鐘 巍 周俊輝 高 潔 房 芳 劉曉樂 張娜娜 孟憲慧

胸腔鏡肺癌根治術(shù)中常用的單肺通氣(OLV)是一種非生理性呼吸模式，可導(dǎo)致低氧血癥、肺損傷甚至急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)，增加術(shù)后肺部并發(fā)癥(PPC)的發(fā)生，影響患者臨床預(yù)后。非通氣側(cè)肺萎陷和復(fù)張引起的缺血-再灌注損傷，以及OLV期間機(jī)械通氣引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)，可造成明顯的肺損傷[1]。肺泡巨噬細(xì)胞(AM)是ARDS及肺損傷的重要效應(yīng)細(xì)胞，在肺部炎癥反應(yīng)及組織修復(fù)中具有重要作用[2]。有研究[3]結(jié)果表明，OLV后對(duì)非通氣側(cè)肺進(jìn)行持續(xù)給氧可改善食管切除術(shù)OLV結(jié)束后肺的氧合功能，減輕全身和非通氣側(cè)肺的炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)。然而，OLV時(shí)非通氣側(cè)肺持續(xù)中-低流量給氧減輕胸腔鏡下肺癌根治術(shù)患者非通氣側(cè)肺損傷的機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究。本研究擬探討非通氣側(cè)肺持續(xù)中-低流量給氧是否可通過調(diào)節(jié)AM分化及其功能減輕胸腔鏡下肺癌根治術(shù)老年患者非通氣側(cè)肺損傷。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選擇2018年12月20日—2019年9月5日在河南省胸科醫(yī)院擇期行胸腔鏡下肺癌根治術(shù)的老年患者60例，其中男33例，女27例，年齡65～80歲，體重45～85 kg，身高145～185 cm。符合ASA分級(jí)Ⅱ或Ⅲ級(jí)。排除標(biāo)準(zhǔn)：嚴(yán)重的肺部疾??；左心室射血分?jǐn)?shù)<40%；腎功能不全；癡呆、帕金森病、腦卒中、吸毒或長(zhǎng)期服用精神類藥物；嚴(yán)重的心臟傳導(dǎo)阻滯、高血壓、冠心病和糖尿??；術(shù)前語言交流及認(rèn)知功能障礙；長(zhǎng)期服用類固醇藥物、激素類藥物；近期有重大手術(shù)史。剔除標(biāo)準(zhǔn)：圍手術(shù)期發(fā)生不良事件，如出血量>600 mL；圍手術(shù)期感染；麻醉時(shí)間>5 h；再次手術(shù)。采用隨機(jī)數(shù)字表法將納入患者分成研究組和對(duì)照組，每組30例。本研究方案經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核、批準(zhǔn)(審批號(hào)：2018-03-012)，術(shù)前已征得患者及其委托人的同意與授權(quán)，并簽署知情同意書。

1.2 麻醉方法 所有患者術(shù)前常規(guī)禁飲、禁食，入手術(shù)室后常規(guī)監(jiān)測(cè)心電圖、血壓及經(jīng)皮動(dòng)脈血氧飽和度(SpO2)。開放上肢外周靜脈通道，輸注乳酸鈉林格液6～8 mL/kg。局部麻醉(簡(jiǎn)稱局麻)下行橈動(dòng)脈穿刺置管并監(jiān)測(cè)動(dòng)脈壓。全身麻醉(簡(jiǎn)稱全麻)誘導(dǎo)采用丙泊酚1.5～2.0 mg/kg、舒芬太尼0.5 μg/kg和羅庫(kù)溴銨0.6 mg/kg靜脈注射，選擇大小合適的可視化雙腔支氣管導(dǎo)管進(jìn)行氣管內(nèi)插管。插管后分別于仰臥位及側(cè)臥位，通過可視化鏡頭檢查氣管導(dǎo)管的位置正確與否。麻醉誘導(dǎo)完成后行右側(cè)頸內(nèi)靜脈穿刺置管。麻醉維持采用全憑靜脈麻醉，靜脈泵注丙泊酚4～8 mg/(kg·h)、瑞芬太尼0.05～0.2 μg/(kg·h)、右美托咪定0.2～0.7 μg/(kg·h)及羅庫(kù)溴銨0.3～0.6 mg/(kg·h)進(jìn)行麻醉維持。術(shù)中通過調(diào)控麻醉深度使腦電雙頻指數(shù)(BIS)維持于40～60。雙肺通氣時(shí)，以潮氣量6～8 mL/kg進(jìn)行通氣，OLV時(shí)，以潮氣量4～5 mL/kg進(jìn)行保護(hù)性O(shè)LV。術(shù)中呼氣末正壓由麻醉醫(yī)師判斷選擇。OLV時(shí)以空-氧混合通氣調(diào)節(jié)FiO2，以維持SpO2≥92%。人工記錄術(shù)中呼吸頻率、呼氣末正壓和FiO2。按照常規(guī)，若患者術(shù)中發(fā)生低氧血癥(SpO2<90%)，則進(jìn)行肺復(fù)張。術(shù)中平衡晶體液滴速為3 mL/(kg·h)。術(shù)畢前15 min靜脈注射羥考酮0.1 mg/kg，縫皮前給予0.25%羅哌卡因切口皮下注射。手術(shù)結(jié)束時(shí)，應(yīng)用4個(gè)成串刺激(TOF)評(píng)估神經(jīng)肌肉組織中是否殘留肌肉松弛藥，若TOF監(jiān)測(cè)值≥0.9，予可拔除氣管導(dǎo)管；若TOF監(jiān)測(cè)值<0.9，則使用舒更葡糖4 mg/kg進(jìn)行拮抗，待TOF恢復(fù)至0.9時(shí)在手術(shù)室內(nèi)拔除氣管導(dǎo)管?；颊咝g(shù)后均送入麻醉后恢復(fù)室(PACU)，連接電子止痛泵行頸靜脈患者自控鎮(zhèn)痛(PCIA)。

1.3 干預(yù)措施 OLV后研究組從非通氣側(cè)肺置入14 F導(dǎo)管于氣管隆嵴分叉后2～3 cm，并給予1～4 L/min的持續(xù)性中-低流量給氧；對(duì)照組非通氣側(cè)肺不給予持續(xù)性中-低流量給氧，只在氣管隆嵴分叉后2～3 cm置入14 F導(dǎo)管。

1.4 檢測(cè)項(xiàng)目

1.4.1 血?dú)夥治?于麻醉誘導(dǎo)后即刻(T0)和OLV后30 min (T1)、1 h (T2)及2 h (T3)時(shí)采集橈動(dòng)脈血，應(yīng)用GEM Premier 3000血?dú)夥治鰞x(美國(guó)力康公司)進(jìn)行血?dú)夥治觥?/p>

1.4.2 支氣管肺泡灌洗液(BALF)采集 T3時(shí)在可視化雙腔支氣管導(dǎo)管的大、小套囊均鼓起的情況下對(duì)非通氣側(cè)肺進(jìn)行BALF采集，由熟練操作纖維支氣管鏡的醫(yī)師完成。選用BF-1T260型電子支氣管鏡(日本Olympus公司)，將其末端與兩組患側(cè)肺中葉或舌葉的葉支氣管開口處緊密契合，緩慢注入37 ℃的醫(yī)用0.9%氯化鈉(NaCl)溶液，灌注后用50～100 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)負(fù)壓吸引緩慢回收，回收率≥40%為回收成功，每次灌洗量為40 mL，共3次，總量為200 mL，BALF經(jīng)雙層無菌紗布過濾，4 ℃冷卻10 min，再以3 000 r/min的轉(zhuǎn)速(離心半徑15 cm)離心15 min，留取上清液，置于-20 ℃以備后續(xù)檢測(cè)用。

1.4.3 肺組織學(xué)評(píng)價(jià) T3時(shí)切取已切除的肺癌外周的正常肺組織，置于4%中性甲醛溶液中固定、石蠟包埋、組織切片、H-E染色，并由對(duì)研究方案和分組不知情的病理科醫(yī)師進(jìn)行肺損傷評(píng)分[4]。

1.4.4 AM分選 利用Alex Fluor標(biāo)記的CD11b抗體、PE-Cy7標(biāo)記的Siglec F抗體和APC標(biāo)記的CD11c抗體(美國(guó)Santa Cruz生物科技公司)標(biāo)記人AM (CD11b-CD11c+Siglec F+)。從離心后的BALF上清液中收集細(xì)胞并制成細(xì)胞懸液，加入抗體，避光冰浴30 min，向離心管中加入1 mL流式緩沖液終止染色，迅速離心去除上清液，將細(xì)胞用200 μL流式緩沖液重懸，細(xì)胞濾網(wǎng)過濾后，使用MoFlo Astrios EQ流式細(xì)胞儀(美國(guó)Beckman Coulter公司)進(jìn)行流式細(xì)胞分選。

1.4.5 AM凋亡檢測(cè) 按試劑盒說明書進(jìn)行操作，將分選出的AM與異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白V和碘化丙啶(PI)孵育，流式細(xì)胞術(shù)分析AM中的凋亡細(xì)胞比例。

1.4.6 AM表型檢測(cè) 為判斷AM的分化狀態(tài)，使用美國(guó)Sigma公司的雙抗體夾心法ELISA試劑盒，檢測(cè)研究組和對(duì)照組離心后的BALF上清液中M1型AM標(biāo)志物[誘導(dǎo)性一氧化氮合酶(iNOS)、TNF-α、IL-6]和M2型AM標(biāo)志物[精氨酸酶1(Arg1)、IL-10]的水平。

1.4.7 活性氧(ROS)的測(cè)定 按試劑盒(美國(guó)Enzo Biochem公司)說明書進(jìn)行操作，將分選出的AM細(xì)胞懸液與 DCFH-DA 熒光探針(10 μmol/L)混勻、孵育，用無血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，以前向散射(FS)和側(cè)向散射(SS)，指示細(xì)胞光透射程度為參數(shù)，選取活細(xì)胞(大 FS 值，較小 SS 值)圈門，對(duì)門內(nèi)的細(xì)胞進(jìn)行ROS分析。以探針熒光讀數(shù)的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，細(xì)胞數(shù)為縱坐標(biāo)即為測(cè)定細(xì)胞內(nèi)ROS水平的相對(duì)值。

1.4.8 Ca2+濃度的檢測(cè) 按試劑盒(美國(guó)Enzo Biochem公司)說明書進(jìn)行操作，將分選出的AM細(xì)胞懸液與Fluo4-AM工作液(濃度為2 μmol/L)混勻、孵育。通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度相對(duì)值。

2 結(jié) 果

2.1 兩組患者一般和臨床資料的比較 兩組患者年齡、BMI、性別構(gòu)成、ASA分級(jí)構(gòu)成、術(shù)前FEV1/用力肺活量(FVC)、雙肺通氣時(shí)間、paO2、paCO2、OLV時(shí)間、手術(shù)時(shí)間、麻醉時(shí)間、術(shù)中失血量和輸入液體量的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)。見表1。

A 對(duì)照組 B 研究組圖1 兩組患者肺組織病理學(xué)結(jié)果(H-E染色，×200)

表1 兩組患者一般和臨床資料的比較 (N=30)

2.2 兩組患者不同時(shí)間點(diǎn)血?dú)夥治鼋Y(jié)果比較 與同組T0時(shí)比較，T1～T3時(shí)兩組paO2均顯著下降(P值均<0.05)，paCO2均顯著升高(P值均<0.05)。T1～T3時(shí)研究組paO2均顯著高于對(duì)照組(P值均<0.05)，paCO2均顯著低于對(duì)照組(P值均<0.05)。見表2。

2.3 兩組患者肺組織病理學(xué)結(jié)果 對(duì)照組T3時(shí)，術(shù)側(cè)正常肺組織肺泡壁增厚、水腫，可見大量中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞，肺泡腔內(nèi)可見較多炎性滲出液；肺間質(zhì)明顯增厚，可見大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。研究組肺泡間隔增寬，毛細(xì)血管未見明顯充血，小部分肺泡腔可見紅細(xì)胞及炎性滲出液；肺間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯少于對(duì)照組。見圖1。

2.4 兩組患者肺損傷評(píng)分及AM凋亡率的比較 T3時(shí)，研究組肺損傷評(píng)分顯著低于對(duì)照組(P<0.05)；研究組AM活細(xì)胞率顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，AM早期凋亡率和晚期凋亡率均顯著低于對(duì)照組(P值均<0.05)。見表3。

2.5 兩組BALF中M1型和M2型AM標(biāo)志物的比較 研究組BALF中iNOS、IL-6和TNF-α水平均顯著低于對(duì)照組，而Arg-1和IL-10水平均顯著高于對(duì)照組(P值均<0.05)。見表4。

表3 兩組患者T3時(shí)肺損傷評(píng)分及AM凋亡率的比較

表4 兩組BALF中M1型和M2型AM標(biāo)志物的比較

2.6 兩組BALF中AM內(nèi)Ca2+濃度和ROS水平的比較 研究組BALF中AM內(nèi)的Ca2+濃度相對(duì)值顯著高于對(duì)照組(10.81±2.83比7.64±2.31)，而ROS水平顯著低于對(duì)照組(407±12比812±19，P值均<0.05)。

3 討 論

OLV期間因機(jī)械通氣不足引起的肺不張、氧合功能下降、炎癥反應(yīng)和肺損傷等，均可導(dǎo)致患者肺的病理生理學(xué)變化[5]。OLV時(shí)非通氣側(cè)肺雖不參與氧合作用，但仍然有血液供應(yīng)，肺內(nèi)分流率(Qs/Qt)值增加[6]。低氧血癥是影響患者生理功能的最重要因素，是造成術(shù)中和術(shù)后嚴(yán)重并發(fā)癥的主要原因[7]。當(dāng)FiO2和血流動(dòng)力學(xué)等指標(biāo)相同時(shí)，OLV時(shí)肺泡-動(dòng)脈氧分壓差(A-aDO2)較雙肺通氣時(shí)更大，且paO2較雙肺通氣時(shí)更低。本研究結(jié)果表明，兩組患者在OLV后出現(xiàn)不同程度的氧合功能下降，而OLV期間予非通氣側(cè)肺持續(xù)性中-低流量給氧則可改善OLV后肺的氧合，有效減少OLV后低氧血癥的發(fā)生，對(duì)肺組織起到有效的保護(hù)作用。

據(jù)報(bào)道，通過纖維支氣管鏡以5 L/min的氧流量對(duì)非通氣側(cè)的肺部進(jìn)行選擇性供氧，可顯著改善氧合，但不影響手術(shù)操作[8]。研究[9]結(jié)果表明，以5 L/min的氧流量進(jìn)行的非通氣側(cè)肺持續(xù)給氧可以改善OLV期間的動(dòng)脈氧合功能，并降低Qs/Qt，同時(shí)可將肺塌陷保持在最令手術(shù)醫(yī)師滿意的程度。本研究結(jié)果顯示，研究組肺損傷評(píng)分顯著低于對(duì)照組，提示術(shù)中非通氣側(cè)肺持續(xù)中-低流量給氧可減輕非通氣側(cè)肺損傷，這可能與其改善患者氧合功能有關(guān)。研究[10]結(jié)果表明，OLV誘發(fā)肺損傷的機(jī)制非常復(fù)雜，包括機(jī)械通氣、低氧血癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)。本研究結(jié)果顯示，OLV期間予非通氣側(cè)肺持續(xù)性中-低流量給氧，可減少低氧血癥的發(fā)生，故其對(duì)OLV誘發(fā)的肺損傷亦有一定的減輕作用。

AM一般分為兩種形態(tài)，即M1型巨噬細(xì)胞(CAM)和M2型巨噬細(xì)胞(AAM)。這兩種形態(tài)是AM分化后兩種極端對(duì)立的狀態(tài)，在具體的肺部微環(huán)境中，AM各種表型之間并無明顯界限，且根據(jù)局部微環(huán)境的變化不斷進(jìn)行著表型間的轉(zhuǎn)換，維系一種微妙的平衡[11]。在機(jī)械通氣的外源性刺激下，肺泡受損后分泌的炎癥介質(zhì)刺激AM，打破了這種平衡。本研究結(jié)果表明，與對(duì)照組比較，研究組AM釋放大量的M1型和M2型標(biāo)志物，細(xì)胞凋亡率顯著增高，提示肺損傷時(shí)AM發(fā)生了異常的活化和分化。與對(duì)照組相比，研究組AM M1型標(biāo)志物減少，M2型標(biāo)志物增加，提示非通氣側(cè)肺持續(xù)中-低流量給氧對(duì)AM分化產(chǎn)生一定的影響，有效減少了CAM產(chǎn)生，增加AAM的產(chǎn)生。

急性肺損傷的過程中，AM通過分泌大量的氧化物參與免疫應(yīng)激反應(yīng)。在外界環(huán)境的刺激下，AM內(nèi)的iNOS與Arg-1競(jìng)爭(zhēng)性的結(jié)合底物精氨酸，分解成不同的產(chǎn)物。精氨酸與iNOS結(jié)合后，分解成瓜氨酸與NO。NO與超氧化物歧化酶(SOD)競(jìng)爭(zhēng)性的結(jié)合細(xì)胞代謝過程中的ROS形成氧化劑與亞硝酸鹽，使得肺泡上皮細(xì)胞通透性增加，從而導(dǎo)致急性肺損傷。而Arg-1與精氨酸結(jié)合后可分解為多胺和脯氨酸，促進(jìn)了細(xì)胞分裂與膠原的形成，在炎癥末期起到組織修復(fù)的作用[12]。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，研究組iNOS、ROS水平均顯著降低，而Arg-1水平顯著增高，提示非通氣側(cè)肺持續(xù)中-低流量給氧能夠通過改變AM內(nèi)氧化物的水平，減輕急性肺損傷。

一磷酸腺苷依賴的蛋白激酶(AMPK)是重要的細(xì)胞代謝感受器，在炎癥反應(yīng)中起抑制作用，同時(shí)促進(jìn)抗炎性的巨噬細(xì)胞極化[13]。AMPK促進(jìn)巨噬細(xì)胞的M2型極化的途徑較多，包括抑制 NF-κB和激活過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)-δ、蛋白激酶B(Akt)等。而AMPK的激活需要鈣離子/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶激酶β(CaMKKβ)的調(diào)節(jié)，在肺組織損傷時(shí)，外源性Ca2+進(jìn)入AM內(nèi)，造成Ca2+超載。Ca2+與CaMKKβ結(jié)合誘導(dǎo)的相關(guān)級(jí)聯(lián)反應(yīng)使AMPK活化，進(jìn)而使Janus激酶(JAK)2激活并催化酪氨酸殘基發(fā)生磷酸化修飾，這些磷酸化的酪氨酸位點(diǎn)與STAT3結(jié)合并催化STAT3磷酸化，誘導(dǎo)AM向AAM轉(zhuǎn)變；活化的AMPK抑制NF-κB激活，減弱AM向CAM轉(zhuǎn)變[14]。本研究結(jié)果表明，研究組AM內(nèi)的Ca2+濃度顯著高于對(duì)照組，提示非通氣側(cè)肺持續(xù)中-低流量給氧可促進(jìn)AM內(nèi)Ca2+濃度升高，從而可能誘導(dǎo)AM向AAM轉(zhuǎn)變，抑制AM向CAM轉(zhuǎn)變。

綜上，老年患者胸腔鏡下肺癌根治術(shù)中非通氣側(cè)肺持續(xù)中-低流量給氧可調(diào)節(jié)異常AM的表型與功能，抑制AM凋亡，減輕非通氣側(cè)肺損傷。