陳丑彥 楊含騰 潘宏波

結(jié)腸癌的發(fā)生涉及多個(gè)基因與分子通路，尋找有效的靶點(diǎn)評(píng)估臨床治療效果及患者預(yù)后可成為治療結(jié)腸癌新的突破點(diǎn)[1-2]。 B 細(xì)胞急性淋巴瘤9L(B-cell CLL/lymphoma 9-like，BCL9L)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的Wnt/β-catenin信號(hào)通路上的癌基因[3]。目前，關(guān)于BCL9L蛋白對(duì)腫瘤影響的研究較少，且有爭(zhēng)議。López-García等[4-5]認(rèn)為，BCL9L蛋白在正常的細(xì)胞中幫助激活一種凋亡相關(guān)蛋白胱天蛋白酶-2(caspase-2)以應(yīng)對(duì)異常數(shù)量的染色體，引發(fā)細(xì)胞凋亡程序；而當(dāng)BCL9L蛋白異常低表達(dá)時(shí)，染色體異常的結(jié)腸癌細(xì)胞可發(fā)生繼續(xù)生長(zhǎng)與進(jìn)化的情況。而Sannino等[6]認(rèn)為BCL9L蛋白高表達(dá)與胰腺癌的嚴(yán)重程度密切相關(guān)，敲除BCL9L基因后，移植瘤小鼠模型中癌細(xì)胞肝轉(zhuǎn)移的數(shù)量顯著減少。Hallas等[7]對(duì)惡性胰腺腫瘤的研究得到了與之相似的結(jié)果。因此，本研究通過(guò)免疫組織化學(xué)(簡(jiǎn)稱免疫組化)分析、實(shí)時(shí)熒光定量(qRT)-PCR檢測(cè)、蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)等方法，同時(shí)隨訪并對(duì)臨床病理資料進(jìn)行分析，探討B(tài)CL9L蛋白表達(dá)水平與結(jié)腸癌患者預(yù)后的關(guān)系。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2012年1月—2014年1月定西市人民醫(yī)院收治的68例行結(jié)腸癌手術(shù)患者的臨床病理資料，其中男、女各34例；年齡范圍30～76歲。68例患者術(shù)前均未行放射或化學(xué)治療，結(jié)腸癌與癌旁正常組織(于距腫瘤外緣>2 cm處取材)標(biāo)本均為術(shù)后立刻取材，液氮冷凍保存。本研究通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核并批準(zhǔn)(審批號(hào)為2021-001)。所有患者及家屬均簽署知情同意書。

1.2 納入和排除標(biāo)準(zhǔn)[8]納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合結(jié)腸癌臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)；②預(yù)計(jì)生存周期>6個(gè)月。排除標(biāo)準(zhǔn)：①中途脫落或退出研究；②患有精神疾病或溝通障礙。

1.3 隨訪方法和內(nèi)容 采用電話和門診方式進(jìn)行隨訪，記錄患者病例數(shù)、隨訪時(shí)間、性別、年齡、腫瘤復(fù)發(fā)情況、腫瘤轉(zhuǎn)移和生存情況，隨訪時(shí)間截至2019年1月。

1.4 術(shù)后預(yù)后因素分析 分析BCL9L蛋白高表達(dá)組和低表達(dá)組患者年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤數(shù)目、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期、切緣腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性的差異，以及BCL9L蛋白與結(jié)腸癌術(shù)后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的相關(guān)性。

1.5 RNA和總蛋白提取 取新鮮結(jié)腸癌組織，液氮研磨后加TRIzol試劑，按常規(guī)方法提取組織RNA或總蛋白，并測(cè)定RNA和蛋白質(zhì)濃度。

1.6 qRT-PCR檢測(cè)

1.6.1 反轉(zhuǎn)錄 按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，反應(yīng)總體系為10 μL。其中RNA 1 μL，MMLV反轉(zhuǎn)錄酶0.25 μL，5×反轉(zhuǎn)錄緩沖液2 μL，dNTPs 2 μL，Random 6 Mers 0.5 μL，RNA酶抑制劑0.25 μL，DEPC水4 μL。反應(yīng)條件：42 ℃ 10 min， 95 ℃ 2 min。

1.6.2 PCR反應(yīng)體系 cDNA模板1 μL，TaqHS酶0.25 μL， 10×PCR緩沖液2.5 μL， dNTPs 0.5 μL，上游引物、下游引物各0.5 μL，ddH2O 19.75 μL，總體積25 μL。GAPDH作為內(nèi)參。正向引物 5’-TTT GGT ATC GTG GAA GGA CTC-3’；反向引物 5’-GAA CAT CAT CCC TGC CTC TAC-3’；探針 5’-CAT GCC ATC ACT GCC-3’。反應(yīng)條件: 94 ℃ 5 min，98 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共38個(gè)循環(huán)，最后72 ℃ 10 min延伸。BCL9L正向引物5’-CAC AAT GCC ATC AAG ACC ATC-3’ ；反向引物5’-AGT TCA GGT GCA TCT GGC TGT CAG ACG ACG AGC TGC-3’；探針 5’-TCA GAC GAC GAG CT GC-3’。反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min， 98 ℃ 10 s， 55 ℃ 15 s， 72 ℃ 3 min， 共38個(gè)循環(huán)， 最后72 ℃ 10 min延伸。

1.7 蛋白質(zhì)印跡法 取30 μg組織蛋白，用含9%十二烷基硫酸鈉的聚丙烯凝膠電泳(9%SDS-PAGE)進(jìn)行電泳分離，將凝膠中的蛋白質(zhì)用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)印至0.45 μm的聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將膜置于5%脫脂奶粉中封閉1 h，然后加入鼠抗人的BCL9L多克隆抗體(美國(guó)Abcam公司)，置于4 ℃冰箱孵育過(guò)夜。用1×TBST洗膜15 min 3次后，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，于室溫孵育45 min，再用1×TBST將未結(jié)合的抗體洗脫，加入電化學(xué)發(fā)光(ECL)法發(fā)光液顯色后，將膜置于暗盒內(nèi)曝光于X膠片上，膠片常規(guī)顯影、定影。以β-actin為內(nèi)參。

1.8 免疫組化檢測(cè)BCL9L蛋白質(zhì)表達(dá) 將待測(cè)組織置入4 ℃ 4%多聚甲醛中充分固定，再置入4 ℃ 30%蔗糖脫水過(guò)夜，然后將組織包埋成石蠟塊，切片、爬片、脫蠟后采用鏈霉素抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶連結(jié)法(S-P法)進(jìn)行免疫組化實(shí)驗(yàn)，具體步驟依照試劑盒說(shuō)明書。主要抗體來(lái)源、劑量、結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)如下。用PBS取代一抗作為陰性對(duì)照。SP-9002 小鼠S-P試劑盒和DAB顯色試劑盒購(gòu)于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[9]：根據(jù)染色組織的染色強(qiáng)度得到評(píng)分A( 0分為無(wú)色，1分為淡黃色，2分為黃褐色，3分為棕褐色)；根據(jù)染色組織的染色密度得到評(píng)分B(0分為陽(yáng)性比例<25%，1分為26%～50%，2分為51%～75%，3分為76%～100%)；A×B結(jié)果為0～3分為低表達(dá)，4～9分為高表達(dá)。

2 結(jié) 果

2.1 BCL9L在結(jié)腸癌及癌旁組織中的表達(dá) 免疫組化S-P法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，BCL9L蛋白主要在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，呈棕褐色。68例患者中42例結(jié)腸癌組織BCL9L蛋白為低表達(dá)，26例為高表達(dá)；癌組織中BCL9L蛋白表達(dá)評(píng)分顯著低于癌旁組織[(1.89±0.67)分比(5.26±1.23)分，P<0.001]。見(jiàn)圖1。蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)68例患者結(jié)腸癌及其癌旁組織BCL9L蛋白，qRT-PCR檢測(cè)12例患者結(jié)腸癌及其癌旁組織BCL9LmRNA，發(fā)現(xiàn)癌組織中BCL9L蛋白和mRNA相對(duì)表達(dá)量(0.36±0.28和0.62±0.34)均顯著低于癌旁組織(1.02±0.37和2.73±0.23，P值均<0.05)。見(jiàn)圖2。

A BCL9L蛋白在癌旁組織中高表達(dá) B BCL9L蛋白在結(jié)腸癌組織中低表達(dá)圖1 BCL9L蛋白在結(jié)腸癌及癌旁組織中的表達(dá)情況(免疫組化S-P法，×200)

1 癌旁正常組織 2 結(jié)腸癌組織圖2 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)結(jié)腸癌和癌旁組織中BCL9L蛋白的表達(dá)

2.2 BCL9L蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 如表1所示， 不同BCL9L蛋白的表達(dá)水平的結(jié)腸癌患者的性別、年齡、腫瘤數(shù)目及腫瘤直徑的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)；而與BCL9L蛋白高表達(dá)患者相比，低表達(dá)患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期為晚期，及切緣腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性的比例更高(P值均<0.05)。

表1 BCL9L蛋白表達(dá)與結(jié)腸癌臨床病理特征的關(guān)系 (n，N=68)

2.3 隨訪和生存情況 對(duì)68例患者術(shù)后進(jìn)行8～59個(gè)月的隨訪(中位隨訪時(shí)間為38個(gè)月)，其中32例患者無(wú)復(fù)發(fā)，36例患者復(fù)發(fā)；復(fù)發(fā)患者中30例死亡。術(shù)后3年總體復(fù)發(fā)率與總體生存率分別為52.94%(36/68)、55.88%(38/68)。BCL9L蛋白低表達(dá)和高表達(dá)結(jié)腸癌患者術(shù)后3年總體生存率分別為38.10%和84.62%。見(jiàn)表2。

表2 結(jié)腸癌患者術(shù)后預(yù)后單因素分析 (N=68)

2.4 預(yù)后因素分析 單因素Cox回歸分析結(jié)果顯示，性別、腫瘤大小不是影響結(jié)腸癌術(shù)后3年總體生存率的關(guān)鍵因素(P值均>0.05)。年齡、腫瘤數(shù)目、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期、切緣腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性及BCL9L蛋白表達(dá)水平均是影響結(jié)腸癌術(shù)后3年總體生存率的關(guān)鍵因素(P值均<0.05)。見(jiàn)表2。

多因素Cox回歸分析結(jié)果顯示，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期Ⅲ或Ⅳ期、切緣腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性及BCL9L蛋白低表達(dá)均是影響結(jié)腸癌患者術(shù)后3年生存率的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P值均<0.05)。BCL9L蛋白低表達(dá)結(jié)腸癌患者術(shù)后3年死亡風(fēng)險(xiǎn)是BCL9L蛋白高表達(dá)結(jié)腸癌患者的6.26倍。見(jiàn)表3。

表3 結(jié)腸癌患者術(shù)后預(yù)后多因素分析

生存曲線顯示，BCL9L蛋白高表達(dá)的結(jié)腸癌患者總體生存率顯著高于低表達(dá)者(log rankP=0.005 8)，見(jiàn)圖3。

圖3 BCL9L蛋白高表達(dá)和低表達(dá)結(jié)腸癌患者的總體生存率

2.5 BCL9L的蛋白質(zhì)表達(dá)水平與結(jié)腸癌術(shù)后復(fù)發(fā)的相關(guān)性分析 Spearman相關(guān)性分析結(jié)果顯示，BCL9L蛋白低表達(dá)與結(jié)腸癌術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)和死亡(r=0.862、0.640)顯著相關(guān)(P值均<0.001)。

3 討 論

結(jié)腸癌的發(fā)生率占所有癌癥的9%以上[10]，肝轉(zhuǎn)移是結(jié)腸癌患者死亡的主要原因[11]，因此尋求結(jié)腸癌有效靶點(diǎn)是治療結(jié)腸癌新的突破點(diǎn)。目前，已發(fā)現(xiàn)的通過(guò)遺傳變異導(dǎo)致癌癥發(fā)生、發(fā)展的影響因子有：TGF-β通路失調(diào)[3]、長(zhǎng)散布重復(fù)序列(LINEs)甲基化[9]、微RNA-454-3p異常表達(dá)[12]、Wnt信號(hào)通路分子突變和解除管制[13]等。越來(lái)越多的研究證明，Wnt/β連環(huán)蛋白(β-catenin)信號(hào)通路分子突變與多種癌癥的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)密切。如微RNA-30-5p通過(guò)靶向抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路調(diào)控結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展[14]， 結(jié)腸癌細(xì)胞Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活與TGF7的突變有關(guān)[15]，新西蘭牡荊苷(Vicenin-2)通過(guò)抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞的凋亡[16]等。此外，BCL9L蛋白的異常表達(dá)參與結(jié)直腸癌和胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展[5，7]，本研究對(duì)68例結(jié)腸癌患者的結(jié)腸癌與癌旁組織進(jìn)行免疫組化分析，發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌組織中的BCL9L蛋白質(zhì)的表達(dá)量顯著低于癌旁組織，這與López-García等[4-5]的研究結(jié)果相一致，卻與Sannino等[6]和Hallas等[7]的研究結(jié)果相反。這種差異可能與腫瘤的生長(zhǎng)部位不同有關(guān)，也可能與腫瘤細(xì)胞的突變背景、腫瘤的不同發(fā)展階段及患者的基因背景有關(guān)。與之相同的研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β負(fù)反饋調(diào)控腎癌細(xì)胞的黏附與遷移[17]，卻正反饋調(diào)節(jié)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的侵襲和遷移[18]，這種正或負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用導(dǎo)致了BCL9L基因在不同腫瘤組織中的異常表達(dá)。

結(jié)腸癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移是患者死亡的主要原因[9]，因此探索相關(guān)靶基因從而降低術(shù)后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和提高患者術(shù)后3年的總體生存率是亟待解決的問(wèn)題。本研究對(duì)68例結(jié)腸癌患者進(jìn)行跟蹤隨訪，并對(duì)臨床病理資料進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)3年總體復(fù)發(fā)率與生存率分別為52.94%、55.88%，且BCL9L蛋白低表達(dá)的患者復(fù)發(fā)率較高，提示BCL9L蛋白異常低表達(dá)常常預(yù)示腫瘤預(yù)后不良。本研究中單因素Cox回歸分析結(jié)果顯示，年齡、腫瘤數(shù)目、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期、切緣腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性及BCL9L蛋白表達(dá)水平均是影響結(jié)腸癌術(shù)后3年總體生存率的關(guān)鍵因素；多因素Cox回歸分析結(jié)果顯示，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期較晚、切緣腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性及BCL9L蛋白低表達(dá)水平均是影響結(jié)腸癌患者術(shù)后3年總體生存率的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。BCL9L蛋白低表達(dá)結(jié)腸癌患者術(shù)后3年的總體生存率顯著低于高表達(dá)者；Spearman相關(guān)性分析結(jié)果顯示，BCL9L蛋白的表達(dá)水平與結(jié)腸癌術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移和死亡率明顯相關(guān)。在正常的細(xì)胞中，BCL9L蛋白幫助激活caspase-2蛋白以應(yīng)對(duì)異常數(shù)量的染色體，引發(fā)自毀程序；但是在結(jié)腸癌細(xì)胞中BCL9L基因缺陷，caspase-2蛋白沉默導(dǎo)致結(jié)腸癌細(xì)胞中出現(xiàn)染色體數(shù)量異常，且不斷發(fā)展。以上提示BCL9L基因在結(jié)腸癌細(xì)胞中缺失， caspase-2蛋白沉默導(dǎo)致結(jié)腸癌細(xì)胞無(wú)限制的生長(zhǎng)，從而使患者術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率升高，可作為結(jié)腸癌患者臨床診療靶點(diǎn)及其術(shù)后預(yù)后指標(biāo)。

綜上所述，BCL9L蛋白在結(jié)腸癌中異常低表達(dá)，不僅影響結(jié)腸癌患者復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移與死亡，而且影響結(jié)腸癌患者的預(yù)后。盡管關(guān)于這種特殊的基因異常表達(dá)的臨床數(shù)據(jù)很少，但隨著治療靶點(diǎn)的研究發(fā)現(xiàn)與治療方法的改進(jìn)，進(jìn)一步優(yōu)化臨床分期有助于高危結(jié)腸癌患者準(zhǔn)確選擇輔助治療方式。