釧鴻云，阮朝列，莫明和，王靜，王多義，朱蓮海，劉云璨，廖國陽，周健

1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所 云南 昆明 650118；2.云南大學(xué)省部共建云南生物資源與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650091

Vero細(xì)胞是來源于非洲綠猴腎細(xì)胞的傳代細(xì)胞系，WHO推薦用于人用疫苗的生產(chǎn)［1］，其來源方便、生長速度較快、易于培養(yǎng)、在170代以內(nèi)不致瘤，并可在生物反應(yīng)器中通過微載體和懸浮培養(yǎng)方式進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)［2-3］。微載體細(xì)胞培養(yǎng)法是一種用于培養(yǎng)貼壁依賴性細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)［4］，與單層細(xì)胞培養(yǎng)相比，該方法可為貼壁細(xì)胞提供更大的培養(yǎng)表面積，從而大幅增加細(xì)胞產(chǎn)量，且易于控制，可降低污染風(fēng)險(xiǎn)［5］。無血清培養(yǎng)基加入成分明確的血清替代品，既能滿足細(xì)胞的培養(yǎng)要求，還能提高細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重復(fù)性，穩(wěn)定了批間的質(zhì)量，避免了血清對細(xì)胞的毒性作用和血清源性污染及血清組分對實(shí)驗(yàn)研究的影響，且獲得的細(xì)胞產(chǎn)品易于后續(xù)純化［6-9］。

流感病毒增殖過程中，需要加入TPCK-胰酶使血凝素前體蛋白（haemagluttinin precursor，HA0）裂解后才具有感染性［10］，若培養(yǎng)液中加入血清，會(huì)對TPCK-胰酶產(chǎn)生中和作用，使其無法裂解流感病毒HA0，導(dǎo)致流感病毒對細(xì)胞的感染性降低甚至消失［11］。因此，本研究旨在研發(fā)Vero細(xì)胞生物反應(yīng)器微載體無血清培養(yǎng)流感病毒的相關(guān)技術(shù)，以期用于Vero細(xì)胞流感疫苗的規(guī)?；a(chǎn)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及病毒Vero細(xì)胞P134購自歐洲動(dòng)物細(xì)胞收藏中心（編號：03129010），傳代至P141制成工作細(xì)胞庫，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所生物制品五室保存；H1N1型流感病毒Vero細(xì)胞高產(chǎn)適應(yīng)株A／上海嘉定／SWL1970／2015VA（H1N1）毒種由該室重配并保存。

1.2 主要試劑及儀器ProVero細(xì)胞無血清培養(yǎng)基購自天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司；小牛血清購自北京民海生物科技有限公司；青霉素-鏈霉素溶液、谷氨酰胺溶液、DMEM培養(yǎng)基、TPCK-胰酶及NaHCO3溶液均由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所中心供應(yīng)室配制提供；3 L生物反應(yīng)器購自荷蘭Applicon公司；Countstar細(xì)胞計(jì)數(shù)儀購自上海睿鈺生物科技有限公司。

1.3 溶液配制

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)液 無血清Vero細(xì)胞培養(yǎng)液：以ProVero為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，補(bǔ)加1%青霉素-鏈霉素溶液及2%谷氨酰胺溶液。有血清Vero細(xì)胞培養(yǎng)液：以DMEM為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加10%小牛血清、1%青霉素-鏈霉素溶液、2%谷氨酰胺溶液，用6.6%NaHCO3調(diào)整pH約7.2。

1.3.2 病毒維持液 以ProVero為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加1%青霉素-鏈霉素溶液及2%谷氨酰胺溶液，TPCK-胰酶終濃度1μg／mL，用6.6% NaHCO3調(diào)整pH為7.8～8.0。

1.4 Vero細(xì)胞培養(yǎng)Vero細(xì)胞復(fù)蘇后，采用傳統(tǒng)細(xì)胞培養(yǎng)方式對細(xì)胞擴(kuò)增后，進(jìn)行生物反應(yīng)器培養(yǎng)。將生物反應(yīng)器參數(shù)設(shè)定為：pH 7.2，溫度37℃，溶氧量50%，轉(zhuǎn)數(shù)60 r／min，預(yù)培養(yǎng)約24 h穩(wěn)定后，按1.5×104個(gè)／mL的密度將Vero細(xì)胞接種至生物反應(yīng)器中進(jìn)行微載體培養(yǎng)。其中組1用1 L無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)，補(bǔ)加無血清培養(yǎng)液至1.5 L，培養(yǎng)24 h；補(bǔ)加無血清培養(yǎng)液至2 L，培養(yǎng)24 h；起始培養(yǎng)后5、6、7 d，按1 L／d無血清培養(yǎng)液進(jìn)行灌流培養(yǎng)，每天取樣計(jì)數(shù)。組2用1 L有血清培養(yǎng)液培養(yǎng)Vero細(xì)胞24 h后，更換為無血清培養(yǎng)液1.5 L，培養(yǎng)24 h；補(bǔ)加無血清培養(yǎng)液至2 L，培養(yǎng)24 h；起始培養(yǎng)后5、6、7 d，按1 L／d無血清培養(yǎng)液進(jìn)行灌流培養(yǎng)，每天取樣計(jì)數(shù)。

1.5 H1N1型流感病毒培養(yǎng)及收獲 兩組Vero細(xì)胞培養(yǎng)至7 d，補(bǔ)加病毒維持液500 mL，按MOI=0.1的病毒量將H1N1型流感病毒接種于長滿單層的Vero細(xì)胞，加入1μg／mL的TPCK-胰酶，于pH 7.8，溫度33.0℃，溶氧量25%，轉(zhuǎn)數(shù)60 r／min的條件下吸附1 h；補(bǔ)加病毒維持液至2 L，調(diào)整培養(yǎng)參數(shù)為：pH 7.4，溫度33.0℃，溶氧量25%，轉(zhuǎn)數(shù)60 r／min，進(jìn)行病毒培養(yǎng)。每天取樣，72 h后按每批2 L收獲病毒液，進(jìn)行鏡檢及血凝效價(jià)檢測［11］，試驗(yàn)重復(fù)5次，取血凝效價(jià)幾何平均值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果組間比較采用配對t檢驗(yàn)，病毒效價(jià)組間比較采用方差分析，均以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 微載體上Vero細(xì)胞的生長情況

2.1.1 鏡下觀察 培養(yǎng)6 h后，兩組Vero細(xì)胞均已貼壁，但組1細(xì)胞未進(jìn)入分裂期；組2細(xì)胞形態(tài)已復(fù)原，伸長為梭狀，開始進(jìn)入分裂期。培養(yǎng)至24 h時(shí)，兩組細(xì)胞均已貼壁并呈長梭形貼附于微載體上，開始進(jìn)行細(xì)胞增殖。見圖1。

2.1.2 細(xì)胞計(jì)數(shù)Vero細(xì)胞隨培養(yǎng)時(shí)間的延長，數(shù)量呈上升趨勢，培養(yǎng)7 d時(shí)，組1和組2的細(xì)胞數(shù)分別為（133.4±2.0）×104和（193.8±1.3）×104個(gè)／mL，均明顯高于培養(yǎng)0 d的細(xì)胞數(shù)（t分別為18.470和13.500，P＜0.05）。且培養(yǎng)7 d時(shí)，組1細(xì)胞數(shù)明顯低于組2（t=7.068，P＜0.05）。見圖2。

2.2 H1N1型流感病毒增殖情況

2.2.1 鏡下觀察 培養(yǎng)18～22 h內(nèi)兩組均未見典型的細(xì)胞病變，出現(xiàn)的部分細(xì)胞拉網(wǎng)、脫落情況可能是TPCK-胰酶作用導(dǎo)致的。培養(yǎng)48 h時(shí)，兩組均可見細(xì)胞皺縮、變圓，附著于微載體表面，隨后細(xì)胞破碎脫落，為比較典型的細(xì)胞病變情況；培養(yǎng)至66 h，大部分細(xì)胞已破碎脫落。見圖3。

圖1 不同培養(yǎng)基培養(yǎng)Vero細(xì)胞生長情況的鏡下觀察（×200）Fig.1 Microscopy of growth of Vero cells cultured in different media（×200）

圖2 Vero細(xì)胞生長曲線圖Fig.2 Growth curve of Vero cells

圖3 病毒培養(yǎng)66 h情況的鏡下觀察（×200）Fig.3 Microscopy of virus cultured for 66 h（×200）

2.2.2 效價(jià) 兩組H1N1型流感病毒培養(yǎng)66 h時(shí)的血凝效價(jià)幾何平均數(shù)分別為1∶388和1∶675，組1顯著低于組2（F=4.332，P＜0.05），見表1。均可完全滿足流感病毒裂解疫苗制備的要求。

表1 不同培養(yǎng)方式培養(yǎng)不同時(shí)間病毒的血凝效價(jià)Tab.1 Hemagglutination titers of virus cultured under various conditions for various hours

3 討 論

Vero細(xì)胞培養(yǎng)是一種貼壁培養(yǎng)方式，歷經(jīng)了從實(shí)驗(yàn)室方瓶培養(yǎng)至規(guī)?；D(zhuǎn)瓶培養(yǎng)的發(fā)展過程。為提高其生產(chǎn)效率，實(shí)現(xiàn)Vero細(xì)胞的規(guī)模化生產(chǎn)，需采用微載體進(jìn)行培養(yǎng)［12］。目前，微載體細(xì)胞培養(yǎng)工藝已應(yīng)用于腸道病毒71型、流感病毒、呼腸病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、乙型腦炎病毒、狂犬病病毒、新型冠狀病毒等多種病毒的培養(yǎng)［13-14］。

由于血清成分復(fù)雜，批間差異較大，特別是在發(fā)生人畜共患的突發(fā)性傳染病時(shí)，如使用含有相應(yīng)病原體抗體的血清進(jìn)行相應(yīng)疫苗的研發(fā)和生產(chǎn)時(shí)，會(huì)延長研究和生產(chǎn)的過程，阻礙人類抵抗疾病的進(jìn)展。目前，已上市使用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)Vero細(xì)胞制備的生物制品，主要是通過靜置有血清培養(yǎng)，該培養(yǎng)方式產(chǎn)量受限，不易擴(kuò)大規(guī)模［15-17］。因此，本實(shí)驗(yàn)分別采用無血清和有血清培養(yǎng)基培養(yǎng)Vero細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后，均用無血清灌流培養(yǎng)細(xì)胞至7 d，最終濃度分別為（133.4±2.0）×104和（193.8±1.3）×104個(gè)／mL，前者顯著低于后者（P＜0.05）。根據(jù)細(xì)胞生長曲線選擇細(xì)胞轉(zhuǎn)入平臺期的拐點(diǎn)（7 d）來進(jìn)行H1N1型流感病毒的培養(yǎng)，病毒培養(yǎng)至66 h，兩組病毒的血凝效價(jià)幾何平均數(shù)分別為1∶388和1∶675，前者顯著低于后者（P＜0.05），但均可完全滿足流感病毒裂解疫苗制備的要求。

綜上所述，采用Vero細(xì)胞通過生物反應(yīng)器微載體無血清培養(yǎng)流感病毒具有可行性，本實(shí)驗(yàn)為Vero細(xì)胞流感疫苗的規(guī)?；a(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。課題組今后將對微載體生物反應(yīng)器更大規(guī)模無血清培養(yǎng)Vero細(xì)胞和流感病毒進(jìn)行進(jìn)一步深入研究。