孔慶新， 黃業(yè)傳， 徐偉平， 張徑舟， 劉碧林， 李思陽(yáng)

（1.重慶化工職業(yè)學(xué)院 制藥工程學(xué)院，重慶 401228；2.荊楚理工學(xué)院 生物工程學(xué)院，湖北 荊門 448000；3.西南政法大學(xué)，重慶 401120；4.江蘇食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)院 藥學(xué)院，江蘇 淮安 223001）

牛乳是一種營(yíng)養(yǎng)豐富、老少皆宜的食物。近年來(lái)，以牛乳為主要原料，添加茶或水果開發(fā)出了奶茶、果奶等乳飲料產(chǎn)品，產(chǎn)品形式多樣、風(fēng)味更佳、營(yíng)養(yǎng)全面。然而，茶、水果等植物原料中含有的多酚類物質(zhì)易與牛乳中蛋白質(zhì)作用形成復(fù)合物，影響多酚的活性和牛乳蛋白質(zhì)的性質(zhì)，進(jìn)而影響產(chǎn)品的功能和營(yíng)養(yǎng)特性。很多學(xué)者對(duì)蛋白質(zhì)與多酚的結(jié)合進(jìn)行了較深入的研究，如兩者間的結(jié)合類型、結(jié)合位點(diǎn)、結(jié)合機(jī)理等[1-5]。小分子物質(zhì)與蛋白質(zhì)的交聯(lián)主要靠非共價(jià)鍵[6]，如氫鍵、疏水相互作用、范德華力、靜電作用，在一定條件下也可共價(jià)交聯(lián)[7-9]。

外源植物成分的加入，導(dǎo)致牛乳pH發(fā)生變化，進(jìn)而影響多酚與蛋白質(zhì)的結(jié)合，從而影響產(chǎn)品品質(zhì)。很多學(xué)者開展了pH對(duì)多酚與牛乳蛋白質(zhì)結(jié)合影響的研究，如川陳皮素在酸性（pH 3.0）與中性（pH 7.4）條件下[10]、阿魏酸在酸性（pH 2.4）和中性條件（pH 7.3）下[11]、芹黃素在pH分別為2.6、6.2、7.1、8.2條件下[12]與β-乳球蛋白的交聯(lián)，沒(méi)食子酸和表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯在pH分別為3.0和7.0條件下與天然乳清蛋白的交聯(lián)[13]。劉嬋[14]模擬了胃（pH 2.0）、腸（pH 7.5）環(huán)境下，茶多酚與乳蛋白、消化酶間的結(jié)合及三者的競(jìng)爭(zhēng)情況。

幾十年來(lái)，學(xué)者們將光譜技術(shù)、波譜技術(shù)、量熱技術(shù)等用于研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，但測(cè)得的只是靜態(tài)結(jié)構(gòu)，而生物體內(nèi)蛋白質(zhì)一直處于動(dòng)態(tài)變化中。近年來(lái)，分子模擬已成為研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的一種有效手段，成為繼實(shí)驗(yàn)和理論手段后，從分子水平認(rèn)識(shí)蛋白質(zhì)的第3種手段，是一種具有足夠小的時(shí)間尺度和空間尺度的強(qiáng)大模擬技術(shù)[15-16]。用于蛋白質(zhì)和小分子物質(zhì)結(jié)合的主要分子模擬手段有分子對(duì)接和分子模擬。一些學(xué)者采用分子模擬對(duì)牛乳蛋白質(zhì)與小分子物質(zhì)的結(jié)合進(jìn)行了研究，如柑橘黃酮[17]、姜黃素[18]、茶多酚[14]、蘆丁[19]等。關(guān)于不同pH條件下多酚與乳蛋白的交聯(lián)，一些學(xué)者也進(jìn)行了分子模擬[10-12，14]，劉嬋[14]的研究涉及茶多酚與β-乳球蛋白的交聯(lián)，但該研究只使用了分子對(duì)接對(duì)兩者的結(jié)合位點(diǎn)和結(jié)合能進(jìn)行探索，分子對(duì)接雖能研究蛋白質(zhì)與小分子物質(zhì)間的結(jié)合模式、結(jié)合能，以及蛋白質(zhì)上參與結(jié)合的殘基，但無(wú)法獲得結(jié)合的動(dòng)力學(xué)過(guò)程，而分子模擬能更深入地研究其結(jié)合機(jī)制。

β-乳球蛋白是牛乳中的一種重要蛋白質(zhì)，因其具有良好的功能和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，廣泛應(yīng)用于食品中。β-乳球蛋白對(duì)疏水及兩性配體均具有良好的親和能力[20]。EGCG（表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯）是茶多酚中主要成分之一，因此，本研究中以β-乳球蛋白和EGCG為研究對(duì)象，同時(shí)用分子對(duì)接和分子模擬技術(shù)探討pH為2（酸性）、5（接近等電點(diǎn)）和8（微堿性）條件下，兩者結(jié)合能和結(jié)合機(jī)制的差異，以期為進(jìn)一步提高茶乳飲料的質(zhì)量奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 β-乳球蛋白與茶多酚EGCG的分子對(duì)接

β-乳球蛋白從RCSB網(wǎng)站下載（ID號(hào)：3npo），下載后用PyMOL軟件手動(dòng)除去結(jié)晶水。小分子物質(zhì)EGCG用ChemDraw Professional 17.1和Chem3D 17.1制備，并用其自帶的MM2力場(chǎng)進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化，通過(guò)AutoDock Tools（1.5.6版本）對(duì)β-乳球蛋白和EGCG進(jìn)行處理，其中EGCG加氫、計(jì)算gasteiger電荷，β-乳球蛋白加氫、計(jì)算gasteiger電荷、合并非極性氫，并分別生成β-乳球蛋白和EGCG的pdbqt文件。對(duì)接采用全盲對(duì)接，EGCG設(shè)置為全柔性，盒子大小設(shè)定為40×40×40?，中心坐標(biāo)為默認(rèn)值，設(shè)置間隔為1?。對(duì)接時(shí)采用AutoDock Vina搜索前20個(gè)得分最高的構(gòu)象，對(duì)接參數(shù)energy_range設(shè)置為5，exhaustiveness設(shè)置為100。

1.2 不同pH條件下EGCG與β-乳球蛋白結(jié)合的分子模擬

從上述1.1得到的能量最高的構(gòu)象中，剝離出EGCG的pdb結(jié)構(gòu)，并在ATB網(wǎng)站生成其top文件。采用PROPKA在線計(jì)算平臺(tái)計(jì)算β-乳球蛋白在pH分別為2、5、8時(shí)的氨基酸殘基質(zhì)子化狀態(tài)，根據(jù)計(jì)算結(jié)果來(lái)設(shè)定β-乳球蛋白的不同質(zhì)子化狀態(tài)以模擬相應(yīng)的pH。采用Gromacs（2019.03）軟件進(jìn)行分子模擬，先將EGCG合并到β-乳球蛋白中，修改復(fù)合物的top文件；選用GROMOS54a7力場(chǎng)，將β-乳球蛋白置于立方體水盒子中，采用SPC水模型，將β-乳球蛋白離盒子邊緣最短距離設(shè)置為1 nm并添加Na+或Cl-使體系達(dá)到電中性，使用最速下降法對(duì)體系進(jìn)行能量最小化。在NVT和NPT系綜下分別進(jìn)行400 ps的平衡，達(dá)到預(yù)設(shè)的溫度和壓力（溫度為300 K，壓力為1 MPa）。最后進(jìn)行150 ns的分子模擬，使用LINCS算法約束所有鍵，使用PME計(jì)算靜電作用，范德華力使用截?cái)喟霃綖?.4 nm。選用Parrinello-Rahman壓浴方式，Isotropic控壓方式，V-rescale控溫方式。模擬步長(zhǎng)為2 fs，每10 ps貯存1次數(shù)據(jù)，每個(gè)處理平行模擬2次。

模擬結(jié)束后，使用gmx的rms命令分別分析150 ns模擬過(guò)程中各pH條件下EGCG和β-乳球蛋白的均方根誤差（RMSD）；并用gmx的相應(yīng)命令分析各pH條件下β-乳球蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定后（100~150 ns）蛋白質(zhì)殘基的波動(dòng)（RMSF）、蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)、蛋白溶劑可及表面積。分析時(shí)每100 ps選取一個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)，作圖用Origin 8.0軟件。

1.3 MM-PBSA計(jì)算EGCG與β-乳球蛋白的結(jié)合能

提取模擬過(guò)程中100~150 ns的軌跡，借助g_mmpbsa實(shí) 用工具，利用MM-PBSA（Molecular mechanics poisson–boltzmann surface area）方法計(jì)算EGCG與β-乳球蛋白之間的結(jié)合能[21-22]。

1.4 EGCG與β-乳球蛋白結(jié)合的二維平面圖和表面結(jié)構(gòu)圖

提取各pH條件下EGCG與β-乳球蛋白復(fù)合物在100~150 ns的平均pdb，用LigPlot+（V 2.2）分析EGCG與β-乳球蛋白結(jié)合位點(diǎn)的疏水相互作用和形成的氫鍵，并在PyMOL軟件中繪制β-乳球蛋白分子的表面結(jié)構(gòu)圖及與EGCG結(jié)合情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 β-乳球蛋白對(duì)酚類的結(jié)合位點(diǎn)

如圖1所示，β-乳球蛋白單體由162個(gè)氨基酸組成，由8條反向平行的β-折疊構(gòu)成桶狀結(jié)構(gòu)，其外側(cè)含有1個(gè)α-螺旋。

圖1 EGCG在β-乳球蛋白的主要結(jié)合位點(diǎn)Fig.1 Main binding sites of EGCG to β-lactoglobulin

2.2 EGCG與β-乳球蛋白結(jié)合的分子動(dòng)力學(xué)

通過(guò)AutoDock Vina對(duì)接，發(fā)現(xiàn)在前20個(gè)能量較高的結(jié)合姿勢(shì)中，EGCG在β-乳球蛋白的結(jié)合區(qū)域主要有3個(gè)，如圖1所示，其中最主要是1號(hào)區(qū)域，位于疏水腔的上部，其結(jié)合能也較高；另外兩個(gè)是位于β-乳球蛋白表面的2號(hào)和3號(hào)位點(diǎn)，其中3號(hào)位點(diǎn)只有20個(gè)對(duì)接結(jié)果中的1個(gè)，且結(jié)合能較低。關(guān)于多酚在β-乳球蛋白結(jié)合位點(diǎn)的報(bào)道較多，其中但倩譽(yù)[10]的研究認(rèn)為在pH為7.4時(shí)，小分子物質(zhì)（川陳皮素）主要結(jié)合在疏水腔，而在酸性條件下（pH 3.0）時(shí)小分子物質(zhì)結(jié)合在β-乳球蛋白表面；Abdulatif等[19]也認(rèn)為蘆丁既可以結(jié)合在疏水腔也可以結(jié)合在蛋白質(zhì)表面，其中疏水腔的結(jié)合力更大。盡管其研究中小分子物質(zhì)都是偏疏水性，本研究中茶多酚偏親水性，但研究結(jié)果與本研究結(jié)果基本一致，因?yàn)楸狙芯恐邢螺d的β-乳球蛋白為中性pH。而Gholami等[3]研究發(fā)現(xiàn)柚皮苷只吸附在β-乳球蛋白表面；Zhu等[12]研究阿魏酸與β-乳球蛋白的結(jié)合時(shí)，發(fā)現(xiàn)在酸性條件下（pH 2.4）阿魏酸主要結(jié)合在疏水腔，而在中性條件下（pH 7.3）阿魏酸則主要吸附在表面蛋白二聚體的結(jié)合處；Li等[23]研究4種不同黃酮與β-乳球蛋白的交聯(lián)時(shí)，發(fā)現(xiàn)均在2號(hào)位點(diǎn)的結(jié)合能最大。以上結(jié)果的差異可能主要與小分子物質(zhì)結(jié)構(gòu)、初始蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)或模擬條件的差異有關(guān)。

2.2.1 RMSD（均方根誤差）在模擬過(guò)程中的變化RMSD（均方根誤差）是衡量特定時(shí)間蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與原始構(gòu)象的平均偏差，是評(píng)價(jià)研究體系是否穩(wěn)定的重要指標(biāo)，圖2是不同質(zhì)子化狀態(tài)下體系中EGCG和β-乳球蛋白的RMSD對(duì)比?？梢钥闯觯珽GCG在前60 ns波動(dòng)較大，在60 ns后基本保持穩(wěn)定，但pH為2時(shí)仍有一定幅度的波動(dòng)，且就整體波動(dòng)而言，pH為2時(shí)EGCG波動(dòng)大于pH為5和8時(shí)，說(shuō)明在酸性條件下EGCG與β-乳球蛋白結(jié)合過(guò)程中波動(dòng)更大。就β-乳球蛋白的波動(dòng)而言，3個(gè)pH條件下RMSD相當(dāng)，且均在很短的時(shí)間內(nèi)就達(dá)到了平衡（20 ns）。因此，總的來(lái)說(shuō)，不同pH條件下EGCG與β-乳球蛋白的結(jié)合很平穩(wěn)，EGCG只在有限的范圍內(nèi)存在一定的波動(dòng)，不會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)造成大的影響。Sahihi等[17]模擬柑橘黃酮與β-乳球蛋白的交聯(lián)時(shí)也發(fā)現(xiàn)結(jié)合很平穩(wěn)，RMSD較小；Gholami等[3]研究柚皮苷和β-乳球蛋白的結(jié)合時(shí)發(fā)現(xiàn)小分子物質(zhì)波動(dòng)比β-乳球蛋白??；Abdulatif等[19]研究蘆丁與β-乳球蛋白結(jié)合時(shí)，發(fā)現(xiàn)小分子物質(zhì)與β-乳球蛋白的波動(dòng)相當(dāng)，這些都與本研究的結(jié)論基本一致。本研究中，pH為2時(shí)β-乳球蛋白與EGCG的波動(dòng)相當(dāng)，而pH為5或8時(shí)，EGCG的波動(dòng)略小于β-乳球蛋白。

圖2 不同pH條件下模擬過(guò)程中EGCG和β-乳球蛋白的RMSD對(duì)比Fig.2 RMSD comparison of small molecule and protein during different pH simulation

2.2.2 RMSF（均方根漲落）在模擬過(guò)程中的變化RMSF主要反映蛋白質(zhì)中各氨基酸殘基在不同pH條件下的波動(dòng)情況，波動(dòng)越大，說(shuō)明該殘基柔性越大，平均柔性越高蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)越不穩(wěn)定。從圖3中可以看出，各體系RMSF相當(dāng)，沒(méi)有明顯差異，說(shuō)明不同pH總體上對(duì)殘基波動(dòng)影響不大。就EGCG和β-乳球蛋白結(jié)合口袋附近而言，殘基波動(dòng)較大的有86號(hào) 位的Ala、87號(hào) 位 的Leu和88號(hào) 位 的Asn。RMSF的結(jié)果與Sahihi等[17]模擬柑橘黃酮與β-乳球蛋白的結(jié)合結(jié)果基本一致。

圖3 分子模擬過(guò)程中不同pH條件下β-乳球蛋白的RMSF對(duì)比Fig.3 RMSF comparison of different pH during molecular dynamics simulation

2.2.3 不同pH對(duì)蛋白溶劑可及表面積的影響從表1可以看出，總?cè)軇┛杉氨砻娣e、疏水表面積及親水表面積均是隨pH的增加先減少再增加，親水表面積大于疏水表面積，因此β-乳球蛋白在不同pH條件下總體上均為水溶性。pH從2增加到5時(shí)，總?cè)軇┛杉氨砻娣e的減少可能是由于β-乳球蛋白從單體變?yōu)槎垠w的原因，而pH從5增加到8時(shí)總?cè)軇┛杉氨砻娣e的增加可能是由于Tanford的轉(zhuǎn)變，即β-乳球蛋白上的EF環(huán)（殘基85~90）形成了疏水腔的蓋子，其在pH低于6.2時(shí)關(guān)閉，而在高于7.1時(shí)打開，蓋子關(guān)閉時(shí)，部分溶劑可及表面積被掩埋[12]。從2.2.2的分析也可以看出，波動(dòng)較大的86~88號(hào)殘基正是位于EF環(huán)上，因此可以推測(cè)Tanford轉(zhuǎn)變確有發(fā)生。

表1 不同pH對(duì)蛋白溶劑可及表面積的影響Table 1 Effect of different pH on the solvent accessible surface area of lactoglobulin

2.2.4 不同pH對(duì)β-乳球蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響從表2可以看出，隨著pH的升高，α-螺旋和β-折疊均有所降低，pH為5時(shí)降至最低；伴隨著α-螺旋和β-折疊的降低，無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)有所增加；而轉(zhuǎn)角和彎曲的變化是相反的，pH為2時(shí)β-乳球蛋白中轉(zhuǎn)角顯著高于另兩個(gè)pH，而彎曲的變化則相反。二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化，意味著蛋白質(zhì)與多酚在結(jié)合時(shí)結(jié)合位點(diǎn)和結(jié)合能可能也會(huì)發(fā)生變化，從而導(dǎo)致結(jié)合的穩(wěn)定性有所不同。Abdollahi等[11]研究阿魏酸與β-乳球蛋白結(jié)合時(shí)，也發(fā)現(xiàn)pH升高時(shí)，α-螺旋和β-折疊的比例均降低，而無(wú)規(guī)則卷曲增加，這與本研究中的結(jié)果一致。而Zhu等[12]則發(fā)現(xiàn)在不同pH條件下β-乳球蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)變化不大。

表2 不同pH對(duì)β-乳球蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響Table 2 Effect of different pH on the secondary structure of β-lactoglobulin單位：個(gè)

2.3 MM-PBSA分析EGCG與β-乳球蛋白的結(jié)合能

從表3可以看出，pH為5時(shí)β-乳球蛋白與EGCG的結(jié)合能最大，其次是pH為2時(shí)，而pH為8時(shí)兩者的結(jié)合能最低。從具體的能量組成來(lái)看，在3個(gè)pH條件下非極性溶劑化能相當(dāng)，均較低；范德華力為β-乳球蛋白與EGCG結(jié)合的主要作用力，其在pH為5時(shí)最高，pH為2時(shí)最低；靜電作用力在pH為5時(shí)最低，pH為8時(shí)最高，pH不同會(huì)使部分殘基的側(cè)鏈帶有不同電荷而引起靜電作用力的差異，pH為5時(shí)最接近β-乳球蛋白的等電點(diǎn)，所帶凈電荷最少，從而靜電作用力也最低；極性溶劑化能阻礙β-乳球蛋白與EGCG的結(jié)合，且隨pH的增加阻礙作用也增大。Zhan等[24]研究β-乳球蛋白與辣椒素結(jié)合時(shí)，用MM-PBSA計(jì)算得到的結(jié)合能是-142.744 kJ/mol，范德華力為主要結(jié)合力，與本研究結(jié)果基本一致。Abdulatif等[19]研究蘆丁和β-乳球蛋白的結(jié)合時(shí)，用MM-GBSA計(jì)算出兩者在蛋白質(zhì)表面的結(jié)合能為-285.647 kJ/mol，大于本研究的結(jié)果，這可能與小分子物質(zhì)結(jié)構(gòu)不同有關(guān)，也可能與計(jì)算方法不同有關(guān)。Zhu等[12]研究了β-乳球蛋白和芹黃素的結(jié)合，發(fā)現(xiàn)pH為7.1和pH為8.2時(shí)芹黃素主要靠疏水相互作用吸附在疏水腔，而pH為2.6和pH為6.2時(shí)主要是靠氫鍵和范德華力吸附在β-乳球蛋白表面，不同pH條件下吸附能（E）為E（pH 6.2）>E（pH 8.2）>E（pH 7.1）>E（pH 2.6），與本研究中的結(jié)論有所差異，因?yàn)樵撗芯恐邢仍诟鱬H條件下分別進(jìn)行對(duì)接，并用各自的最佳對(duì)接構(gòu)象來(lái)進(jìn)行分子模擬和結(jié)合能計(jì)算，而本研究中起始構(gòu)象均在疏水腔，因此模擬的起始構(gòu)象不一樣。一些學(xué)者也研究了小分子風(fēng)味物質(zhì)，如醛、酮、酯等在不同pH條件下吸附于β-乳球蛋白的情況，發(fā)現(xiàn)在pH為3~9時(shí)，pH越高吸附作用越強(qiáng)[25-26]，原因可能是小分子風(fēng)味物質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量較小，與β-乳球蛋白結(jié)合時(shí)空間位阻較小，可結(jié)合位點(diǎn)多，pH增加時(shí)β-乳球蛋白的結(jié)構(gòu)變化更有利于這些小分子風(fēng)味物質(zhì)的結(jié)合或增加了結(jié)合位點(diǎn)。

表3 不同pH條件下β-乳球蛋白與EGCG結(jié)合的MM-PBSA結(jié)合能變化Table 3 Effect of different pH on the MM-PBSA binding affinity between protein and EGCG

從不同殘基的能量貢獻(xiàn)值來(lái)看，pH為2時(shí)排名 前10的 分 別 是Leu31、Pro38、Pro113、Asn109、Lys91、Ala37、Glu108、Ala118、Glu89、Leu1；pH為5時(shí)排 名 前10的 分 別 是Met107、Leu58、Ile84、Ile71、Val92、Val43、Ile56、Val41、Phe105、Leu31；pH為8時(shí)排 名 前10的 分 別 是Ile84、Ile71、Leu39、Val41、Glu62、Met107、Leu58、Val92、Pro38、Glu108?？梢钥闯觯琾H為5時(shí)殘基均為疏水氨基酸，這10個(gè)殘基共貢獻(xiàn)了-50.75 kJ/mol的結(jié)合能；pH為8和pH為2時(shí)分別有8個(gè)和6個(gè)疏水氨基酸，這8個(gè)和6個(gè)殘基分別貢獻(xiàn)了-40.22 kJ/mol和-24.42 kJ/mol的結(jié)合能，說(shuō)明β-乳球蛋白與EGCG在pH為5時(shí)疏水相互作用最強(qiáng)，pH為2時(shí)最弱。另外，排名前10的殘基中，pH為5和pH為8時(shí)有6個(gè)殘基一樣，而pH為2時(shí)與另外兩個(gè)pH相同的殘基很少，這說(shuō)明酸性條件下β-乳球蛋白與EGCG的相互作用可能發(fā)生了較大的變化。

2.4 β-乳球蛋白與EGCG可能的結(jié)合機(jī)制分析

從圖4可以看出，不同pH條件下，EGCG所處的疏水環(huán)境基本一致，均與周圍的Leu39、Val41、Lys69、Ile71、Met107、Glu108存在疏水相互作用，氨基酸環(huán)境與Cheng等[27]報(bào)道的夭車菊素-3-O-葡萄糖苷在β-乳球蛋白的結(jié)合位點(diǎn)基本一致，也與Kanakis等[20]報(bào)道的EGCG與β-乳球蛋白結(jié)合后EGCG所處的氨基酸環(huán)境基本一致。從2.3的分析可以看出，雖然疏水環(huán)境相似，但不同pH時(shí)β-乳球蛋白疏水殘基對(duì)結(jié)合能的貢獻(xiàn)存在明顯差異。不同pH條件下EGCG與β-乳球蛋白形成的氫鍵數(shù)目不同，pH為2時(shí)為5個(gè)氫鍵，分別是88、90、109的Asn和116號(hào)位的Ser，其中EGCG與109號(hào)位的Asn形成2個(gè)氫鍵；pH為5時(shí)形成了6個(gè)氫鍵，與pH為2時(shí)相比，Asn88與EGCG形成 了2個(gè)氫鍵；而pH為8時(shí) 只 形 成 了4個(gè) 氫 鍵，EGCG與Asn88和Ser116各形成1個(gè)氫鍵，與Asn109形成2個(gè)氫鍵，而Asn90則與EGCG不存在氫鍵。因此可以推斷，不同pH條件下，EGCG與β-乳球蛋白結(jié)合力的差異也部分與氫鍵有關(guān)。從表3可以看出，pH為5時(shí)靜電作用最弱，因此除了氫鍵以外，EGCG與β-乳球蛋白的其他弱靜電作用也很重要[28]。

圖4 不同pH條件下EGCG與β-乳球蛋白相互作用的二維平面圖Fig.4 2D plot for interaction between EGCG and βlactoglobulin at pH 2，pH 5 and pH 8

Abdulatif等[19]研究發(fā)現(xiàn)蘆丁與β-乳球蛋白的結(jié)合時(shí)形成7個(gè)氫鍵，但最佳結(jié)合位點(diǎn)與本研究有所差異。Cheng等[27]報(bào)道夭車菊素-3-O-葡萄糖苷也吸附在β-乳球蛋白的疏水腔，主要結(jié)合力為氫鍵和疏水相互作用，且形成的氫鍵有兩個(gè)分別與Asn109和Ser116結(jié)合，與本研究中一致。賈晶晶[29]研究EGCG與β-乳球蛋白結(jié)合時(shí)發(fā)現(xiàn)結(jié)合力以疏水相互作用為主，同時(shí)也有范德華力和氫鍵。本研究中，EGCG與β-乳球蛋白之間的結(jié)合同時(shí)存在氫鍵、疏水相互作用、靜電作用和范德華力。綜合分析，pH為5時(shí)氫鍵、疏水相互作用、范德華力均為最大，雖然靜電作用力最小，但其貢獻(xiàn)有限，因此pH為5時(shí)EGCG與β-乳球蛋白的結(jié)合能最高。

為進(jìn)一步探索高壓對(duì)β-乳球蛋白表面結(jié)構(gòu)及與EGCG結(jié)合的影響，用PyMOL軟件繪制了不同pH質(zhì)子化狀態(tài)下100~150 ns模擬過(guò)程中β-乳球蛋白的表面結(jié)構(gòu)及多酚與β-乳球蛋白的結(jié)合情況（見圖5）。由圖5可以看出，在不同pH條件下β-乳球蛋白的表面結(jié)構(gòu)均有差異，特別是在位于疏水腔上部結(jié)合口袋處的結(jié)構(gòu)差異較大，結(jié)構(gòu)的差異也必然會(huì)導(dǎo)致β-乳球蛋白與EGCG的結(jié)合產(chǎn)生差異，且EGCG的結(jié)合姿勢(shì)明顯不同。在pH為5時(shí)EGCG更加伸展，也更加靠近疏水腔的內(nèi)部。因此，pH為5時(shí)β-乳球蛋白與EGCG的結(jié)合能最高可能也與此有關(guān)，EGCG結(jié)構(gòu)越伸展越能與更多的氨基酸側(cè)鏈發(fā)生相互作用，增強(qiáng)氫鍵和疏水作用力。

圖5 不同pH條件下蛋白質(zhì)分子表面結(jié)構(gòu)及與多酚結(jié)合情況Fig.5 Surface structure and polyphenol binding of protein at pH 2，pH 5 and pH 8

3 結(jié)語(yǔ)

茶多酚EGCG主要結(jié)合在β-乳球蛋白的3個(gè)位點(diǎn)，其中疏水腔的結(jié)合最穩(wěn)定。選取疏水腔作為結(jié)合位點(diǎn)，進(jìn)行EGCG與β-乳球蛋白結(jié)合的分子模擬，發(fā)現(xiàn)結(jié)合過(guò)程中EGCG在模擬前期的波動(dòng)并不會(huì)影響β-乳球蛋白結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。pH為8時(shí)蛋白疏水表面積最大，pH為2時(shí)β-乳球蛋白的α-螺旋和β-折疊含量最高，pH為5時(shí)這三者均為最低。不同pH條件下β-乳球蛋白表面的結(jié)構(gòu)差異較大，特別是位于疏水腔入口的結(jié)合位點(diǎn)處，這可能是影響EGCG與β-乳球蛋白結(jié)合能和結(jié)合姿勢(shì)不同的重要原因之一。EGCG與β-乳球蛋白的結(jié)合能在pH為5時(shí)最高，其次是pH為2時(shí)，而pH為8時(shí)最低；pH為5時(shí)，盡管靜電作用力低于另外兩個(gè)pH，但由于其疏水作用力、氫鍵和范德華力最強(qiáng)，因此總的結(jié)合能較高。本研究中進(jìn)一步明確了不同pH條件下蛋白質(zhì)與多酚等小分子物質(zhì)的結(jié)合機(jī)理，進(jìn)而為 提高植物蛋白飲料的質(zhì)量奠定了一定的理論基礎(chǔ)。