在miR-124的連續(xù)結(jié)合位點(diǎn)，見圖3。與miR-124 NC+Jagged2 WT組(1.14±0.12)相比，miR-124 mimics+Jagged2 WT組(0.58±0.06)熒光素酶活性顯著降低(t=26.040，P<0.05)，miR-124 mimics+Jagged2 MUT組(1.05±0.07)與miR-24 NC+Jagged2 MUT組(1.09±0.11)熒光素酶活性的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)。

圖3 miR-124與Jagged2 3’ UTR的結(jié)合位點(diǎn)示意

3 討 論

新生兒PH是臨床常見的急危重癥，病死率為40%～50%。在嬰幼兒中，有多種PH表型：繼發(fā)于先天性心臟病伴有左右分流的PH、由于新生兒抵抗力下降而導(dǎo)致的持續(xù)性PH、急性或慢性肺部疾病引起的低氧血癥及特發(fā)性肺動(dòng)脈高壓等[11-12]。肺血管重塑是HPH的顯著特征，可使肺動(dòng)脈壓和肺血管阻力進(jìn)行性增加，最終導(dǎo)致患者發(fā)生右心衰竭或死亡[13]。缺氧刺激PASMC的增殖和遷移，導(dǎo)致肺血管壁增厚和肌化，為肺血管重塑的病理生理學(xué)特征，也是HPH的重要發(fā)生機(jī)制之一[14]。本研究通過將新生大鼠暴露于O2體積分?jǐn)?shù)為0.1的條件下28 d，建立HPH新生大鼠模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，低氧刺激引起大鼠mPAP、MT%和MA%顯著升高，右心室肥大，顯微鏡下可見肺動(dòng)脈壁明顯增厚，管腔變窄，細(xì)胞排列紊亂，呈現(xiàn)肺動(dòng)脈重塑特征；這些均與人體PH的變化和病理學(xué)特征相似，表明大鼠HPH模型構(gòu)建成功。一些細(xì)胞因子被認(rèn)為與HPH發(fā)病密切相關(guān)，內(nèi)源性血管擴(kuò)張劑(如NO)的減少和血管收縮因子(如ET和Ang Ⅱ)的增多在肺血管阻力增加和重塑中起重要作用[15-16]。缺氧刺激可破壞NO與Ang Ⅱ和ET之間的平衡，從而觸發(fā)以平滑肌細(xì)胞增殖為特征的PH和血管重塑。在本研究中，低氧時(shí)血清NO水平顯著降低，而Ang Ⅱ和ET水平顯著升高，這與以往的研究結(jié)論一致[17]。

miRNA已被認(rèn)為是影響多種心血管疾病發(fā)生、發(fā)展的一類轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子。Caruso等[18]研究發(fā)現(xiàn)，PH患者機(jī)體分離出的肺動(dòng)脈存在miR-124明顯下調(diào)的征象，這與內(nèi)皮細(xì)胞代謝和增殖異常有關(guān)。在本研究中，新生大鼠肺組織的miR-124在低氧誘導(dǎo)下表達(dá)水平顯著下調(diào)，該結(jié)果與Li等[19]的研究結(jié)論一致。Zhang等[20]研究發(fā)現(xiàn)，在分離自PH患者的肺外膜纖維細(xì)胞中過表達(dá)miR-124，可抑制細(xì)胞增殖，改善PH疾病表型。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-124組大鼠肺動(dòng)脈壁增厚程度明顯減輕，管腔狹窄不明顯，mPAP、MT%、MA%、右心室肥大指數(shù)、ET和Ang Ⅱ水平均顯著降低，NO水平顯著升高，表明miR-124可能在HPH的發(fā)生過程中起重要的保護(hù)作用。此外，根據(jù)TargetScan軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)，Jagged2為miR-124的靶基因，miR-124與Jagged2 mRNA 3’-UTR存在連續(xù)結(jié)合位點(diǎn)，且被雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)。Jagged2是Notch信號(hào)通路的配體之一，調(diào)控細(xì)胞的生存和分化[21]。Jagged2介導(dǎo)的Notch信號(hào)在神經(jīng)祖細(xì)胞和造血祖細(xì)胞的增殖中起到關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用。應(yīng)用小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)抑制Jagged2可抑制Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，降低Hes-1的表達(dá)量，減輕細(xì)胞增殖[22]。在本研究中，HPH大鼠肺組織的Jagged2、Hes-1蛋白質(zhì)水平顯著升高，表明HPH大鼠Jagged2、Hes-1蛋白質(zhì)表達(dá)上調(diào)可能與肺血管重塑有關(guān)。過表達(dá)miR-124則可抑制缺氧誘導(dǎo)的Jagged2、Hes-1蛋白質(zhì)水平的升高，表明miR-124過表達(dá)可能通過抑制Jagged2的表達(dá)介導(dǎo)對(duì)HPH的改善作用。

綜上所述，miR-124在HPH的發(fā)病機(jī)制中起著關(guān)鍵作用，過表達(dá)miR-124可能通過靶向下調(diào)Jagged2，抑制內(nèi)皮細(xì)胞的異常增殖，緩解HPH誘導(dǎo)的肺血管重塑。該發(fā)現(xiàn)或?yàn)閙iR-124作為治療HPH的新靶點(diǎn)提供一定參考；然而，miR-124對(duì)HPH新生大鼠的作用機(jī)制較為復(fù)雜，相關(guān)結(jié)論仍需進(jìn)一步研究確證。