羅勇 吳雙華 康永清 唐新橋 王澤強(qiáng) 王婷

〔摘要〕 目的 用黃芩苷干預(yù)人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7，觀察黃芩苷對乳腺癌細(xì)胞侵襲、遷移與凋亡的影響及其作用機(jī)制。方法實驗分為正常組、模型組、黃芩苷組、miR-126組、LNA 組、LNA-126 組和LNA-126+黃芩苷組。采用RT-PCR檢測miR-126、miR-145、miR-100和let-7c的表達(dá)水平，MTT法檢測細(xì)胞增殖情況，Transwell實驗檢測細(xì)胞侵襲與遷移情況，Western blot法檢測p53、Caspase-3、Caspase-9、Bcl-2、Bax和p-p38蛋白的表達(dá)水平，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果 RT-PCR結(jié)果顯示，與模型組相比，黃芩苷作用于MCF-7細(xì)胞后miR-126、miR-145、miR-100和let-7c表達(dá)明顯上調(diào)（P<0.05，P<0.01，P<0.001），其中以miR-126最為顯著（P<0.001）;與正常組相比，4種miRNA在模型組中的表達(dá)均下調(diào)，其中以miR-126下調(diào)最為明顯（P<0.05）;MTT結(jié)果顯示，MCF-7細(xì)胞的增殖受到miR-126和黃芩苷的抑制（P<0.05），而MCF-7細(xì)胞的增殖受到LNA-126的促進(jìn)（P<0.05）;Transwell實驗結(jié)果顯示，MCF-7細(xì)胞的侵襲和遷移受到miR-126和黃芩苷的抑制（P<0.05），而黃芩苷對MCF-7細(xì)胞侵襲和遷移的抑制受到LNA-126的拮抗（P>0.05）;Western blot結(jié)果顯示，黃芩苷及miR-126作用于MCF-7細(xì)胞后Bcl-2表達(dá)水平下降（P<0.05），p53、Caspase-3、Caspase-9、Bax及p-p38表達(dá)水平上升（P<0.05）;流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，黃芩苷及miR-126促進(jìn)MCF-7細(xì)胞凋亡（P<0.05）。結(jié)論 黃芩苷可以抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲與遷移，并促進(jìn)其凋亡，其機(jī)制可能與通過上調(diào)miR-126有關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕 乳腺癌;黃芩苷;miR-126;侵襲與遷移;細(xì)胞凋亡

〔中圖分類號〕R285.5 ? ? ? 〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A ? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2022.01.006

〔Abstract〕 Objective Human breast cancer cell line MCF-7 was treated with baicalin to observe the effect and mechanism of baicalin on invasion， migration and apoptosis of breast cancer cells. Methods The experiment was divided into control group，model group， baicalin group， miR-126 group， LNA group， LNA-126 group and LNA-126+baicalin group. The expression levels of miR-126， miR-145， miR-100， let-7c were detected by RT-PCR， and the cell proliferation was determined by using MTT method. The invasion and migration of cells were detected by Transwell test， and the expression levels of p53， Caspase-3， Caspase-9， Bcl-2， Bax and p-p38 were determined by Western blot. Cell apoptosis was detected by flow cytometry. Results The results of RT-PCR showed that compared with model group， the expression levels of miR-126， miR-145， miR-100， and let-7c were significantly up-regulated after baicalin was treated on MCF-7 cells （P<0.05，P<0.01，P<0.001）， especially miR-126 （P<0.001）; compared with control group， the expression levels of four miRNAs in model group were down regulated， especially miR-126 （P<0.05）; MTT results showed that miR-126 and baicalin can inhibit the growth of MCF-7 cells （P<0.05）， while LNA-126 may promote the growth MCF-7 cells （P<0.05）. Transwell test results showed that miR-126 and baicalin can inhibit the invasion and migration of MCF-7 cells （P<0.05）， while LNA-126 can antagonize the inhibitory effect of baicalin （P>0.05）. Western blot results showed that the expression level of Bcl-2 decreased after baicalin and miR-126 acted on MCF-7 cells （P<0.05）， and the expression levels of p53， Caspase-3， Caspase-9， Bax， and p-p38 increased （P<0.05）. The results of flow cytometry showed that baicalin and miR-126 promoted the apoptosis of MCF-7 cells （P<0.05）. Conclusion Baicalin can inhibit the proliferation， invasion and migration of breast cancer cells， and promote their apoptosis. The mechanism may be related to the up-regulation of miR-126.

〔Keywords〕 breast cancer; baicalin; miR-126; invasion and migration; apoptosis

乳腺癌是最常見的婦女惡性腫瘤疾病之一，近年來其發(fā)病率逐年增加，尤其年輕患者的發(fā)病率顯著增加，影響著女性的身心健康[1]。乳腺癌患者最終的結(jié)局是出現(xiàn)全身多器官廣泛的轉(zhuǎn)移，其最常見的轉(zhuǎn)移部位是骨、肺、肝和腦，轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致乳腺癌患者死亡的主要原因之一，也是臨床上目前治療亟待攻破的難點[2]。因此，當(dāng)前乳腺癌研究的熱點為抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖[3]、侵襲與遷移[4]。目前，對乳腺癌的早期治療多為根治術(shù)，同時結(jié)合放化療、內(nèi)分泌治療、生物治療及中藥等綜合治療手段。盡管如此，乳腺癌的復(fù)發(fā)率依舊很高，有30%～40%的患者乳腺癌細(xì)胞發(fā)生局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，極大地降低了患者的生活質(zhì)量，增加了死亡率[5]。

研究表明，miRNA在腫瘤的侵襲和遷移中發(fā)揮著重要作用，為診斷和治療提供了新的思路。黃芩苷是我國傳統(tǒng)中藥黃芩的主要有效成分之一，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，黃芩苷具有抗病毒、抗血小板凝集、抗氧化、抗炎癥反應(yīng)、抗過敏反應(yīng)、影響鈣離子通道開放和調(diào)節(jié)免疫等藥理作用[6]。近年來，黃芩苷的研究逐漸成為熱點，研究表明，黃芩苷具有不良反應(yīng)少、來源廣泛、抗菌譜廣等特性，對大腸癌、肝癌及前列腺癌等多種癌癥具有顯著的療效[7-9]。

本課題組前期采用miRNA芯片篩選發(fā)現(xiàn)黃芩苷能上調(diào)乳腺癌細(xì)胞的4種miRNA：miR-126、

miR-145、miR-100和let-7c。本研究擬在前期基礎(chǔ)上，通過轉(zhuǎn)染miR-126 mimics和miR-126抑制劑，在離體水平觀察黃芩苷對miR-126的調(diào)節(jié)作用，并探討其促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞侵襲、遷移和凋亡的機(jī)制，為乳腺癌的臨床提供理論基礎(chǔ)和依據(jù)，同時為中藥黃芩新型制劑的開發(fā)提供新的視野和思路。

1 材料與方法

1.1 ?細(xì)胞株

人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7（中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院中心實驗室細(xì)胞庫，批號：180234）;正常乳腺細(xì)胞株Hs 578Bst（上海拜力生物科技有限公司，批號：180192）。1.2 ?主要試劑

黃芩苷（純度98.5%）（中國藥品生物制品檢定所，批號：120608-201113）;RT-PCR定量檢測試劑盒（大連寶生物工程有限公司，批號：RR820A）;p53（批號：ABP51955）、 Caspase-3（批號：ABP52935）、Caspase-9（批號：ABP52437）、Bcl-2（批號：PAB19877）、Bax（批號：22160002）、p-p38（批號：20140016）、GADPH（批號：XFC1655）均購自上海研晶生化試劑有限公司;鎖核酸（locked nucleic acid， LNA）[生工生物工程（上海）股份有限公司，貨號：A104053]。

1.3 ?主要儀器

二氧化碳培養(yǎng)箱（美國NAPCO公司，型號：JC-150-GSI-T）;凝膠成像分析系統(tǒng)（杭州朗基科學(xué)儀器有限公司，型號：ZF-388）;轉(zhuǎn)膜儀（美國GE公司，型號：L00686C）;流式細(xì)胞儀（美國BD公司，型號：FACSMelody）;蛋白印跡成像和定量分析系統(tǒng)（英國SYGENE公司，型號：FluorChem Q）。

1.4 ?細(xì)胞培養(yǎng)

MCF-7細(xì)胞及Hs 578Bst細(xì)胞采用含10%小牛血清DMEM培養(yǎng)基置于37 ℃含5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.5 ?藥物制備

采用二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide， DMSO）充分溶解黃芩苷干粉，稀釋至濃度為50 μmol/L，避光，4 ℃保存?zhèn)溆?。使用時采用細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋成所需的濃度。

1.6 ?實驗分組

正常組（Hs 578Bst細(xì)胞）、模型組（MCF-7細(xì)胞）、黃芩苷組（50 μmol/L）、miR-126組（miR-126 mimics轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞）、LNA組（LNA修飾MCF-7細(xì)胞）、LNA-126組（LNA修飾miR-126抑制劑，用于轉(zhuǎn)染后干擾MCF-7細(xì)胞內(nèi)miR-126的表達(dá)）、LNA-126+黃芩苷組（LNA-126+黃芩苷共同接種培養(yǎng)）。其中RT-PCR法分別考察模型組與黃芩苷組、正常組與模型組;MTT法考察模型組、黃芩苷組、miR-126組、LNA組與LNA-126組;Transwell法考察模型組、黃芩苷組、miR-126組與LNA-126+黃芩苷組;Western blot法與Annexin V-FITC/PI雙染色法考察模型組、黃芩苷組與miR-126組。

1.7 ?miR-126轉(zhuǎn)染細(xì)胞

取1 μg（質(zhì)?！胢iR-126 mimics和LNA-126按1∶1混合）混合物，用50 μL不含血清和抗生素的DMEM培養(yǎng)基稀釋質(zhì)粒，混勻，常溫孵育15 min;用50 μL不含血清和抗生素的DMEM培養(yǎng)基稀釋3 μL Lipofectamine 2000TM試劑，混勻;將稀釋的

Lipofectamine 2000TM試劑加入到RNA/DMEM混合液中，上下顛倒混勻，室溫孵育15 min;用1 mL不含血清和抗生素的DMEM洗細(xì)胞一次，然后加入0.9 mL含2%血清不含抗生素的DMEM培養(yǎng)基;將RNA/Lipofectamine 2000TM試劑混合物加入上述處理過的DMEM培養(yǎng)皿中，混勻，CO2培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)過夜;用含2%血清和抗生素的DMEM培養(yǎng)基替換含有轉(zhuǎn)染混合物的培養(yǎng)基，然后CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。

1.8 ?指標(biāo)檢測

1.8.1 ?RT-PCR法 ?轉(zhuǎn)染60 h后，采用Trizol法提取各組細(xì)胞的總RNA;上機(jī)95 ℃，3 min;95 ℃，

12 s;62 ℃，35 s，共35個循環(huán)。引物序列見表1。

1.8.2 ?MTT法 ?MCF-7細(xì)胞以1×104個密度接種于96孔培養(yǎng)板過夜培養(yǎng)，50 μmol/L黃芩苷作用于細(xì)胞72 h，加入20 μL MTT液，37 ℃培養(yǎng)箱中孵育4 h，離心，棄去培養(yǎng)液，每孔加入150 μL DMSO，低速振蕩10 min，酶標(biāo)儀檢測490 nm處吸光度。

1.8.3 ?Transwell法 ?50 g基質(zhì)膠包裹Transwell小室底部膜的內(nèi)表面，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中成膠，調(diào)整細(xì)胞密度至5×108個/L，取200 μL細(xì)胞懸液加入到24孔Transwell小室的上室，下室加入600 μL含0.2% BSA和10% FCS的DMEM培養(yǎng)基，將200 μL細(xì)胞懸液加入Transwell小室上層，下室則加入只含0.2% BSA的培養(yǎng)基，每組3孔，PBS液清洗2次，甲醇固定15 min，PBS清洗2次，0.1%結(jié)晶紫染色10 min，PBS液再清洗2次，顯微鏡下拍照觀察。

1.8.4 ?Western blot法 ?RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度;SDS-PAGE電泳，用濕轉(zhuǎn)法將目的蛋白遷移到PVDF膜上，100 V 90 min后置于4 ℃冰箱，封閉，一抗孵育，于4 ℃冷藏室搖床過夜（p53 1∶200稀釋，其余均1∶1000稀釋）;二抗37 ℃孵育2 h;凝膠圖像分析。

1.8.5 ?Annexin V-FITC/PI雙染色法 ?MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)在6孔板，收集懸浮細(xì)胞，收集細(xì)胞并用PBS洗。配制1×Annexin V結(jié)合緩沖液。配制100 μg/mL的PI工作液，取5 μL 1 mg/mL PI儲存液加至45 μL 1×Annexin V結(jié)合緩沖液中。再次用PBS洗細(xì)胞，棄上清，將細(xì)胞重懸于1×Annexin V 結(jié)合緩沖液中，調(diào)整細(xì)胞密度至1×106個/mL。每100 μL細(xì)胞懸液加入5 μL Annexin V和1 μL 100 μg/mL的PI工作液。室溫避光孵育15 min。加入400 μL 1×Annexin V結(jié)合緩沖液，輕輕混勻。過濾后用流式細(xì)胞儀檢測。

1.9 ?統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，計量資料以“x±s”表示，先進(jìn)行正態(tài)性檢驗和方差齊性檢驗，取α=0.05，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。方差齊者，完全隨機(jī)設(shè)計的兩均數(shù)比較采用t檢驗，多組間均數(shù)的比較采用單因素方差分析檢驗，不同組比較采用Dunnett-t法。方差不齊時，采用Mann-Whitney U秩和檢驗。

2 結(jié)果

2.1 ?黃芩苷上調(diào)miRNA在乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)

與模型組相比，黃芩苷作用于MCF-7細(xì)胞后，miR-126（P<0.001）、miR-145（P<0.05）、miR-100（P<0.01）、let-7c（P<0.05）表達(dá)水平均明顯上調(diào)，其中以miR-126上調(diào)最為顯著（P<0.001）。見圖1。

2.2 ?miRNA在正常乳腺和乳腺癌細(xì)胞中表達(dá)的比較

與正常組比較，模型組miR-126、miR-145、miR-100、let-7c的表達(dá)均下調(diào)，其中以miR-126下調(diào)最為明顯（P<0.05）。見表2。

2.3 ?各組細(xì)胞增殖率的比較

與模型組比較，黃芩苷組、miR-126組、LNA組細(xì)胞增殖率均顯著下降（P<0.05）;而LNA-126組細(xì)胞增殖率較LNA組顯著增加（P<0.05），與模型組相 比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表3。

2.4 ?各組細(xì)胞遷移率的比較

與模型組比較，黃芩苷組和miR-126組MCF-7細(xì)胞遷移率均下降（P<0.05），而LNA-126+黃芩苷組MCF-7細(xì)胞遷移率無明顯下降（P>0.05）。見表4。

2.5 ?各組細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的比較

與模型組比較，黃芩苷組及miR-126組細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白p53、Caspase-3、Caspase-9、Bax和p-p38蛋白表達(dá)水平明顯增高（P<0.05），而Bcl-2表達(dá)水平明顯下降（P<0.05）;黃芩苷組與miR-126組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見圖2、表5。

2.6 ?各組細(xì)胞凋亡率的比較

與模型組相比，黃芩苷組與miR-126組的凋亡率均顯著增加（P<0.05），miR-126組相較于黃芩苷組凋亡率顯著增加（P<0.05）。見表6。

3 討論

據(jù)不完全統(tǒng)計，2012 年全球新發(fā)女性乳腺癌的人數(shù)約166萬，占女性癌癥發(fā)病率的26%，其死亡率占女性癌癥死亡率的13%[10]。嚴(yán)重危害廣大女性健康。盡管臨床上對于乳腺癌的治療取得了較大的進(jìn)展，但是術(shù)后局部復(fù)發(fā)率依舊很高，為30%～40%，這為乳腺癌治療帶來極大的挑戰(zhàn)。因此，如何防止乳腺癌的侵襲與遷移已成為當(dāng)前迫切需要解決的問題。

miRNA是一類重要的細(xì)胞調(diào)節(jié)因子，具有多種生物學(xué)功能，影響細(xì)胞生長和分化，參與細(xì)胞增殖和凋亡過程[11-13]。miRNA的異常表達(dá)常常誘發(fā)多種疾病，包括腫瘤、白血病與自身免疫性疾病等[14]。經(jīng)研究證實，多種miRNA的異常表達(dá)參與人類惡性疾病的進(jìn)程，影響著多種疾病的病理生理變化[15]。

中醫(yī)藥是我國的文化瑰寶，中醫(yī)藥在乳腺癌治療方面取得了一定成就。大量研究表明，中藥或其單體成分具有顯著的抑制腫瘤細(xì)胞增殖和增強(qiáng)機(jī)體免疫力的作用，可能提高癌癥患者的生存率[16-20]。同時，聯(lián)合其他治療手段還可明顯減少不良反應(yīng)的發(fā)生率，提高療效，降低毒副作用，為癌癥臨床治療開辟了視野，提供了新的思路。中醫(yī)治療主要是從整體上進(jìn)行功能調(diào)節(jié)，恢復(fù)陰陽的動態(tài)平衡。已有研究表明，中藥對腫瘤中異常表達(dá)的基因具有調(diào)控作用，從而糾正其病理狀態(tài)。miRNA的異常表達(dá)參與了癌癥的發(fā)生發(fā)展，為治療癌癥理想而有效的靶點。因此，在miRNA水平探究中醫(yī)藥的抗癌機(jī)制具有重要意義，并可為腫瘤臨床治療提供依據(jù)和研究思路。

本研究采用黃芩苷對MCF-7細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理，然后進(jìn)行miRNA芯片分析，進(jìn)而篩選出受黃芩苷調(diào)控最為明顯的miRNA，進(jìn)一步探討黃芩苷對乳腺癌細(xì)胞增殖、分化、侵襲與遷移的作用及潛在分子機(jī)制。篩選出來的miRNA經(jīng)RT-PCR確認(rèn)，發(fā)現(xiàn)miR-126在乳腺癌細(xì)胞中表達(dá)明顯下調(diào)，而黃芩苷卻能顯著上調(diào)其表達(dá);MTT結(jié)果表明，miR-126和黃芩苷均可抑制MCF-7細(xì)胞的增殖;Transwell結(jié)果表明，miR-126和黃芩苷均可抑制MCF-7細(xì)胞的侵襲與遷移;Western blot結(jié)果表明，miR-126和黃芩苷作用于MCF-7細(xì)胞后引起凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平發(fā)生改變：降低Bcl-2蛋白的表達(dá)，提高p53、Caspase-3、Caspase-9、Bax及p-p38蛋白的表達(dá)，提示它們可以促進(jìn)MCF-7細(xì)胞的凋亡;流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果提示，黃芩苷和miR-126均可促進(jìn)MCF-7細(xì)胞的凋亡;而采用LNA-126進(jìn)行處理后可提高黃芩苷降低的MCF-7細(xì)胞的增殖率與侵襲率，提示黃芩苷可能通過miR-126發(fā)揮抗癌作用。

本研究中黃芩苷屬于黃酮類化合物，為我國傳統(tǒng)中藥黃芩的主要有效成分之一，通過對miR-126的調(diào)控，抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲與遷移，促進(jìn)其凋亡，可能有助于抑制乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展，為乳腺癌的基因診斷、基因治療及預(yù)后的早期預(yù)測提供了新的思路，也為黃芩苷治療乳腺癌提供了實驗依據(jù)，為中醫(yī)藥治療乳腺癌提供了新靶點和新思路。

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