呂新河， 朱云龍*，2

（1.南京旅游職業(yè)學(xué)院 烹飪與營養(yǎng)學(xué)院，江蘇 南京 211100；2.揚(yáng)州大學(xué) 旅游烹飪學(xué)院·食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225127）

泥鰍作為我國極具特色的淡水魚類，具有重要的經(jīng)濟(jì)以及研究價值[1]。泥鰍適應(yīng)環(huán)境能力強(qiáng)且營養(yǎng)豐富[2-3]，近年來得到國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注以及挖掘研究。目前市場上關(guān)于泥鰍蛋白產(chǎn)品的開發(fā)研究大多聚焦于泥鰍相關(guān)的粗加工品，均未能將泥鰍體內(nèi)的活性成分深度運(yùn)用[4-6]。在上述背景下，作者以泥鰍為原料，提取蛋白多肽并進(jìn)行體外抗氧化活性以及體內(nèi)抗氧化活性研究，為泥鰍蛋白的深入研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

泥鰍：購自南京市眾彩批發(fā)市場；60只5周齡的（20.0±2.0）g SPF級雌性小鼠：購自常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動物有限公司。

堿性蛋白酶（酶活為120 000 U/g）、GSH-Px試劑盒、MDA試劑盒、SOD試劑盒：購自南京建成公司；其余均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

FA3204電子分析天平：上海邦億精密量儀有限公司產(chǎn)品；723N可見分光光度計(jì)：上海佑科儀表有限公司產(chǎn)品；ULT1386-3-V超低溫冰箱：美國REVCO公司產(chǎn)品；ALPHA 1-2LD PLUS凍干機(jī)：德國Marin Christ公司產(chǎn)品；L4-6KR低溫離心機(jī)：深圳三利儀器有限公司產(chǎn)品；LM纖維超濾裝置：博納機(jī)械設(shè)備有限公司產(chǎn)品；高壓滅菌鍋：山東博科有限公司產(chǎn)品；SYC恒溫水浴鍋：上海耀特儀器有限公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 泥鰍蛋白多肽的制備參考高丹丹等[7]的制備方法，并稍做修改。稱取固定質(zhì)量的樣本，只取樣本的肌肉組織進(jìn)行均質(zhì)處理，按料液質(zhì)量體積比1 g∶40 mL與去離子水混合，混合均勻后，用1 mol/L的NaOH將pH調(diào)節(jié)至10.0，加入堿性蛋白酶反應(yīng)（加酶量1 500 U/g）2 h，沸水浴滅酶8 min，水解產(chǎn)物在6 000 r/min的條件下離心15 min，取上清液并通過可截留相對分子質(zhì)量為10 000的平板膜，收集相對分子質(zhì)量小于10 000的酶解液，冷凍干燥24 h后獲得泥鰍蛋白多肽。

1.3.2 體外抗氧化活性研究

1）羥自由基（·OH）清除能力的測定 羥自由基（·OH）清除能力的測定參照李亞會等[8]方法，并在此基礎(chǔ)上稍做改進(jìn)。將制得的泥鰍蛋白多肽用蒸餾水調(diào)制為不同質(zhì)量濃度蛋白多肽溶液（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL）。取1.0 mL 9.0 mmol/L FeSO4·7H2O溶液、1.0 mL 9.0 mmol/L水楊酸-乙醇、1 mL泥鰍蛋白多肽，最后加入1 mL 8.8 mmol/L H2O2，37℃的條件下水浴加熱0.5 h，測定510 nm處的吸光度，記為A1；以蒸餾水替換過氧化氫以及泥鰍蛋白多肽溶液（受測溶液），重復(fù)以上實(shí)驗(yàn)，測得吸光度分別記為A2以及A0。按照式（1）計(jì)算羥自由基（·OH）清除率I1，以VC作為對照，評價其消除能力，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，并對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2）ABTS自由基清除能力的測定ABTS自由基清除能力的測定參照Yap等[9]方法，并在此基礎(chǔ)上稍做改進(jìn)。實(shí)驗(yàn)步驟如下：將制得的泥鰍蛋白多肽用蒸餾水調(diào)制為不同質(zhì)量濃度溶液（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL）。取0.2 mL 7.4 mmol/L ABTS和0.2 mL 2.6 mmol/L K2S2O8，室溫避光環(huán)境中混合靜置15 h。取磷酸緩沖溶液（pH 7.4）將混合靜置試劑稀釋50倍作為ABTS工作液。將0.2 mL體積分?jǐn)?shù)95%乙醇溶液與0.8 mL ABTS工作液混合靜置6 min，在734 mm下測定吸光度，記作A10；用受測溶液替換體積分?jǐn)?shù)95%乙醇溶液，重復(fù)以上實(shí)驗(yàn)，記為A。按照式（2）計(jì)算ABTS自由基清除率I2，以VC作為對照，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，并對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

3）DPPH自由基（DPPH·）清除能力的測定DPPH自由基（DPPH·）清除能力的測定參考劉沙等[10]的方法，并稍做修改。實(shí)驗(yàn)步驟如下：將制得的泥鰍蛋白多肽用蒸餾水調(diào)制為不同質(zhì)量濃度溶液（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL）。量取2.0 mL調(diào)配好的泥鰍蛋白多肽溶液與2.0 mL DPPH·乙醇溶液混合，常溫下反應(yīng)0.5 h，測定517 nm的吸光度，記作A20。取2.0 mL DPPH·乙醇溶液與2.0 mL無水乙醇重復(fù)以上步驟，測定吸光度記作Ac。取2.0 mL泥鰍蛋白多肽溶液與2.0 mL無水乙醇溶液重復(fù)以上步驟，測定值記作A30。按照式（3）計(jì)算DPPH自由基（DPPH·）清除率I3，以VC作為對照，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，并對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.3.3 體內(nèi)抗氧化活性研究

1）動物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 動物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)參考文獻(xiàn)[11~13]實(shí)驗(yàn)方法，并作修改。選取60只5周齡的SPF級雌性小鼠，體質(zhì)量為（20.0±2.0）g，在溫度20～22℃、濕度40%～60%、明暗交替喂養(yǎng)12 h的條件下進(jìn)行喂養(yǎng)，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，將實(shí)驗(yàn)所選取的60只小鼠隨機(jī)分為以下6組：空白對照組、模型對照組、多肽高劑量組、多肽中劑量組、多肽低劑量組、VC對照組?？瞻讓φ战M僅每天皮下注射生理鹽水，其余各組小鼠每天頸部皮下注射D-半乳糖（200 mg/kg）；空白對照組和模型對照組每天灌胃0.2 mL 0.9 g/dL生理鹽水；在每天灌胃0.2 mL 0.9 g/dL生理鹽水的基礎(chǔ)上，分別用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為200、400、800 mg/kg的泥鰍蛋白多肽進(jìn)行灌喂小鼠，分別作為多肽低劑量組、多肽中劑量組和多肽高劑量組；VC對照組每天按300 mg/kg劑量的VC進(jìn)行灌喂。連續(xù)注射、灌胃6周，每周對小鼠進(jìn)行一次體質(zhì)量稱量，以調(diào)整注射量以及灌胃量。

2）樣品采集 參考文獻(xiàn)[14-16]實(shí)驗(yàn)方法，并作修改。實(shí)驗(yàn)期結(jié)束后，禁食不禁水12 h后對小鼠進(jìn)行眼球取血，在4℃、3 500 r/min條件下離心10 min用于制備血清。對小鼠進(jìn)行斷頸處死，取出小鼠肝臟以及心臟，清洗干凈后，稱取適量肝臟組織及心臟組織加入生理鹽水，快速制備質(zhì)量濃度為10 g/mL的組織勻漿，在4℃、3 500 r/min的條件下離心10 min獲取組織上清液。

3）生化指標(biāo)的測定 小鼠的血清、肝臟及心臟中的SOD活性、MDA水平以及GSH-Px活性測定參考試劑盒說明書。

4）肝臟HE染色切片 參照文獻(xiàn)[17-20]對動物組織切片的處理方法，小鼠肝臟組織取樣后放入固定液中完成固定，肝臟HE染色切片制作由揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院完成。

1.4 數(shù)據(jù)處理

本實(shí)驗(yàn)中檢測數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，數(shù)據(jù)分析運(yùn)用SPSS 19.0軟件。運(yùn)用Microsoft Excel 2003軟件繪制統(tǒng)計(jì)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 泥鰍蛋白多肽的體外抗氧化活性研究

2.1.1 泥鰍蛋白多肽對·OH清除能力的影響大量實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明，體外·OH清除能力的強(qiáng)弱能有效反映抗氧化物抗氧化能力[21-22]。以VC作為對照組，測定不同質(zhì)量濃度受測溶液對·OH的清除效果，結(jié)果見圖1。當(dāng)受測溶液質(zhì)量濃度在0.2 mg/mL時，泥鰍蛋白多肽·OH的清除率為33.2%，與VC的·OH的清除率相比差異性顯著；當(dāng)受測溶液質(zhì)量濃度高于1.0 mg/mL時，泥鰍蛋白多肽的·OH清除率與0.2 mg/mL受測溶液的清除率相比顯著提升，達(dá)到59.6%，與同質(zhì)量濃度的VC相比，達(dá)到了其清除率的64.4%。這說明泥鰍蛋白多肽具有一定的清除·OH的能力。

圖1 泥鰍蛋白多肽對·OH清除能力的影響Fig.1 Scavenging effect of the antioxidant activity of the polypeptidet of the loach extract on·OH

2.1.2 泥鰍蛋白多肽對ABTS自由基清除能力的影響清除ABTS自由基的能力是總抗氧化能力的重要體現(xiàn)[23-25]。以VC作為對照組，測定不同質(zhì)量濃度受測溶液對ABTS自由基的清除能力，結(jié)果見圖2。當(dāng)受測溶液質(zhì)量濃度低于0.4 mg/mL時，對ABTS自由基清除率較低且清除率的提升不明顯，其中質(zhì)量濃度在0.4 mg/mL時對ABTS自由基的清除率為16.3%；當(dāng)受測溶液質(zhì)量濃度為0.6 mg/mL時，對ABTS自由基的清除率出現(xiàn)顯著提高，清除率達(dá)到24.9%；當(dāng)受測溶液質(zhì)量濃度達(dá)到1.0 mg/mL時，對ABTS自由基的清除率為41.6%。這表明當(dāng)質(zhì)量濃度在0.2~1.0 mg/mL時，泥鰍蛋白多肽對ABTS自由基的清除能力與VC相比仍然有限。

圖2 泥鰍蛋白多肽對ABTS自由基清除能力的影響Fig.2 Scavenging effect of the antioxidant activity of polypeptide of the loach extract on ABTS

2.1.3 泥鰍蛋白多肽對DPPH·清除能力的影響DPPH·清除率是衡量抗氧化物質(zhì)體外抗氧化能力最為重要的指標(biāo)之一[26-28]。將VC作為對照組，測定不同質(zhì)量濃度受測溶液對DPPH·的清除效果，結(jié)果見圖3。VC的清除率在質(zhì)量濃度達(dá)0.4 mg/mL時，已經(jīng)開始趨于穩(wěn)定，并接近于最大清除率；當(dāng)質(zhì)量濃度處于1.0 mg/mL時VC的清除率高達(dá)91.1%，這說明VC的DPPH·清除率已基本趨于穩(wěn)定并接近清除率的極限。當(dāng)受測溶液的質(zhì)量濃度低于0.2 mg/mL時，DPPH·清除率相對比較低；當(dāng)達(dá)到0.4 mg/mL及以上質(zhì)量濃度時，受測溶液的DPPH·清除率開始呈現(xiàn)出顯著變化；當(dāng)受測溶液質(zhì)量濃度達(dá)到1.0 mg/mL時，DPPH·清除率明顯增高（清除率為55.6%），并出現(xiàn)顯著差異。雖然受測溶液與VC相比DPPH·清除率具有顯著的差異性，但實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明泥鰍蛋白多肽仍具有一定的清除DPPH·的能力。

圖3 泥鰍蛋白多肽對DPPH·清除率的影響Fig.3 Scavenging effect of the antioxidant activity of the polypeptide of the loach extract on DPPH·

2.2 泥鰍蛋白多肽體內(nèi)抗氧化活性分析

2.2.1 泥鰍蛋白多肽對小鼠血清的影響由表1可得，小鼠血清的測定中空白對照組與模型對照組各指標(biāo)均存在極顯著差異。SOD活性的測定中，模型對照組與泥鰍蛋白多肽低劑量組之間具有明顯差異（P<0.05），其中與模型對照組相比，多肽低劑量組SOD活性在數(shù)值上提升了19.2%；而多肽中劑量組與高劑量組之間的差異并不明顯，在數(shù)值與模型對照組相比上分別提升了31.8%和36.6%，這可能是由于泥鰍蛋白多肽對小鼠血清的影響已經(jīng)基本達(dá)到了最大化。結(jié)果表明泥鰍蛋白多肽對小鼠血清SOD活性有影響，并且在800 mg/（kg·d）時接近最佳效果。MDA活性測定中，對比模型對照組，泥鰍蛋白多肽中、高劑量組均能夠有效抑制小鼠血清脂質(zhì)過氧化的發(fā)生，其中泥鰍多肽中劑量組對比模型對照組MDA降低了11.4%，具有顯著降低效果；泥鰍多肽高劑量組則降低了16.2%，具有極顯著降低效果。GSH-Px活性的測定中，泥鰍多肽低、中、高劑量組的活性均顯著高于模型對照組（P<0.05），隨著劑量的增加，活性顯著增強(qiáng)。

表1 泥鰍蛋白多肽對小鼠血清的影響Table 1 Loach polypeptide extracts on mice

2.2.2 泥鰍蛋白多肽對小鼠肝臟的影響受測小鼠肝臟中SOD活性、MDA水平以及GSH-Px活性相關(guān)結(jié)果見表2。肝臟的測定結(jié)果中空白對照組與模型對照組各指標(biāo)均存在顯著差異。SOD活性測定中，模型對照組與多肽低劑量組之間不存在顯著差異（P＞0.05）。在多肽中、高劑量組中可看出隨著泥鰍蛋白多肽質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高SOD活性出現(xiàn)明顯提升（P<0.01），其中多肽高劑量組與模型對照組相比數(shù)值提升了28.1%，說明泥鰍蛋白多肽能夠明顯提升小鼠肝臟中SOD活性，但劑量要達(dá)到一定數(shù)值。MDA活性測定中，泥鰍蛋白多肽的中、高劑量組數(shù)值均明顯低于模型對照組，其中多肽高劑量組有效降低了18.3%，說明泥鰍蛋白多肽能夠顯著的抑制肝臟組織脂質(zhì)過氧化的發(fā)生。與模型對照組相比各劑量組的多肽均能有效提升小鼠肝臟GSH-Px活性，與模型對照組相比較，多肽低、中、高3個劑量組分別提升了40.8%、88.9%、132.2%，并且有很好的劑量效應(yīng)關(guān)系。實(shí)驗(yàn)結(jié)果中的泥鰍蛋白多肽高劑量組能夠顯著提升GSH-Px活性。

表2 泥鰍蛋白多肽對小鼠肝臟的影響Table 2 Loach polypeptide on mice with the effect in the liver

2.2.3 泥鰍蛋白多肽對小鼠心臟的影響受測小鼠心臟中SOD活性、MDA水平以及GSH-Px活性相關(guān)結(jié)果見表3。小鼠心臟的測定結(jié)果中空白對照組與模型對照組的各指標(biāo)均存在顯著差異。SOD活性的測定中，與模型對照組相比，多肽高、中、低3個劑量組均能不同程度地提升SOD活性（分別提升22.3%、12.5%、7.5%），其中多肽中、高劑量組能極顯著提高小鼠心臟組織SOD活性。模型對照組小鼠心臟的MDA水平高于多肽中、高劑量組，多肽中、高劑量組對比模型對照組在MDA水平上分別有效降低了21.1%以及26.2%，這表明泥鰍蛋白多肽能夠在一定程度上減弱心臟組織的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)帶來的致衰效果。GSH-Px活性的測定中，從多肽低劑量組開始與模型對照組之間呈現(xiàn)出上升趨勢，多肽低、中、高3個不同劑量組數(shù)值上分別提升了24.6%、66.9%、92.5%，這表明多肽中、高劑量組能夠有效提升小鼠心臟GSH-Px活性。

表3 泥鰍蛋白多肽對小鼠心臟的影響Table 3 Loach polypeptide on mice with the effect in the heart

2.2.4 泥鰍蛋白多肽對小鼠肝臟組織結(jié)構(gòu)的影響小鼠肝臟組織染色切片（HE染色，200×）如圖4所示。由圖可見，空白對照組中的肝臟細(xì)胞肝索排列有序且肝竇大小正常，細(xì)胞凋亡情況不明顯。模型對照組中肝竇大小出現(xiàn)異常情況，肝索排列混亂，其中出現(xiàn)了明顯的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。不同劑量的泥鰍蛋白多肽組與模型對照組比較可以看出，肝竇擴(kuò)大的情況趨于減少，肝索隨著劑量的增加趨于正常，細(xì)胞凋亡情況有所緩解。這再次表明泥鰍蛋白多肽對減少肝臟因氧化應(yīng)激而產(chǎn)生的損傷具有一定的作用。

圖4 小鼠肝臟組織切片F(xiàn)ig.4 Histopathology of liver

3 結(jié)語

實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)泥鰍蛋白多肽質(zhì)量濃度達(dá)到1.0 mg/mL時，·OH、ABTS自由基和DPPH·清除率分別達(dá)到了59.6%、41.6%以及55.6%。這說明泥鰍蛋白多肽在體外具有有效的清除·OH、ABTS自由基以及DPPH·的能力。體內(nèi)抗氧化實(shí)驗(yàn)中，多肽高劑量組中血清、肝臟、心臟的SOD活性與模型對照組相比分別提升36.6%、28.1%以及22.3%，GSH-Px活性分別提升43.2%、132.2%以及92.5%，MDA水平分別降低了16.2%、18.3%以及26.2%。實(shí)驗(yàn)說明，泥鰍蛋白多肽具有提高小鼠血清、肝臟以及心臟組織SOD活性和GSH-Px活性，同時能夠抑制小鼠MDA水平的作用。肝臟組織切片表明泥鰍蛋白多肽對小鼠肝臟免受因氧化應(yīng)激而產(chǎn)生的損傷具有一定效果。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果對泥鰍蛋白多肽以及其深加工產(chǎn)品提供了參考。