石磊泰 綜述，李玉華，俞永新 審校

中國食品藥品檢定研究院，北京 102629

巴斯德所用的病毒是1882年自牛腦分離的一株狂犬病病毒（rabies virus，RV），經(jīng)馴化后潛伏期變短、毒力減弱，該株病毒被命名為Paris Pasteur［3］。Paris Pasteur株經(jīng)后人不同的傳代適應(yīng)演化出幾個分支［4］，本文僅對其中一個分支PV（Pasteur virus）株在人用狂犬病疫苗中的應(yīng)用及研究回顧作一綜述。

1 來源和歷史

1882年，巴斯德自牛腦分離到1株RV，并將其在家兔腦內(nèi)連續(xù)傳90代。該病毒傳至50代時的潛伏期已由原來的15 d縮短為固定的7 d，且毒力也減弱，稱為固定毒。將感染后7 d發(fā)病的兔脊髓取出，在室溫空氣中干燥后，發(fā)現(xiàn)病毒的毒力很快降低，一般干燥15 d后可完全減毒。巴斯德用干燥減毒的脊髓懸液給狗進(jìn)行皮下免疫，由開始注射無毒的病毒懸液至逐步注射有毒的材料，結(jié)果50多頭經(jīng)免疫的狗均能抵抗腦內(nèi)注射RV的感染［2］。

1882年巴斯德分離到的固定毒一直在兔腦內(nèi)連續(xù)傳代，后續(xù)不同的傳代方式出現(xiàn)了幾個不同的分支，其中PV株出現(xiàn)在大眾視野是在1965年。PV株是1965年從阿根廷的布宜諾斯艾利斯泛美人畜共患病中心獲得的，源于最初的巴斯德病毒，PV株返回法國巴斯德研究所后又進(jìn)行了兔腦內(nèi)系列傳代，命名為PV-11，PV-11又在胎牛腎細(xì)胞傳33代適應(yīng)，后定名為PV株［4］。但PV株從1882—1965年間如何從法國到了南美洲的阿根廷以及中間的傳代歷史已無史料可循［4］，但2021年GOMES［5］公開的一篇報道能提供巴斯德病毒從歐洲到南美洲的一點(diǎn)線索：文中提到，1888年，巴西帝國的皇帝佩德羅二世支持巴斯德在南美洲的巴西里約熱內(nèi)盧開設(shè)巴斯德研究所，最初該研究所只致力于狂犬病疫苗的研發(fā)。此后，巴西的科研人員將RV接種至兔腦內(nèi)，再將發(fā)病的兔子從法國的巴斯德研究所帶到巴西的巴斯德研究所。這是有文獻(xiàn)可查的巴斯德病毒從法國運(yùn)到巴西，但后來如何到阿根廷再無文獻(xiàn)可佐證。

雖然PV株的傳代歷史中有部分時期模糊不清，但WHO狂犬病專家委員會在1972年仍達(dá)成了共識：自巴斯德時代的RV傳代歷史可能已無從考證，但如果近幾年的傳代歷史清楚，也可用于狂犬病疫苗生產(chǎn)［6］。會上PV株還被納入WHO病毒種子目錄清單［7］。2005年，PV株被WHO生物標(biāo)準(zhǔn)化專家委員會納入人用狂犬病疫苗生產(chǎn)用毒種庫［8］。

2 傳代適應(yīng)

2.1 在胎牛腎細(xì)胞上適應(yīng) 法國巴斯德研究所的ATANASIU等［9］在1974年的工作報道中提到，用PV株在胎牛腎細(xì)胞上適應(yīng)并制備了人用狂犬病疫苗，經(jīng)濃縮、純化和滅活后，在法國和少數(shù)幾個國家使用了10多年。

2.2 在BHK21細(xì)胞上適應(yīng) 較早關(guān)于PV株在BHK21細(xì)胞上適應(yīng)傳代的工作報道是法國巴斯德研究所的ERMINE等［10］在1977年開展的。

1988年，巴西布坦坦研究所的CONSALES等［11］在摸索RV在細(xì)胞瓶內(nèi)的最佳培養(yǎng)條件時，使用的就是PV株在BHK21細(xì)胞的適應(yīng)株，該適應(yīng)株為法國巴斯德研究所的Sureau教授所贈。最終，CONSALES等確定用細(xì)胞瓶在BHK21細(xì)胞上培養(yǎng)PV株的最佳培養(yǎng)條件為：感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI）為0.1～1，感染方式為吸附2 h，病毒最佳培養(yǎng)溫度為33℃，最佳pH為7.4～7.6。感染后4、7、10 d收獲的病毒滴度分別為5.38、5和4.23 lgLD50／0.03 mL。

1998年，同樣是巴西布坦坦研究所，GALLINA等［12］為了提高RV的培養(yǎng)規(guī)模和產(chǎn)量，采用生物反應(yīng)器培養(yǎng)病毒。將總量為6.8×108的BHK21細(xì)胞轉(zhuǎn)移至含7.5 g cytodex1微載體的5 L生物反應(yīng)器內(nèi)，36.5℃吸附3 h后，補(bǔ)加L15培養(yǎng)基至3.7 L（牛血清含量8%），繼續(xù)培養(yǎng)3～4 d后，棄去80%的培養(yǎng)基，以0.1～0.8 MOI接種PV株病毒（來源于法國巴斯德研究所），34℃吸附2 h，補(bǔ)加L15培養(yǎng)基至3.7 L（牛血清含量0.3%）。接種病毒后72、96、144、168、240 h，病毒滴度分別為6.98、7.28、6.69、6.18、6.09 lgLD50／mL，一個培養(yǎng)周期可收獲14 000～14 500 mL病毒液。這種培養(yǎng)方式可實現(xiàn)較大規(guī)模生產(chǎn)RV，能滿足當(dāng)時工業(yè)化生產(chǎn)的需要。

高校的開放性管理使校園安全隱患增加了很多社會因素，尤其是復(fù)雜的周邊環(huán)境，很多周邊消費(fèi)場所安全性差，誘導(dǎo)性消費(fèi)因素較多，加之學(xué)生在校外受到的約束較少，很可能出現(xiàn)惡劣事件。與此同時，校園周邊社會人士較多，進(jìn)出校園不受限制，很可能威脅到學(xué)生的人身和財產(chǎn)安全；并且很多高校交通不夠便利，很難確保乘坐周邊出租車的安全；這些社會人員又存在流動性，給管制工作帶來了難度。

2.3 在Vero細(xì)胞上適應(yīng)1983年，PV株在法國巴斯德研究所完成兔腦內(nèi)傳代2 061次后，又在Vero細(xì)胞上連續(xù)傳14代進(jìn)行適應(yīng)，適應(yīng)株命名為L Pasteur 2061／Vero 15 pass，簡稱PV2061［1］。

2001年，巴西布坦坦研究所的FRAZZATIGALLINA等［13］在生物反應(yīng)器內(nèi)用Vero細(xì)胞成功培養(yǎng)RV PV株。所用的Vero細(xì)胞來源于美國模式培養(yǎng)物集存庫（American Type Culture Collection，ATCC），PV株來源于法國巴斯德研究所。Vero細(xì)胞培養(yǎng)至1.6×106個／mL時轉(zhuǎn)移至5 L生物反應(yīng)器，工作體積為3.7 L，內(nèi)含10 g cytodex3微載體，細(xì)胞培養(yǎng)階段用含1%牛血清的培養(yǎng)基。細(xì)胞培養(yǎng)3～4 d后按MOI 0.015加入PV株，培養(yǎng)病毒階段用無血清培養(yǎng)基，感染病毒3 d后開始收獲病毒液，連續(xù)收獲4 d，共收獲12 L病毒液，在未濃縮的情況下病毒滴度可達(dá)5.4～5.66 lgFFD50／mL。

2002年6月，遼寧成大生物股份有限公司（簡稱遼寧成大）從國外引進(jìn)微載體生物反應(yīng)器細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，在大容量生物反應(yīng)器內(nèi)用Vero細(xì)胞成功培養(yǎng)制備RV PV2061株疫苗，商品名為“Speeda”［14-15］。Vero細(xì)胞來源于ATCC，PV2061株來源于美國CDC。Vero細(xì)胞連續(xù)傳代，密度達(dá)（1.0～1.2）×106個／mL時轉(zhuǎn)移至含25 g／L微載體的30 L生物反應(yīng)器內(nèi)，灌流培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)5 d后，密度達(dá)（1.2～1.5）×107個／mL時接種PV株，更換含1%小牛血清的維持液，將反應(yīng)器溫度調(diào)至33～35℃繼續(xù)灌流培養(yǎng)。培養(yǎng)3 d后開始收獲病毒液，可連續(xù)收獲18～22 d。收獲液最高病毒滴度可達(dá)8.5lgLD50／mL，平均滴度為7.6lgLD50／mL。

在印度，有兩家機(jī)構(gòu)開展了PV株在Vero細(xì)胞上適應(yīng)的研究工作。其中印度的巴斯德研究所使用的毒株是PV-11，KUMAR等［16］在2005年的工作報道中使用PV-11株在Vero細(xì)胞上培養(yǎng)狂犬病疫苗，開展柱層析和區(qū)帶離心純化等工藝驗證的比較研究；另一家機(jī)構(gòu)是印度的人用生物制品研究所（Human Biologicals Institute），使用的毒株是PV2061，SAMPATH等［17］2005年報道，在印度用PV2061在Vero細(xì)胞上制備出人用狂犬病疫苗，商品名為“Abhayrab”。

3 基因特性

早在1986—1988年，法國巴斯德研究所的TORDO等［18-20］即對PV株進(jìn)行了測序，所用毒株為PV株在BHK21細(xì)胞的適應(yīng)株。測得PV株的基因全長為11 932個核苷酸，GenBank登錄號為M13215［21］。PV株由3'至5'端依次排列N、M1、M2、G、L5個結(jié)構(gòu)基因，每個基因由3'至5'端的非編碼區(qū)及編碼區(qū)構(gòu)成。其中在N基因的3'端之前有一段先導(dǎo)序列長58個核苷酸，N基因的位置為59～1 482 bp，編碼區(qū)為71～1 423 bp，編碼450個氨基酸；M1基因的位置為1 485～2 475 bp，編碼區(qū)為1 514～2 407 bp，編碼297個氨基酸；M2基因的位置為2 481～3 285 bp，編碼區(qū)為2 496～3 104 bp，編碼202個氨基酸；G基因的位置為3 291～4 964 bp，編碼區(qū)為3 318～4 892 bp，編碼524個氨基酸；L基因的位置為5 388～11 863 bp，編碼區(qū)為5 418～11 846 bp，編碼2 142個氨基酸。N～M1、M1～M2、M2～G、G～L基因間隔分別為2、5、5和423個核苷酸。其中M1基因即為大家熟知的P基因，M2基因即為M基因。

2015年，江蘇先聲衛(wèi)科生物制藥有限公司的科研人員開展了對PV2061株的測序工作［22］，與TORDO等的工作不同的是該P(yáng)V2061株來源于美國CDC，為Vero細(xì)胞適應(yīng)株，所測PV2061株的基因全長為11 932個核苷酸，GenBank登錄號為JX276550［23］。與TORDO等所測的PV株相比，兩個PV株的全長基因同源性為99.8%，兩株病毒的基因位置和編碼區(qū)位置均相同。

4 免疫保護(hù)

4.1 暴露前免疫保護(hù)2005年，印度的SAMPATH等［17］用Abhayrab肌肉注射60名健康志愿者，免疫程序為0、7、21 d各免疫1次，每次0.5 mL，注射部位為三角肌。免疫后14、35、365 d采血檢測中和抗體，14、35、365 d的GMT分別為12.69、18.19和12.26 IU／mL，且接種不良反應(yīng)輕微。

2010年，菲律賓的MAGPANTAY等［24］對從印度引進(jìn)的Abhayrab進(jìn)行安全性和免疫原性研究，與SAMPATH等不同之處在于MAGPANTAY等采用皮內(nèi)注射的方式進(jìn)行免疫，免疫程序為0、7、28 d各免疫1次，每次0.1 mL，注射部位為三角肌區(qū)域。免后14、28 d采血檢測中和抗體，第14和28天后，60名受試者的GMT分別為3.30和4.37 IU／mL。期間僅觀察到少數(shù)輕度不良事件，無中度或重度事件發(fā)生。由 此，SAMPATH等 和MAGPANTAY等 認(rèn) 為，Abhayrab具有較好的免疫原性和安全性。

2006年，國內(nèi)的查力等［25］報告了遼寧成大Speeda狂犬病疫苗的安全性和免疫原性，實驗組502人用Speeda免疫，對照組100人用法國維爾博疫苗免疫，免疫程序均為0、3、7、14、28 d各免疫1針，觀察不良反應(yīng)和免疫效果。首劑免疫后14 d，實驗組與對照組抗體陽轉(zhuǎn)率均為100%，GMT分別為5.2和5.6 IU／mL；第45天，實驗組GMT為9.5 IU／mL，對照組GMT為9.8 IU／mL。所有接種對象均未出現(xiàn)局部和全身強(qiáng)不良反應(yīng)。與法國的維爾博疫苗相比，查力等認(rèn)為Speeda疫苗具有良好的安全性和免疫原性。

2007年，巴西的COSTA等［26］報道了用Vero細(xì)胞生產(chǎn)的PV株人用狂犬病疫苗的免疫原性和安全性。該疫苗由巴西布坦坦研究所用無血清培養(yǎng)基生產(chǎn)［27］，該項研究從2002年開始?xì)v時4年完成，296名志愿者分為兩組：實驗組192人接種該疫苗，對照組104人接種賽諾菲巴斯德公司生產(chǎn)的Vero細(xì)胞疫苗。免疫程序為0、3、7、14和28 d肌肉注射各免疫1次。免后第0、14、38、90天采血檢測RV中和抗體，結(jié)果顯示，第14、38和90天，兩組的GMT均遠(yuǎn)高于0.5 IU／mL，且實驗組GMT高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。但抗體陽轉(zhuǎn)率兩組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。最常見的不良反應(yīng)為注射部位疼痛，且實驗組發(fā)生次數(shù)比對照組多（P＜0.001），但所有不良反應(yīng)均有良好轉(zhuǎn)歸，未見嚴(yán)重不良反應(yīng)發(fā)生。COSTA等認(rèn)為，該疫苗安全性和免疫原性良好。

4.2 暴露后免疫保護(hù)2005年，印度的SAMPATH等［17］關(guān)于Abhayrab的研究中涉及了暴露后免疫評價。按WHO關(guān)于狂犬病診療方案，Ⅱ級暴露受試者75人，Ⅲ級暴露67人，兩組受試者免疫程序相同，均為0、3、7、14、30、90 d各免疫1次，每次0.5 mL，注射部位為三角肌，兩組受試者均不使用狂犬病免疫球蛋白。免后14、35、90和365 d采血檢測中和抗體，Ⅱ級暴露組4 d的GMT分別為13.53、15.03、7.04、4.15 IU／mL，Ⅲ級暴露組4 d的GMT分別為15.78、8.04、9.47、7.82 IU／mL。觀察期內(nèi)受試者的不良反應(yīng)分級為輕微到小，在2年的隨訪期內(nèi)，這兩組受試者無死于狂犬病的病例報告。

2017年，有研究對暴露后受試者采用兩種接種程序：“2-1-1”程序和五針法，接種遼寧成大Speeda狂犬病疫苗以比較兩種免疫程序的安全性和免疫持久性［28］。接種疫苗前采集暴露后受試者血清樣本，接種疫苗后第7、14、42、180、365天分別采集暴露后受試者血清樣本。在整個研究中記錄每次接種疫苗后7 d內(nèi)出現(xiàn)的征集不良反應(yīng)和非征集不良事件，結(jié)果顯示，研究期間無嚴(yán)重不良反應(yīng)報告。雖然“2-1-1”程序在首次接種的不良反應(yīng)發(fā)生率略高于五針法第1和第2次注射，但隨后針次的不良反應(yīng)發(fā)生率在兩種程序中基本相似。在第42天，兩種免疫程序的抗體陽轉(zhuǎn)率均為100%，抗體滴度均超過0.5 IU／mL。在第180和365天，兩組受試者的抗體血清濃度急劇下降，但仍有部分人具有保護(hù)性抗體（分別為75%和50%）。1年后，無實驗室確認(rèn)的瘋?cè)聜茉囌甙l(fā)病，他們在第14和42天陽轉(zhuǎn)率均為100%。Speeda狂犬病疫苗對暴露后受試者無論按“2-1-1”程序或五針法預(yù)防接種后，均有較好的安全性、免疫原性和免疫持久性。

2019年，國內(nèi)有機(jī)構(gòu)評價暴露后使用遼寧成大Speeda“2-1-1”程序肌肉接種狂犬病疫苗的免疫持久性及2劑加強(qiáng)（入組當(dāng)天和第3天各加強(qiáng)免疫1次）免疫效果［29］。選擇曾暴露后按“2-1-1”程序全程接種Speeda狂犬病疫苗后1、2和3年的研究對象314人，進(jìn)行2針加強(qiáng)免疫，加強(qiáng)免疫前、后14 d分別采血檢測IgG抗體，分析使用“2-1-1”程序后1、2、3年及經(jīng)2劑加強(qiáng)免疫后的抗體幾何平均濃度（geometric mean concentration，GMC）和抗體陽性率。結(jié)果暴露后的303人按“2-1-1”程序接種Speeda狂犬病疫苗后1、2和3年的抗體GMC分別為1.33、1.04和0.72 IU／mL，抗體陽性率分別為77.78%、66.67%和55.56%。暴露后的282人經(jīng)2劑加強(qiáng)免疫后，1、2和3年組的抗體GMC分別為16.83、19.37和21.05 IU／mL，加強(qiáng)免疫后抗體GMC均高于加強(qiáng)免疫前（t分別為16.54、13.85和16.02，P均＜0.001）；抗體陽性率分別為100.00%、99.00%和100.00%?？袢”┞逗笫褂谩?-1-1”程序接種Speeda狂犬病疫苗具有良好的免疫持久性，3年內(nèi)2劑次加強(qiáng)免疫后具有較好的免疫應(yīng)答。

5 結(jié)語

狂犬病是一種傳統(tǒng)的人獸共患病，除南極洲外，所有大陸均有發(fā)生，分布在150多個國家和地區(qū)。全球范圍內(nèi)，每年約有2 900多萬人需接受狂犬病暴露后處置和疫苗接種，由狂犬病造成的經(jīng)濟(jì)損失估計為每年86億美元［30］。

但狂犬病是可防可控的，接種疫苗是人類預(yù)防狂犬病最有效的策略。PV株自面世以來，在法國本土［9］、塞爾維亞［31］、伊朗［32］、突尼斯［33］、巴西［26］、印度［17］和中國［14-15］等國家用來生產(chǎn)人用狂犬病疫苗以防控狂犬病疫情，其中遼寧成大Speeda人用狂犬病疫苗年產(chǎn)能可達(dá)1 000萬人份，除在國內(nèi)使用，還出口到泰國、菲律賓和埃及等一帶一路國家［34］。由此可認(rèn)為，PV株在狂犬病防控方面發(fā)揮了一定的作用。但目前狂犬病疫情仍不容樂觀，與WHO 2030年實現(xiàn)狂犬病清零目標(biāo)仍有一定差距［35］，為了實現(xiàn)消除狂犬病，需要團(tuán)結(jié)協(xié)作、共同努力。