耿一鳴，李婷婷*，勵(lì)建榮,*，謝 晶，林 洪，王 轟，申照華，郭曉華，勞敏軍，周小敏，于建洋

（1.渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心，遼寧 錦州 121013；2.大連民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，遼寧 大連 116600；3.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306；4.中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266100；5.蓬萊京魯漁業(yè)有限公司，山東 煙臺(tái) 265600；6.山東美佳集團(tuán)有限公司，山東 日照 276800；7.浙江興業(yè)集團(tuán)有限公司，浙江 舟山 316120；8.泰祥集團(tuán)榮城泰祥食品股份有限公司，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部冷凍調(diào)理海洋食品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 威海 264309）

微生物是導(dǎo)致食品腐敗的主要因素。微生物在生長(zhǎng)的過(guò)程中，會(huì)分解破壞食品中的碳水化合物、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)成分，并產(chǎn)生對(duì)人體有害的物質(zhì)[1]。嗜冷菌是一類(lèi)菌的總稱(chēng)，其具有獨(dú)特的嗜冷機(jī)制，能在極寒的條件下生存繁殖。熒光假單胞菌為假單胞菌屬嗜冷革蘭氏陰性菌，是最常見(jiàn)的嗜冷菌之一[2-3]。在冷藏及有氧的條件下，熒光假單胞菌會(huì)產(chǎn)生蛋白酶、脂酶等，破壞食品中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，導(dǎo)致食品腐敗[4]。熒光假單胞菌是水產(chǎn)品、蔬菜、肉制品、乳制品的優(yōu)勢(shì)腐敗菌[5-6]。

目前，化學(xué)防腐劑已廣泛應(yīng)用于食品行業(yè)，其可以高效地防止食品被污染，進(jìn)而延長(zhǎng)其保質(zhì)期。然而，長(zhǎng)期使用化學(xué)防腐劑會(huì)增加細(xì)菌的抗藥性，導(dǎo)致一些潛在的副作用[7]。天然防腐劑具有無(wú)毒無(wú)害、抗菌能力強(qiáng)、抗菌譜廣、能夠提升風(fēng)味等特點(diǎn)，因此，尋找替代化學(xué)防腐劑的天然防腐劑現(xiàn)已成為近年來(lái)研究熱點(diǎn)[8]。

精油是一類(lèi)從具有芳香味植物原料中提取的芳香油性液體，由于其具有廣譜抗菌性，被認(rèn)為是天然安全的防腐劑和抗菌劑[9]。茶樹(shù)精油是從互葉白千層的枝葉中提取出來(lái)的一種具有薄荷醇?xì)馕兜臒o(wú)色至淡黃色液體，具有良好的殺菌、殺蟲(chóng)、防腐等特性，在香料、食品工業(yè)、化妝品中廣為應(yīng)用[10-14]。松油烯-4-醇又名4-松油烯醇、4-松油醇、萜品烯，是茶樹(shù)精油的主要有效成分之一，也是多數(shù)植物精油所含的單萜類(lèi)成分，具有抗炎、抗腫瘤等作用，含有胡椒香、陳腐木材的香氣，是用于配制香辛類(lèi)香精的食品用香料[15-16]。近年來(lái)，消費(fèi)者愈來(lái)愈重視食品的品質(zhì)，在運(yùn)輸及貯藏過(guò)程中，使用天然防腐劑取代人工合成的化學(xué)防腐劑已成重點(diǎn)研究方向。前人對(duì)松油烯-4-醇的研究多集中于抗腫瘤抗疾病，對(duì)抑菌活性及機(jī)理報(bào)道尚少[17]?；诖?，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)測(cè)定最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）并繪制抑菌生長(zhǎng)曲線，評(píng)價(jià)松油烯-4-醇對(duì)食品中常見(jiàn)的致腐菌-熒光假單胞菌的抑菌能力；并通過(guò)測(cè)定電導(dǎo)率評(píng)價(jià)了其對(duì)細(xì)胞膜通透性的影響；同時(shí)，利用掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）、二乙酸熒光素（di-O-acetylfluorescein，F(xiàn)DA）染色實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)了其對(duì)細(xì)胞膜完整性的影響；此外，測(cè)定胞外總蛋白含量、DNA含量、胞內(nèi)ATP酶活性、堿性磷酸酶活性，以進(jìn)一步闡明其抑菌機(jī)理。旨在為松油烯-4-醇在食品保鮮領(lǐng)域的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種與試劑

熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）由遼寧省渤海大學(xué)食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保藏，于28 ℃、160 r/min搖床中培養(yǎng)。

松油烯-4-醇（純度98%） 上海邁瑞爾化學(xué)技術(shù)有限公司；LB肉湯培養(yǎng)基、LB營(yíng)養(yǎng)瓊脂 青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；卡那霉素 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；氯化鈉 天津市優(yōu)譜化學(xué)試劑有限公司；鋅片上海邁砷化工有限公司；Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒DNA Maker、瓊脂糖 上海生工生物工程股份有限公司；50×TAE緩沖液、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS） 北京索萊寶生物科技有限公司；超微量ATP酶（Na+、K+）測(cè)試盒、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）測(cè)試盒、總蛋白定量測(cè)定試劑盒 南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-2FD超凈工作臺(tái) 蘇景集團(tuán)蘇州安泰技術(shù)有限公司；立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；LRH系列生化培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司；MS105UD電子分析天平、FE30電導(dǎo)率儀 瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司；PE Victor X3多功能酶標(biāo)儀美國(guó)PerkinElmer公司；Biofuge Stratos冷凍高速離心機(jī)、Sorvall Legend Micro21R臺(tái)式微量離心機(jī) 美國(guó)Thermo Fisher公司；SS-4800場(chǎng)發(fā)射SEM、F7000熒光分光光度計(jì)、E-1045鍍金儀 日本日立公司；GelDoc XR+全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng) 美國(guó)Bio-Rad公司；UV-2550紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 日本島津公司；SCIENTZ-IID超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 松油烯-4-醇對(duì)熒光假單胞菌MIC的確定及抑菌曲線繪制

參考Yang等[18]的方法略作修改，測(cè)定松油烯-4-醇的最小抑菌劑量（minimum inhibitory concentration，MIC）。吸取75 μL培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（107CFU/mL）的熒光假單胞菌菌液于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。再將溶于無(wú)菌去離子水的松油烯-4-醇加入到上述孔中，使松油烯-4-醇的終劑量分別為4、2、1、0.5、0.25 μL/mL。以75 μL質(zhì)量濃度為50 μg/mL的卡那霉素為陽(yáng)性對(duì)照，以等體積的無(wú)菌去離子水為陰性對(duì)照。將96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板放置于28 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，使用酶標(biāo)儀測(cè)定OD595nm。將測(cè)定的結(jié)果進(jìn)行比較，選擇與陽(yáng)性對(duì)照無(wú)明顯差異的濃度作為松油烯-4-醇對(duì)熒光假單胞菌的MIC，每個(gè)樣品進(jìn)行3 次平行實(shí)驗(yàn)。

吸取200 μL培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（107CFU/mL）的熒光假單胞菌菌液于10 mL LB肉湯培養(yǎng)基中，加入松油烯-4-醇使其終劑量分別為1、2、4 MIC，以無(wú)菌去離子水作為空白對(duì)照。在28 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于0、2、4、6、8、10、12、24 h用酶標(biāo)儀測(cè)定OD595nm。

1.3.2 堿性磷酸酶活力的測(cè)定

參考舒慧珍等[19]的方法并略作修改。將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（107CFU/mL）的熒光假單胞菌菌液于4 ℃下8 000 r/min離心10 min，棄上清，菌體重懸于無(wú)菌PBS（pH 7.0）中，重復(fù)離心洗滌3 次，最終重懸于等體積PBS中。加入松油烯-4-醇使其終劑量分別為1、2、4 MIC，并以無(wú)菌去離子水作空白對(duì)照，于搖床中培養(yǎng)4 h。離心棄上清液收集沉淀菌體，加入PBS重懸，用超聲破碎儀在300 W冰水浴中破碎菌體，每次超聲時(shí)間為5 s，間隔10 s，重復(fù)4 次。采用堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）試劑盒測(cè)定細(xì)胞內(nèi)的堿性磷酸酶活力。

1.3.3 熒光假單胞菌胞內(nèi)電導(dǎo)率的測(cè)定

取培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（107CFU/mL）的熒光假單胞菌液，于8 000 r/min離心10 min，吸出上清液，留菌體，用PBS重懸菌體后，以8 000 r/min離心10 min，重復(fù)兩次，最終重懸于PBS。加入溶于無(wú)菌去離子水的松油烯-4-醇，使其終劑量分別為1、2 MIC，以無(wú)菌去離子水作空白對(duì)照。于搖床中培養(yǎng)12 h，每2 h取樣測(cè)其電導(dǎo)率。

1.3.4 熒光假單胞菌細(xì)胞膜通透性的測(cè)定

根據(jù)舒慧珍等[8]的FDA染色方法并略作修改。取培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的熒光假單胞菌菌液（107CFU/mL），離心去上清液并用PBS重懸菌體，加入松油烯-4-醇使其終劑量為1、2、4 MIC，以無(wú)菌去離子水作空白對(duì)照，于搖床培養(yǎng)。分別取培養(yǎng)2、5、8 h的菌懸液6 mL于8 000 r/min離心10 min，吸出上清液，所得到的菌體用PBS重懸3 次，離心后吸出上清液，加入250 μL溶于丙酮的FDA（2 mg/mL），在常溫下靜置20 min，PBS重懸洗滌3 次，離心棄上清液重懸于6 mL的PBS。使用熒光分光光度計(jì)測(cè)定平均熒光強(qiáng)度。熒光分光光度計(jì)激發(fā)波長(zhǎng)297 nm，發(fā)射波長(zhǎng)527 nm，激發(fā)狹縫與發(fā)射狹縫5 nm。

1.3.5 掃描電子顯微鏡觀察松油烯-4-醇處理后熒光假單胞菌形態(tài)

取培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（107CFU/mL）的熒光假單胞菌菌液，加入終劑量為1/2、1、2、4 MIC的松油烯-4-醇，以無(wú)菌去離子水做空白對(duì)照，于搖床中培養(yǎng)6 h。將培養(yǎng)好的菌液放置于離心管中以8 000 r/min離心10 min，吸出上清液，所得到的菌體用PBS重懸洗滌3 次后，每次再以8 000 r/min離心10 min。加入體積分?jǐn)?shù)2.5%的戊二醛，將5 mm×5 mm×1 mm無(wú)菌鋅片放入固定3 h，最后依次用30%、50%、70%、100%的無(wú)水乙醇溶液對(duì)硅片梯度洗脫，每次30 min。鋅片表面噴金后用掃描電鏡觀察表面熒光假單胞菌細(xì)胞的形態(tài)。

1.3.6 熒光假單胞菌細(xì)胞內(nèi)DNA含量的測(cè)定

將熒光假單胞菌培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（107CFU/mL），離心吸出上清液，重懸于PBS中，重復(fù)離心重懸洗滌3 次。加入松油烯-4-醇，使其終劑量為0.5、1、2、3、4 MIC，并以無(wú)菌去離子水作空白對(duì)照，于28 ℃搖床培養(yǎng)3 h。采用Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒提取熒光假單胞菌的基因組DNA，進(jìn)行DNA瓊脂糖凝膠電泳。電壓為90 V，電流為110 mA，電泳時(shí)長(zhǎng)為30 min，電泳完成后，將凝膠放置于全自動(dòng)凝膠成像裝置，拍照并分析結(jié)果。

1.3.7 熒光假單胞菌細(xì)胞內(nèi)總蛋白質(zhì)量濃度的測(cè)定

將熒光假單胞菌培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（107CFU/mL），棄上清液留下層菌體，加入0.85%無(wú)菌生理鹽水重復(fù)離心重懸洗滌兩次，再加入松油烯-4-醇使其終劑量為1、2 MIC，以無(wú)菌去離子水作空白對(duì)照，于搖床中培養(yǎng)。分別取0、3、6、9、12 h的菌懸液離心去上清液留菌體，加入生理鹽水，用超聲破碎儀在300 W冰水浴中破碎菌體，每次超聲時(shí)間為5 s，間隔10 s，重復(fù)4 次并于4 ℃保存。采用總蛋白定量測(cè)定試劑盒得到各組樣品的蛋白質(zhì)量濃度，根據(jù)結(jié)果分析松油烯-4-醇對(duì)熒光假單胞菌細(xì)胞內(nèi)總蛋白質(zhì)量濃度的影響。

1.3.8 熒光假單胞菌細(xì)胞內(nèi)超微量Na+、K+-ATP酶活力的測(cè)定

取培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（107CFU/mL）的熒光假單胞菌菌液，棄上清液并于菌體中加入生理鹽水，重懸兩次后置于生理鹽水中，加入終劑量為1、2 MIC的松油烯-4-醇，以無(wú)菌去離子水作空白對(duì)照，與搖床中培養(yǎng)。取0、3、6、9、12 h菌懸液離心加入生理鹽水重懸3 次，用超聲破碎儀破碎細(xì)胞。采用超微量Na+、K+-ATP酶試劑盒測(cè)定熒光假單胞菌細(xì)胞內(nèi)Na+、K+-ATP酶活力。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。使用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，運(yùn)用Origin 8.5軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 松油烯-4-醇的MIC及其對(duì)熒光假單胞菌時(shí)間抑菌曲線

如圖1所知，不同終劑量的松油烯-4-醇對(duì)熒光假單胞菌均有抑制作用，終劑量為0.25、0.5、1 μL/mL的松油烯-4-醇對(duì)熒光假單胞菌具有輕微的抑制生長(zhǎng)作用。在培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（107CFU/mL）的熒光假單胞菌中加入終劑量為2 μL/mL的松油烯-4-醇培養(yǎng)12 h后，其菌液密度低于等體積終質(zhì)量濃度為50 μg/mL卡那霉素的陽(yáng)性對(duì)照，表明松油烯-4-醇對(duì)熒光假單胞菌的MIC為2 μL/mL。與Kang Shimo等[20]研究的抑菌劑乳糖醛酸相比，松油烯-4-醇對(duì)熒光假單胞菌具有較好的抑菌效果。

圖1 不同劑量的松油烯-4-醇對(duì)熒光假單胞菌抑菌效果Fig.1 Antibacterial effect of terpinene-4-ol at different concentrations on Pseudomonas fluorescens

由圖2可知，加入1、2、4 MIC的松油烯-4-醇在培養(yǎng)2 h后對(duì)熒光假單胞菌的生長(zhǎng)產(chǎn)生了明顯的抑制作用，與空白對(duì)照相比差異較大。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，松油烯-4-醇對(duì)熒光假單胞菌的抑菌能力沒(méi)有變化，表明松油烯-4-醇有較強(qiáng)的抑菌能力，并具有良好的抑菌穩(wěn)定性。

圖2 不同劑量的松油烯-4-醇對(duì)熒光假單胞菌的時(shí)間抑菌曲線Fig.2 Time-inhibition curves of terpinene-4-ol at different concentrations on Pseudomonas fluorescens

2.2 松油烯-4-醇對(duì)熒光假單胞菌細(xì)胞壁的影響

AKP是一種大量存在于微生物中的磷酸水解酶，其在磷酸鹽的代謝中起著無(wú)可替代的作用[21]。AKP存在于細(xì)胞壁與細(xì)胞膜之間，當(dāng)細(xì)胞壁或細(xì)胞膜的完整性遭到損傷，AKP便會(huì)泄露到菌液中，使菌體內(nèi)AKP活力降低。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)測(cè)定松油烯-4-醇對(duì)AKP活力的影響，以反映其對(duì)熒光假單胞菌細(xì)胞壁的損傷情況。如圖3所示，經(jīng)4 h松油烯-4-醇培養(yǎng)后，空白對(duì)照組AKP活力明顯增加；1、2、4 MIC處理組AKP活力下降明顯。結(jié)果表明，0～4 h培養(yǎng)后的空白對(duì)照組菌體生長(zhǎng)，使其胞內(nèi)AKP活力增加；處理組AKP活力隨松油烯-4-醇劑量的增加及培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，表明松油烯-4-醇能有效地破壞熒光假單胞菌的細(xì)胞壁并且可能改變細(xì)胞膜的通透性，使胞內(nèi)AKP活性降低。這與柏梅[22]研究發(fā)現(xiàn)山蒼子精油能夠破壞金黃色葡萄球菌菌體的細(xì)胞壁及細(xì)胞膜，使胞內(nèi)AKP活力被抑制的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相同。

圖3 松油烯-4-醇對(duì)AKP活力的影響Fig.3 Effect of terpinene-4-ol on AKP activity

2.3 松油烯-4-醇對(duì)熒光假單胞菌內(nèi)電導(dǎo)率的影響

當(dāng)抑菌劑作用于菌體后，會(huì)使菌體細(xì)胞膜的通透性增加，導(dǎo)致胞內(nèi)的鉀離子、鈣離子、氫離子等小離子從膜內(nèi)外泄，這些離子會(huì)平衡細(xì)胞的能量狀態(tài)，使菌體進(jìn)行正常運(yùn)動(dòng)，還具有代謝控制、溶質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)等作用[23]；因此，測(cè)定電導(dǎo)率以表征松油烯-4-醇對(duì)熒光假單胞菌細(xì)胞膜的滲透性變化。如圖4所示，在加入松油烯-4-醇后0～6 h，1 MIC與2 MIC處理的熒光假單胞菌電導(dǎo)率迅速增加，明顯高于空白對(duì)照組，且2 MIC樣品的電導(dǎo)率大于1 MIC。表明隨著松油烯-4-醇的劑量增加，其電導(dǎo)率增大，松油烯-4-醇破壞了熒光假單胞菌的細(xì)胞通透性，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)離子外滲；6～12 h，兩種劑量的松油烯-4-醇處理組增長(zhǎng)都趨于平緩，表明松油烯-4-醇能有效改變熒光假單胞菌細(xì)胞膜的通透性，使膜內(nèi)外電導(dǎo)率增加。此結(jié)果與測(cè)定AKP活力得到的結(jié)果都表明松油烯-4-醇能破壞熒光假單胞菌的細(xì)胞壁且改變細(xì)胞膜的通透性。Zhang Yunbin等[24]研究了肉桂精油對(duì)大腸桿菌的抗菌機(jī)制，也發(fā)現(xiàn)加入肉桂精油會(huì)使菌液電導(dǎo)率升高，對(duì)細(xì)胞膜通透性造成影響，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相同。

圖4 不同劑量的松油烯-4-醇對(duì)熒光假單胞菌電導(dǎo)率的影響Fig.4 Effect of terpinene-4-ol at different concentrations on the electrical conductivity of Pseudomonas fluorescens

2.4 松油烯-4-醇對(duì)熒光假單胞菌細(xì)胞膜通透性的影響

FDA是一種本身不發(fā)熒光且不帶電荷的物質(zhì)，因其是脂質(zhì)性小分子，更易透過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞，在胞內(nèi)被非特異性脂酶催化，F(xiàn)DA會(huì)產(chǎn)生黃綠色的熒光素。當(dāng)細(xì)胞膜完整，F(xiàn)DA會(huì)在激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為488 nm和530 nm處被檢測(cè)出；當(dāng)細(xì)胞膜遭到破壞，F(xiàn)DA很快流出細(xì)胞，不能被檢測(cè)到。通過(guò)測(cè)定FDA熒光強(qiáng)度的大小，可反映出細(xì)胞膜的通透性與完整性[25]。如圖5所示，經(jīng)松油烯-4-醇對(duì)熒光假單胞菌處理2 h后，1、2、4 MIC處理組與空白對(duì)照組測(cè)定的熒光強(qiáng)度差異不大，表明經(jīng)松油烯-4-醇處理的熒光假單胞菌的細(xì)胞膜完整性較好，僅細(xì)胞膜通透性有所降低；經(jīng)松油烯-4-醇處理5 h和8 h，1、2、4 MIC處理組熒光強(qiáng)度隨劑量增加及時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，表明從培養(yǎng)5 h起，松油烯-4-醇能大幅增強(qiáng)熒光假單胞菌細(xì)胞膜的通透性，并可能對(duì)細(xì)胞膜產(chǎn)生破壞作用，導(dǎo)致FDA外滲，熒光強(qiáng)度降低。隨著松油烯-4-醇劑量的增加及培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)熒光假單胞菌的損傷程度也越大。

圖5 松油烯-4-醇對(duì)熒光假單胞菌FDA熒光強(qiáng)度的影響Fig.5 Effect of terpinene-4-ol on fluorescence intensity of Pseudomonas fluorescens cells stained with FDA

2.5 松油烯-4-醇對(duì)熒光假單胞菌超微結(jié)構(gòu)的影響

SEM可以更直觀、更清晰地觀察到松油烯-4-醇對(duì)熒光假單胞菌菌體損傷情況。圖6A是正常的熒光假單胞菌（為空白對(duì)照組），其菌體飽滿、完整、且表面光滑的短桿狀形態(tài)；經(jīng)1 MIC與2 MIC的松油烯-4-醇處理后（圖6B、C），菌體表面變得粗糙，細(xì)胞膜均有破裂，2 MIC處理組菌體皺縮塌陷，與1 MIC處理組相比，其細(xì)胞膜破壞程度更為嚴(yán)重；圖6D為4 MIC松油烯-4-醇處理組，其菌體破碎、部分菌體被溶解、細(xì)胞膜幾乎完全破裂。上述結(jié)果表明1、2、4 MIC的松油烯-4-醇處理組能對(duì)熒光假單胞菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜產(chǎn)生不可逆的損壞，且破壞程度隨著松油烯-4-醇劑量增大而增強(qiáng)，細(xì)胞壁及細(xì)胞膜的破壞導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物外泄，菌體干癟并產(chǎn)生皺縮，從而抑制熒光假單胞菌的生長(zhǎng)。植物精油類(lèi)抗菌物質(zhì)，因其疏水性更易作用于細(xì)胞膜，使細(xì)胞膜破損，并增強(qiáng)了細(xì)胞膜的通透性[26]。此結(jié)果與抑菌曲線結(jié)論一致，松油烯-4-醇能夠抑制熒光假單胞菌的生長(zhǎng)。Zhao Yi等[27]用SEM觀察發(fā)現(xiàn)沒(méi)食子酸能改變金黃色葡萄球菌的疏水性，對(duì)細(xì)胞膜造成破壞，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)成分泄露，與本研究結(jié)果相同。

圖6 不同劑量松油烯-4-醇處理對(duì)熒光假單胞菌的SEM圖Fig.6 SEM images of Pseudomonas fluorescens treated with different concentrations of terpinene-4-ol

2.6 松油烯-4-醇對(duì)熒光假單胞菌DNA含量的影響

DNA中含有合成RNA和蛋白質(zhì)所必需的遺傳信息，是生物發(fā)育和正常運(yùn)轉(zhuǎn)所不可或缺的大分子物質(zhì)。DNA含量的減少和損傷導(dǎo)致基因無(wú)法正常表達(dá)，使胞內(nèi)的酶與受體合成受阻，最終導(dǎo)致其衰亡[28]。瓊脂糖凝膠阻滯電泳中的DNA條帶亮度與DNA分子大小成正比，條帶亮度能夠反映DNA含量。如圖7可知，經(jīng)3 h的松油烯-4-醇培養(yǎng)后，空白對(duì)照組的DNA條帶明亮清晰，0.5、1、2、3 MIC處理組的DNA條帶亮度依次隨著松油烯-4-醇的劑量增大而降低，4 MIC處理組檢測(cè)不出熒光假單胞菌的DNA。以上結(jié)果表明松油烯-4-醇能破壞熒光假單胞菌的細(xì)胞膜，使胞內(nèi)DNA泄露，且隨著松油烯-4-醇的劑量增大，對(duì)熒光假單胞菌細(xì)胞膜的破壞也越強(qiáng)，胞內(nèi)剩余的DNA含量越少。此結(jié)果與上文中SEM、電導(dǎo)率、FDA實(shí)驗(yàn)結(jié)果相印證，松油烯-4-醇能夠有效破壞熒光假單胞菌細(xì)胞膜，不僅導(dǎo)致小分子外泄，大分子的DNA也會(huì)隨之泄露出來(lái)。Shen Suxia等[28]研究發(fā)現(xiàn)肉桂醛對(duì)金黃色葡萄球菌產(chǎn)生抑菌作用時(shí)菌體細(xì)胞壁和細(xì)胞膜破裂，內(nèi)部空化，核酸大分子物質(zhì)外滲。

圖7 松油烯-4-醇對(duì)熒光假單胞菌DNA的影響Fig.7 Effect of terpinen-4-ol on DNA of Pseudomonas fluorescens

2.7 松油烯-4-醇對(duì)熒光假單胞菌總蛋白質(zhì)量濃度的影響

蛋白質(zhì)是生命物質(zhì)的基礎(chǔ)，是構(gòu)成細(xì)胞最重要的成分，具有維持細(xì)胞內(nèi)滲透壓、酸堿度、運(yùn)輸代謝物等重要作用，蛋白質(zhì)的降低會(huì)直接影響細(xì)胞的活力[29]。由圖8可知，空白對(duì)照組中隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，熒光假單胞菌代謝繁殖，其胞內(nèi)蛋白質(zhì)量呈現(xiàn)上升趨勢(shì)；經(jīng)1 MIC和2 MIC松油烯-4-醇處理0～3 h的菌體，胞內(nèi)蛋白質(zhì)量濃度迅速降低，此時(shí)松油烯-4-醇對(duì)菌體細(xì)胞膜破壞嚴(yán)重，蛋白質(zhì)大量外滲；3～12 h兩處理組的蛋白質(zhì)量濃度均緩慢下降，可能是0～3 h松油烯-4-醇對(duì)細(xì)胞膜破壞較嚴(yán)重，蛋白質(zhì)已較多泄露所致。測(cè)定結(jié)果表明松油烯-4-醇能大幅度且迅速破壞熒光假單胞菌的細(xì)胞膜，使其通透性增強(qiáng)，導(dǎo)致大分子蛋白質(zhì)泄露，并且隨著松油烯-4-醇的劑量增加，對(duì)細(xì)胞內(nèi)蛋白的含量影響越大，此結(jié)果與SEM、核酸電泳結(jié)果相印證。松油烯-4-醇也可能會(huì)破壞細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的合成，從而影響細(xì)胞的生長(zhǎng)與代謝。Yin Lizi等[29]研究了肉桂醛對(duì)嗜水氣單胞菌的抑菌機(jī)制，表明肉桂醛可以降低細(xì)胞中的蛋白含量，干擾細(xì)胞代謝，影響了細(xì)胞膜的通透性。

圖8 松油烯-4-醇對(duì)熒光假單胞菌總蛋白質(zhì)量濃度的影響Fig.8 Effect of terpinen-4-ol on total protein concentration of Pseudomonas fluorescens

2.8 松油烯-4-醇對(duì)熒光假單胞菌細(xì)胞內(nèi)Na+、K+-ATP酶活力的影響

Na+、K+-ATP酶是一種處于細(xì)胞質(zhì)膜磷脂雙分子層中的蛋白酶，能催化ATP水解為細(xì)胞直接提供能量，在物質(zhì)運(yùn)輸、能量轉(zhuǎn)化、調(diào)節(jié)膜電位及傳遞信息方面具有重要作用，細(xì)胞膜的損傷和重要離子的泄露會(huì)對(duì)細(xì)胞膜相關(guān)的能量轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)產(chǎn)生影響[30]。如圖9所示，空白對(duì)照組0～6 h因熒光假單胞菌的增殖，胞內(nèi)Na+、K+-ATP酶活力增強(qiáng)；1、2 MIC處理組在0～6 h培養(yǎng)后，Na+、K+-ATP酶活力與空白對(duì)照組相比明顯降低，且2 MIC松油烯-4-醇對(duì)熒光假單胞菌Na+、K+-ATP酶抑制能力更為出色。對(duì)測(cè)定結(jié)果分析可知，松油烯-4-醇可能對(duì)熒光假單胞菌細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)有明顯抑制作用，從而阻礙了胞內(nèi)酶的合成，Na+、K+-ATP酶也遭到破壞導(dǎo)致胞內(nèi)ATP不能正常供給能量，最終細(xì)胞凋亡。此結(jié)果與松油烯-4-醇對(duì)胞內(nèi)總蛋白、電導(dǎo)率、核酸電泳的影響結(jié)果相印證，表明松油烯-4-醇能有效破壞熒光假單胞菌細(xì)胞膜的完整性，增加離子的通透性及細(xì)胞內(nèi)Na+、K+-ATP酶的外滲。Sharma等[31]研究表明大蒜精油會(huì)顯著降低蠟狀芽孢桿菌胞內(nèi)ATP的釋放。

圖9 松油烯-4-醇對(duì)熒光假單胞菌Na＋ 、K＋-ATP酶活力的影響Fig.9 Effect of terpinen-4-ol on Na+, K+-ATPase activity in Pseudomonas fluorescens

3 結(jié) 論

天然植物精油類(lèi)物質(zhì)具有安全無(wú)毒、抗菌光譜性強(qiáng)、原料來(lái)源廣泛等特點(diǎn)，作為食品防腐劑日益受到眾多學(xué)者們的關(guān)注[32]。松油烯-4-醇是茶樹(shù)精油的主要有效成分之一，也是多種天然植物精油所含的單萜類(lèi)成分，具有抗腫瘤、抗炎等作用，但對(duì)其抑菌能力報(bào)道尚少。

本研究從細(xì)胞機(jī)制方面探討了松油烯-4-醇對(duì)熒光假單胞菌的抑制作用。本實(shí)驗(yàn)首先確定了松油烯-4-醇對(duì)熒光假單胞菌具有良好的抑菌效果，且明確其MIC為2 μL/mL；由時(shí)間抑菌曲線進(jìn)一步看出松油烯-4-醇可較為迅速地抑制熒光假單胞菌的生長(zhǎng)；AKP活性實(shí)驗(yàn)表明加入松油烯-4-醇能有效破壞菌體細(xì)胞壁，使細(xì)胞膜暴露出來(lái)；電導(dǎo)率測(cè)定結(jié)果證明松油烯-4-醇可以改變細(xì)胞膜的通透性，使胞內(nèi)離子外泄；胞內(nèi)熒光強(qiáng)度測(cè)定結(jié)果證實(shí)松油烯-4-醇能大幅增強(qiáng)細(xì)胞膜的通透性，并可能對(duì)細(xì)胞膜產(chǎn)生破壞作用；SEM觀察到松油烯-4-醇對(duì)細(xì)胞膜造成了不可逆的損傷，大分子的DNA與蛋白質(zhì)會(huì)從細(xì)胞內(nèi)泄露，胞內(nèi)的Na+、K+-ATP酶含量也會(huì)降低，導(dǎo)致ATP無(wú)法正常提供細(xì)胞能量，直接造成細(xì)胞凋亡。