鞏新廷，石 巖，蘇玉賢

（1.內黃縣畜牧獸醫(yī)服務中心，安陽 456300；2.焦作市動物衛(wèi)生監(jiān)督所，焦作 454000；3.平頂山市畜牧技術推廣站，平頂山 467000）

沙門菌（Salmonella）是腸桿菌科的重要致病菌屬，在人和動物的腸道細胞內寄生，有2500多種血清型[1]，絕大部分血清型對人類和畜禽有致病性，引起動物腹瀉、人急性胃腸炎和食物中毒。雞源沙門菌病通常造成雛雞腹瀉、脫水，甚至死亡，成年雞呈慢性或隱性感染，長期攜帶病原菌，蛋雞產蛋性能下降。病雞和帶菌雞為主要傳染源，可以水平和垂直傳播，種雞場一旦發(fā)生疫情很難凈化，嚴重危害養(yǎng)雞業(yè)健康發(fā)展，同時也直接威脅公共衛(wèi)生安全。目前，使用抗生素依然是養(yǎng)雞場防治該病主要手段。但是，長期濫用抗生素導致沙門菌株耐藥性增強，尤其是多重耐藥現象不斷出現，動物成為耐藥菌的重要儲存庫[2]，給有效防治沙門菌病帶來很大困難。

本研究采集2021年河南省平頂山等地區(qū)雞源病料進行細菌分離鑒定、血清型分析和耐藥性檢測，為今后雞源沙門菌病凈化、篩選臨床安全合理用藥提供指導依據。

1 材料與方法

1.1 病料來源和菌株無菌采集河南部分地區(qū)35個規(guī)模雞場疑似雞沙門菌病雞肝臟、心臟和腸道等樣品154份作為待檢病料。腸炎沙門菌標準株（CVCC3377）和大腸埃希氏菌（ATCC29922）購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.2 主要培養(yǎng)基和試劑緩沖蛋白胨水增菌液（BPW）、麥康凱培養(yǎng)基和LB液體培養(yǎng)基、四硫磺酸鈉煌綠（TTB）增菌液、法國科馬嘉沙門菌屬顯色培養(yǎng)基購自青島海博生物技術有限公司；細菌微量生化反應管、沙門菌屬診斷血清（60種）、DL2000 DNA marker、2×PCR Premix購自寧波天潤生物藥業(yè)有限公司；15種K-B藥敏紙片包括大觀霉素（SPT）、氨芐西林（AMP）、環(huán)丙沙星（CIP）、呋喃唑酮（FUR）、阿米卡星（AN）、氟苯尼考（FLO）、鏈霉素（STR）、復方新諾明（SXT）、新霉素（NTL）、阿奇霉素（AZM）、多西環(huán)素（DOX）、左氧氟沙星（LEV）、慶大霉素（CN）、頭孢曲松（CTRX）、頭孢喹肟（CTX）均購自杭州天河微生物試劑有限公司。

1.3 細菌分離培養(yǎng)無菌采集病死雞的肝臟、脾臟、肺臟、肛拭子和用生理鹽水清洗雞蛋表面的污水等病料接種于BPW，36℃±1℃、220 rpm培養(yǎng)12 h后，取1 mL增菌液轉入10 mL TTB，42℃±1℃培養(yǎng)18 h，再用接種環(huán)取適量TTB增菌液劃線接種于法國科馬嘉沙門菌顯色培養(yǎng)基，36℃±1℃培養(yǎng)21 h，挑取疑似沙門菌單個菌落染色鏡檢，觀察菌體形態(tài)，并在麥康凱培養(yǎng)基上進行純化培養(yǎng)。

1.4 生化試驗將分離純化的細菌接種于細菌微量生化反應管中，再放入恒溫箱中，37℃培養(yǎng)24～48 h，觀察記錄結果，結果依據《GB4789.4—2016 食品微生物學檢驗 沙門菌檢驗》[3]進行判定。

1.5 PCR鑒定采用水煮法提取細菌DNA制備模板。挑取待檢純化后的菌落接種于LB液體培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)12 h，10 000×g離心3～5 min，棄掉上清液。滅菌ddH2O洗3次，再用ddH2O重懸，煮沸10 min，冰浴冷卻5 min，10 000×g離心3～5 min，取上清液為DNA模板，-20℃保存，備用。根據GenBank（登錄號：JQ665438.1）發(fā)表的序列，針對沙門菌fimY基因設計一對引物，上游引物序列5'-CGCCCAGCCATACGGATAACC-3'，下游引物序列5'-TACCACGCAGGAAAGACACC-3'。由中美泰和生物技術（北京）有限公司合成，預期擴增片段大小427 bp。PCR反應體系（25 μL）：2×PCR Premix 12.5 μL，DNA模板0.5 μL，上、下游引物各1 μL，ddH2O補至25 μL。反應條件：95℃預變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，共30個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。取5 μL擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用凝膠成像儀觀察結果并記錄。大腸埃希氏菌ATCC29922為陰性對照和腸炎沙門菌標準株CVCC3377為陽性對照。

1.6 血清型鑒定分離菌株的血清型分群和定型鑒定采用GB 4789.4-2016標準中的玻片凝集試驗方法。待檢菌以1.2%LB瓊脂作為測定A～F、O、H抗原的培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)12 h，用生理鹽水制備成2麥氏單位的菌懸液。從血清型鑒定試劑盒中取20 μL的血清于潔凈玻片上，再挑取20 μL菌懸液與血清搖動混勻30 s，觀察凝集結果。同時，設生理鹽水為陰性對照試驗，觀察菌株是否發(fā)生自凝現象。1 min內凝集者判為陽性，均勻渾濁或清亮者為陰性。根據菌體O抗原和鞭毛H抗原鑒定結果，查閱沙門菌抗原式進行被檢菌株血清型分群和定型。

1.7 藥敏試驗藥敏質控菌株為腸炎沙門菌標準株CVCC3377。采用WHO提供的藥敏紙片瓊脂擴散法（Kirby-Baue）測定48株分離菌對15種常見抗菌藥的耐藥性，測量抑菌圈直徑大小，依據美國臨床和實驗室標準協(xié)會標準（Clinical & Laboratory Standards Institute, CLSI）判定15種抗生素敏感（S）、中介（I）和耐藥（R）結果，根據藥敏試驗判定耐藥表型。

2 結果與討論

2.1 細菌分離培養(yǎng)革蘭氏染色為陰性，鏡檢可見短桿狀菌，兩端鈍圓，單個、成對或成叢存在。疑似菌在法國科瑪嘉沙門菌屬顯色培養(yǎng)基呈現為大小一致、邊緣整齊的紫色小菌落，在麥康凱培養(yǎng)基上可見無色、半透明、光滑菌落，符合沙門菌生長特性。共有48株初步判定為疑似沙門菌菌株。

2.2 生化試驗結果生化試驗鑒定結果表明，48株分離菌株均能分解甘露醇、葡萄糖和山梨醇，不發(fā)酵蔗糖，賴氨酸、硫化氫和動力吲哚鳥氨酸試驗陽性，靛基質、尿素、V-P試驗陰性，依據食品安全國家標準沙門菌檢驗標準（GB 4789.4—2016），有48株符合沙門菌生化鑒定特征。

2.3 PCR鑒定結果部分分離菌株檢測結果見圖1。凝膠電泳結果顯示，以沙門菌fimY基因引物對48株分離菌株PCR擴增鑒定，均能擴增出大小為427 bp的目的片段，與預期片段大小一致，對照菌株擴增結果為陰性。結合生化鑒定結果，本次從154份病料樣品中共鑒定分離出48株雞沙門菌，總分離率為31.17%。對來自河南省不同地區(qū)雞源沙門菌鑒定結果統(tǒng)計，48株沙門菌中安陽13株（27.08%），新鄉(xiāng)9株（18.75%），鄭州7株（14.58%），平頂山11株（22.92%），焦作8株（16.67%），表明上述地區(qū)均有不同程度雞源沙門菌感染。錢明珠等[4]對河南省部分雞沙門菌流行病調查，分離率為27.97%；廖成水等[5]報道，河南部分地區(qū)雞源沙門菌分離率為15.89%。本研究高于上述檢測率，表明近年來雞源沙門菌感染有上升的趨勢，需要加強雞沙門菌病的凈化控制。

圖1 部分分離菌株的PCR鑒定結果Fig.1 The PCR identification results of isolated strains

2.4 血清型鑒定結果采用玻片凝集法對48株沙門菌血清型分型試驗，鑒定結果顯示，共鑒定出44株沙門菌的血清型，占沙門菌分離株的91.67%（44/48），其余4株未確定出血清型。鑒定出的44株沙門菌分屬3個大群5種血清型，包括19株雞白痢沙門菌（43.18%）、13株腸炎沙門菌（29.54%）、7株鼠傷寒沙門菌（27.27%）、3株甲型副傷寒沙門菌（6.18%）和2株乙型副傷寒沙門菌（4.45%）。優(yōu)勢血清型為雞白痢沙門菌、腸炎沙門菌和鼠傷寒沙門菌。河南省部分地區(qū)雞源沙門菌血清型分布見表1。

表1 河南省部分地區(qū)雞源沙門菌血清型分布Table 1 Distribution of serotypes of Salmonella from chicken in some areas of Henan Province

2.5 藥敏試驗結果對48株雞源沙門菌進行15種抗生素耐藥性檢測，結果見表2。對氨芐西林耐藥率最高，為95.83%，其次對呋喃唑酮、大觀霉素、鏈霉素也具有較高的耐藥性，介于62.50%～66.67%；對環(huán)丙沙星、氟苯尼考、復方新諾明和左氧氟沙星耐藥菌株占比介于10.42%～22.92%；對阿米卡星、新霉素、阿奇霉素、多西環(huán)素、慶大霉素、頭孢曲松、頭孢喹肟的耐藥率最低，介于2.08%～8.33%。48株雞源沙門菌抗生素耐藥譜結果見表3。2株（4.17%）對所有試驗藥物敏感，37株至少對3種或3種以上的抗生素出現耐藥性，多重耐藥率占77.08%（37/48）；以4重和5重耐藥最多，有25株，占52.08%（25/48），最多為8重耐藥，有1株，占2.08%（1/48）。耐藥模式較多，耐藥表型主要為AMP+FUR+SPT+STR。沈學懷等[6]報道，安徽地區(qū)禽源沙門菌對左氧氟沙星、阿米卡星和阿奇霉素等高度敏感；戴建華等[7]從江蘇蘇中地區(qū)分離的22株沙門菌對阿米卡星、甲氧胺嘧啶、萘啶酮酸、慶大霉素、諾氟沙星的耐藥率均為72.73%～100%，表現嚴重的耐藥性，與本研究結果基本一致。

表2 分離菌株藥敏試驗結果Table 2 Drug susceptibility test results of isolated strains

表3 48株沙門菌分離株抗菌藥耐藥譜Table 3 Antimicrobial resistance spectrum of 48 Salmonella isolates

根據本研究中的藥敏試驗結果，建議選取阿米卡星、多西環(huán)素、慶大霉素、頭等高敏藥物作為臨床用藥，采用交叉用藥、輪換用藥等方式，減少耐藥菌株產生。同時，應加強養(yǎng)雞場沙門菌凈化，強化流行病學調查和耐藥性監(jiān)測，保證雞群的健康養(yǎng)殖。