劉美迎，姜軍生，姜乃春，邢迎東，張振文,3,*

（1.濰坊學院，山東 濰坊 261061；2.西北農(nóng)林科技大學葡萄酒學院，陜西 楊凌 712100；3.陜西省葡萄與葡萄酒工程中心，陜西 楊凌 712100）

酚類物質(zhì)是釀酒葡萄的主要次生代謝產(chǎn)物之一，主要分布在葡萄果皮和種子中，其含量和組成受葡萄品種、果實成熟度、栽培措施、氣候、土壤釀酒工藝等多方面因素影響[1-4]。葡萄酒中的酚類物質(zhì)通過浸漬作用由葡萄果實進入葡萄酒中，其含量和比例對葡萄酒的顏色、收斂性、澄清度和穩(wěn)定性等品質(zhì)有著重要的作用[5]。葡萄酒中的酚類物質(zhì)可被分為花色苷和非花色苷兩大類，其中花色苷類物質(zhì)包括花翠素、花青素、甲基花翠素、甲基花青素、二甲花翠素及其衍生物等，而非花色苷類酚類物質(zhì)主要包括黃酮醇類、黃烷醇類、酚酸類及白藜蘆醇等一些特殊的芪類物質(zhì)。酚類物質(zhì)是葡萄酒保健功效的重要組成物質(zhì)，葡萄酒中的多酚物質(zhì)能夠清除人體內(nèi)自由基，降低心腦血管疾病的發(fā)生率，具有抗氧化、抗衰老的功效[6-8]。

乙烯作為五大類植物激素之一，其在植物整個生長發(fā)育過程中參與種子的萌發(fā)，抑制莖和根的伸長，促進果實的成熟、脫落和衰老進程等生理過程[9]。葡萄果實由于其成熟發(fā)育過程中沒有顯著的呼吸躍變和大量乙烯的合成，因而被普遍認定為非呼吸躍變型果實[10]。但近年來眾多研究結(jié)果表明，乙烯對于葡萄果實的成熟和花色苷的積累具有重要作用[11-13]。前人研究發(fā)現(xiàn)葡萄果實在轉(zhuǎn)色前其內(nèi)源乙烯的含量顯著增加[11]，外源乙烯處理能誘導葡萄果實內(nèi)源乙烯含量的增加，促進果實著色，上調(diào)花色苷合成基因的表達，進而促進花色苷含量的增加[14]。本課題組前期研究結(jié)果也表明，外源乙烯利能顯著提高葡萄果皮中總酚、總類黃酮、花色苷和原花色素的含量，并促進VvUFGT、VvMYBA1等花色苷合成基因及VvLAR、VvANR和VvMYBPA1等原花色素合成基因的上調(diào)表達[15]。

乙烯能夠調(diào)控葡萄果實酚類物質(zhì)合成方面的研究已取得一定進展，但在釀酒葡萄栽培技術(shù)中采用田間應用外源乙烯利處理葡萄果實對相應葡萄酒的品質(zhì)，特別是對葡萄酒中酚類物質(zhì)單體組分、含量和比例等方面影響的研究尚不充分。本研究以歐亞種葡萄品種‘赤霞珠’為試材，研究田間應用外源乙烯利處理釀酒葡萄果實后對相應葡萄酒中酚類物質(zhì)的種類、含量和組分的影響，以期更系統(tǒng)地闡明乙烯對葡萄酒品質(zhì)，特別是對葡萄酒酚類物質(zhì)組成方面的影響，為構(gòu)建完善的植物激素乙烯與葡萄和葡萄酒酚類物質(zhì)次生代謝成分之間的網(wǎng)絡關(guān)系提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗用地概況、材料與試劑

本實驗在陜西省涇陽縣瓦窯溝村（34°65′ N、108°75′ E）葡萄園進行，地形為丘陵半丘陵，屬暖溫帶大陸性季風氣候，年平均氣溫13 ℃，年平均降水量548.7 mm，年平均日照時長2 195.2 h，無霜期年平均213 d。

本實驗選用品種為2009年定植的歐亞種（Vitis viniferaL.）釀酒葡萄‘赤霞珠’（Cabernet Sauvignon），自根苗，灌溉方式為滴灌。所有樹形均為單干雙臂整形，籬架，主干高50 cm，東西行向栽培，株行距0.8 m×2.5 m。短梢修剪，果穗數(shù)為每新梢1～2 穗。

乙烯利 上海生工生物工程公司；LALLZYMREX果膠酶 法國Lallemand公司；RC212釀酒酵母法國Lavlin公司；花色苷標準品（花翠素-3-O-葡萄糖苷、花青素-3-O-葡萄糖苷、甲基花翠素-3-O-葡萄糖苷、甲基花青素-3-O-葡萄糖苷、二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷）、黃烷醇標準品（原花色素B1、原花色素B2、原花色素C1、兒茶素、表兒茶素、表棓兒茶素）、黃酮醇標準品（槲皮素及其衍生物、楊梅酮類及其衍生物、山柰酚及其衍生物等）、酚酸類標準品（沒食子酸、原兒茶酸、香草酸、水楊酸、香豆酸、阿魏酸、綠原酸、咖啡酸）美國Sigma-Aldrich公司；甲醇、甲酸、乙腈（均為色譜純）美國Fisher公司；甲醇、甲酸、丙酮、乙酸鈉（均為分析純） 北京化學試劑公司。

1.2 儀器與設備

AUW220D電子天平 日本島津公司；PAL-1型手持折射計 日本愛拓公司；冷凍干燥機 北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；超聲提取器 昆山市超聲儀器有限公司；5804R低溫冷凍離心機 德國Eppendorf公司；R206旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海申生科技有限公司；SHZ-III型循環(huán)水式真空泵 上海亞榮生化儀器廠；1100系列LC/MSD Trap-VL高效液相色譜-離子阱質(zhì)譜聯(lián)用儀（配備G1379A真空溶劑脫氣機、G1312B二元高壓梯度泵、G1313A自動進樣器、G1316A柱溫箱、G1315A二極管陣列檢測器和Zorbax Eclipse SB-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm））、1200系列LC/MSD高效液相色譜-離子阱質(zhì)譜聯(lián)用儀（配備G1379A真空溶劑脫氣機、G1311A四元高壓梯度泵、G1313A自動進樣器、G1316A柱溫箱、G1315A二極管陣列檢測器和ZORBAX SB-C18色譜柱（3 mm×50 mm，1.8 μm）） 美國安捷倫科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 實驗處理與分組

實驗于2013年進行。在果實轉(zhuǎn)色初期（每穗葡萄果實上有5%～10%的果粒出現(xiàn)轉(zhuǎn)色），用400 mg/L的乙烯利（含1 mL/L Tween-80）（ET處理組）或1 mL/L的Tween-80（對照組）浸蘸果穗20 s。處理組和對照組均分別選取連續(xù)3 行葡萄植株作為每組的3 個生物學重復，每個生物學重復中包含20 株隨機選取的長勢一致的健康葡萄植株用于實驗。本實驗供試材料樹體為東西行向，為保證處理組和對照組的葡萄果實樣本受光照程度一致，均選定樹體南向的果穗進行標記并處理。

根據(jù)果實含糖量確定樣品的最終采收期。在接近采收一周前持續(xù)利用PAL-1型手持折射計對擠壓獲得的果汁進行可溶性固形物含量測定，當測量值達到22 °Brix以上且持續(xù)3 d不再變化時對樣品進行采收，采收時按照處理的生物學重復分別采收葡萄并進行單品種的小容器釀造。

小容器釀造參考Jiang Bao等[16]的方法。每個處理選取20 kg左右葡萄原料，剔除爛果青果，手動除梗破碎后，將葡萄果實轉(zhuǎn)入20 L玻璃發(fā)酵罐中，添加亞硫酸至二氧化硫終質(zhì)量濃度為60 mg/L，同時添加果膠酶至終質(zhì)量濃度為30 mg/L并攪拌均勻。浸漬24 h后，加入充分活化的釀酒酵母至終質(zhì)量濃度為200 mg/L。隨后控制在18～25 ℃的環(huán)境下進行酒精發(fā)酵，每天兩次監(jiān)測并記錄比重及溫度，同時在每次監(jiān)測后對葡萄醪進行攪拌以充分浸漬皮渣。整個發(fā)酵過程持續(xù)10 d左右，當比重達到0.993～0.996之間并連續(xù)2 d不再變化時，酒精發(fā)酵結(jié)束，隨后將酒液與皮渣分離并加入終質(zhì)量濃度為50 mg/L的亞硫酸。靜置15 d后去除酒泥，并將葡萄酒裝瓶置于10～15 ℃陳釀12 個月。

1.3.2 葡萄酒指標測定

1.3.2.1 基本理化指標測定

葡萄酒基本理化組分（酒精度、殘?zhí)琴|(zhì)量濃度、可滴定酸質(zhì)量濃度、pH值、揮發(fā)酸質(zhì)量濃度）測定參考GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》進行。

葡萄酒的色度色調(diào)采用CIE Lab法測定[17]。具體流程為酒樣過0.45 μm有機濾膜后測其pH值，然后用與葡萄酒相同pH值磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液稀釋10 倍，以蒸餾水為對照，在紫外-可見分光光度計下，通過2 mm光徑比色皿分別檢測450、520、570、630 nm 4 個波長處的吸光度，并計算L值、C值、a值和b值。其中，L值表示色澤明亮度，與葡萄酒酒體顏色的深淺成反比；C值表示色飽和度，C值越高說明葡萄酒顏色的飽和度越高；a值表示紅色（正值）和綠色（負值）程度；b值表示黃色（正值）和藍色（負值）程度。

1.3.2.2 酚類物質(zhì)的測定

首先取2 mL待測酒樣，離心，經(jīng)過0.45 μm的無機濾膜過濾后上機，采用高效液相色譜-質(zhì)譜技術(shù)進行測定。

花色苷的測定：采用1100系列LC/MSD Trap-VL高效液相色譜-離子阱質(zhì)譜聯(lián)用儀（配有二極管陣列檢測器）進行樣品的定性和定量分析。色譜條件：流動相A：V（甲酸）∶V（乙腈）∶V（去離子水）＝2∶6∶92，流動相B：V（甲酸）∶V（乙腈）∶V（去離子水）＝2∶54∶44。流動相洗脫程序：1～18 min，10%～25% B；18～20 min，25% B；20～30 min，25%～40% B；30～35 min，40%～70% B；35～40 min，70%～100% B。流動相流速為1.0 mL/min；柱溫為50 ℃；檢測波長為525 nm；波長掃描范圍200～900 nm；進樣量為30 μL。質(zhì)譜條件：電噴霧離子源（electron spray ionization，ESI），正離子模式。離子掃描范圍為100～1 500m/z；霧化器壓力為35 psi；干燥氣流速為12 L/min；干燥氣溫度為300 ℃。所有樣品均重復檢測3 次。

非花色苷的測定：采用1200系列LC/MSD高效液相色譜-離子阱質(zhì)譜聯(lián)用儀。色譜條件：流動相A為體積分數(shù)1%乙酸溶液，流動相B為含體積分數(shù)1%乙酸的乙腈溶液。洗脫程序：0～5 min，5%～8% B；5～7 min，8%～12% B；7～12 min，12%～18% B；12.00～17.00 min，18%～22% B；17～19 min，22%～35% B；19～21 min，35%～100% B；21～25 min，100% B；25～27 min，100%～5% B。流速：1.0 mL/min；柱溫：25 ℃；檢測波長：280 nm；波長掃描范圍：200～900 nm；進樣量：2 μL。ESI參數(shù)設置：負離子模式，霧化器壓力為35 psi；干燥器流速為10 L/min；干燥器溫度為325 ℃；誘導碰撞解離（collision-induced dissociation，CID）的MS/MS誘導碰撞電壓為1.00 V；離子掃描范圍為100～1 500m/z。所有樣品均重復檢測3 次。

1.3.2.3 酚類物質(zhì)的定性和定量

花色苷酚類物質(zhì)的定性：參照中國農(nóng)業(yè)大學葡萄與葡萄酒研究中心建立的“葡萄與葡萄酒酒花色苷HPLCUV-MS指紋譜庫”，結(jié)合保留時間對樣品中的花色苷單體物質(zhì)進行定性。

非花色苷酚類物質(zhì)的定性：通過對比標準品的洗脫順序和保留時間，對照分子離子和碎片離子質(zhì)量并參考文獻[18]來確定物質(zhì)的種類。

花色苷和非花色苷酚類物質(zhì)的定量均采用外標法，以酚類物質(zhì)單體標準品為外標物，建立5～500 mg/L之間、9 個水平、3 個重復的標準曲線（R2＞0.999）。實驗樣品中各酚類物質(zhì)單體的質(zhì)量濃度通過標準曲線計算，單位為mg/L。除已有標準品的花色苷單體外，檢測出的其他花色苷類衍生物均以其對應的非修飾花色苷單體的面積比計算其質(zhì)量濃度。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

使用Excel 2010和SPSS 16.0分析軟件進行數(shù)據(jù)處理及顯著性差異T檢驗；利用Rstudio軟件中的matrix計算相關(guān)性矩陣，并采用Corrplot程序包繪制相關(guān)性熱力圖；利用MetaboAnalyst 3.0網(wǎng)頁版（http://www.metaboanalyst.ca/MetaboAnalyst/faces/home.xhtml）進行偏最小二乘法判別分析（partial least squares discriminant analysis，PLSDA）[19]；采用Origin 8.0軟件繪制柱狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩個處理間成熟期葡萄果實和葡萄酒酒樣基本指標和色度色調(diào)比較

葡萄酒的基本理化組成包括葡萄酒的酒精度、pH值及殘?zhí)?、揮發(fā)酸、可滴定酸質(zhì)量濃度。本研究中兩個樣品葡萄酒的基本理化指標如表1所示，結(jié)果顯示兩處理組間殘?zhí)琴|(zhì)量濃度、pH值及可滴定酸質(zhì)量濃度之間差異不顯著，但乙烯利處理的葡萄酒的酒精度和揮發(fā)酸質(zhì)量濃度分別顯著高于和低于對照組，這也進一步表明在釀造葡萄酒之前，乙烯利處理的葡萄果實原料的成熟度高于對照組。

表1 兩個處理間酒樣基本指標和色度色調(diào)比較Table 1 Comparison of physicochemical characteristics of two different wine samples

與對照組相比，乙烯利處理組葡萄酒的紅-綠色調(diào)（a值）、黃-藍色調(diào)（b值）和色度值（C值）更高，即經(jīng)過乙烯利處理的葡萄酒呈現(xiàn)出更加偏向紅色和黃色的色調(diào)，且飽和度更高。而乙烯利處理組葡萄酒亮度（L值）低于對照組，表明乙烯利處理組葡萄酒樣品的明亮度偏低，即顏色比對照組葡萄酒樣品更深。

采收期葡萄果實的基本指標測定結(jié)果如表2所示，乙烯利處理對采收期葡萄果實的單果質(zhì)量、果粒大小（粒徑）、pH值及還原糖的質(zhì)量濃度沒有顯著影響，但能顯著地促進果實可溶性固形物含量的提高，并顯著降低果實的可滴定酸質(zhì)量濃度，且乙烯利處理組的葡萄果實糖酸比也顯著高于對照組。由此可見，外源乙烯利處理可以提高葡萄果實的成熟度。

表2 兩個處理間采收期葡萄果實基本理化指標Table 2 Physicochemical characteristics of harvested grapes with and without ET treatment

2.2 外源乙烯利對赤霞珠葡萄酒花色苷的影響

花色苷酚類物質(zhì)是葡萄與葡萄酒中一類重要的呈色物質(zhì)，能賦予紅葡萄酒鮮艷的顏色，在葡萄酒的抗氧化能力和抗菌、消炎、保健功能等方面具有積極作用[20]。本研究中兩組樣品的葡萄酒中共檢測到30 種花色苷物質(zhì)，包括花翠素、花青素、甲基花翠素、甲基花青素和二甲花翠素的單糖苷及其酰基化衍生物。由表3可見，在不同的花色苷單體中以二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷的質(zhì)量濃度最高，其次為二甲花翠素-3-O-(6-O-乙酰化)葡萄糖苷、甲基花翠素-3-O-(6-O-乙?；?葡萄糖苷、甲基花翠素-3-O-葡萄糖苷和二甲花翠素-3-O-(6-O-反式香豆?；?葡萄糖苷，其余形式的花色苷質(zhì)量濃度均較低。不同樣品間比較發(fā)現(xiàn)，乙烯利處理組葡萄酒樣品的花色苷總質(zhì)量濃度為236.57 mg/L，顯著高于對照組樣品（171.78 mg/L）。不同類型的單體花色苷中，除二甲花翠素、甲基花青素、甲基花翠素的反式香豆?；幕ㄉ諉误w（A3、A9、A15）和花青素、花翠素的乙?；胺词较愣辊；ㄉ眨ˋ20、A21、A26、A27）質(zhì)量濃度在兩樣品間差異不顯著外，其余花色苷單體均表現(xiàn)為乙烯利處理組顯著高于對照組。同時，4-丙酮酸花青素-3-O-葡萄糖苷（A22）和4-丙酮酸花青素-3-O-乙?；咸烟擒眨ˋ23）兩類吡喃型花色苷在兩組葡萄酒樣品中的檢測結(jié)果均為痕量。綜上，乙烯利處理可以提高葡萄酒中大部分單體花色苷質(zhì)量濃度及花色苷的總質(zhì)量濃度。

表3 外源乙烯利對‘赤霞珠’葡萄酒花色苷酚類物質(zhì)的影響Table 3 Effect of exogenous ethophen on the concentrations of individual anthocyanin phenolics in ‘Cabernet Sauvignon’ wine

2.3 外源乙烯利對赤霞珠葡萄酒非花色苷酚的影響

葡萄酒中的非花色苷酚類物質(zhì)主要包括黃酮醇類、黃烷-3-醇類、羥基苯甲酸類、羥基肉桂酸酚酸類及白藜蘆醇等芪類物質(zhì)，對葡萄酒的顏色、苦味、收斂性、澄清度和抗氧化性等方面發(fā)揮著重要作用[21]。本研究從兩個赤霞珠葡萄酒樣品中共檢測到26 種非花色苷酚單體物質(zhì)，結(jié)果如表4所示，兩種葡萄酒樣品中的非花色苷酚類物質(zhì)以兒茶素、表兒茶素和沒食子酸為主，其次是原花色素B1、原花色素B2等黃烷醇類物質(zhì)。樣本間比較結(jié)果顯示，對照組和乙烯利處理組的葡萄酒樣品中的非花色苷酚類物質(zhì)總質(zhì)量濃度分別為97.92 mg/L和105.56 mg/L，乙烯處理組顯著高于對照處理組（P＜0.05）。不同類型的單體非花色苷酚中，表兒茶素、原花色素B1、原花色素C1、楊梅酮-3-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-葡萄糖酸、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、異鼠李亭-3-O-葡萄糖苷、丁香亭-3-O-葡萄糖苷、沒食子酸和香草酸的質(zhì)量濃度均表現(xiàn)為乙烯利處理組顯著高于對照組?？梢?，乙烯利處理可以提高葡萄酒中的大部分單體非花色苷酚物質(zhì)質(zhì)量濃度及非花色苷酚的總質(zhì)量濃度。

表4 外源乙烯利對‘赤霞珠’葡萄酒非花色苷酚類物質(zhì)的影響Table 4 Effect of exogenous ethophen on the concentrations of individual non-anthocyanin phenolics in ‘Cabernet Sauvignon’ wine

2.4 各酚類物質(zhì)單體間的相關(guān)性分析結(jié)果

利用Rstudio軟件繪制酚類物質(zhì)單體質(zhì)量濃度間的相關(guān)性熱力分析圖，如圖1所示。I組中的各單體質(zhì)量濃度兩兩之間具有明顯的正相關(guān)關(guān)系，II組中的各酚類物質(zhì)單體除花青素-3-O-(6-O-乙?；?葡萄糖苷（A20）、花青素-3-O-(6-O-反式香豆?；?葡萄糖苷（A21）、水楊酸（NA21）外，彼此間質(zhì)量濃度也呈顯著的正相關(guān)關(guān)系，但其與I組中的酚類物質(zhì)間則呈現(xiàn)出顯著或極顯著的負相關(guān)性，表明I組與II組中的各酚類物質(zhì)均受到乙烯利處理的影響，但其影響效果不同。同時，在各花色苷單體中，花色苷總質(zhì)量濃度（A31）與二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷（A1）、二甲花翠素-3-O-(6-O-乙?；?葡萄糖苷（A2）質(zhì)量濃度的正相關(guān)系數(shù)最高；在非花色苷單體中，非花色苷物質(zhì)總質(zhì)量濃度（NA27）與沒食子酸質(zhì)量濃度（NA17）的正相關(guān)系數(shù)最高，同時花色苷總質(zhì)量濃度（A31）和非花色苷物質(zhì)總質(zhì)量濃度（NA27）間也具有顯著的正相關(guān)關(guān)系，說明乙烯利處理對葡萄酒中花色苷的總質(zhì)量濃度和非花色苷的總質(zhì)量濃度的影響效果一致，且該影響效果分別與二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷（A1）、二甲花翠素-3-O-(6-O-乙酰化)葡萄糖苷（A2）類花色苷單體和沒食子酸類非花色苷單體物質(zhì)的變化相關(guān)。此外，花青素-3-O-(6-O-乙?；?葡萄糖苷（A20）、花青素-3-O-(6-O-反式香豆酰化)葡萄糖苷（A21）、水楊酸（NA21）與其他單體物質(zhì)質(zhì)量濃度間均沒有明顯的相關(guān)性，說明葡萄酒中上述3 種物質(zhì)的質(zhì)量濃度變化不受乙烯利處理的影響。

2.5 樣品間各酚類物質(zhì)單體的差異倍數(shù)變化分析結(jié)果

為了更大程度地呈現(xiàn)乙烯利處理對單一酚類物質(zhì)單體的影響效果，將兩組數(shù)據(jù)的同一種酚類物質(zhì)質(zhì)量濃度進行差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）的計算（處理組酚類物質(zhì)質(zhì)量濃度與對照組酚類物質(zhì)質(zhì)量濃度之比），結(jié)果如圖2所示。圖中縱坐標log2FC代表差異倍數(shù)的對數(shù)，且縱坐標的正半軸表示處理組與對照組的差異倍數(shù)為正值，乙烯利處理效果為正向影響；反之，縱坐標的負半軸表示處理組與對照組的差異倍數(shù)為負值，乙烯利處理效果則為負向影響。橫坐標代表不同的酚類物質(zhì)，其中4-丙酮酸花青素-3-O-葡萄糖苷（A22）、山柰酚-3-O-半乳糖苷（NA11）、咖啡酸（NA23）等8 類物質(zhì)在兩組數(shù)據(jù)中均只檢測到痕量（表3、4），圖中不另作比較。由圖2可見，能夠被定量的48 種酚類物質(zhì)中有35 種物質(zhì)位于縱坐標的正半軸（同屬于圖1中II組），表明乙烯利處理能提高其在葡萄酒中的質(zhì)量濃度，而其余13 種物質(zhì)位于縱坐標的下半軸（同屬于圖1中I組），受到乙烯利處理的負向影響，這與圖1中I組與II組間單體呈現(xiàn)出顯著負相關(guān)性的分析結(jié)果相一致。此外，F(xiàn)C大于2（即log2FC＞1）的酚類物質(zhì)單體包括原花色素C1（NA6）、4-丙酮酸花翠素-3-O-(6-O-反式香豆酰化)葡萄糖苷（A30）、4-丙酮酸花翠素-3-O-(6-O-乙?；?葡萄糖苷（A29）、異鼠李亭-3-O-葡萄糖苷（NA13）和槲皮素-3-O-葡萄糖苷（NA10），表明乙烯利處理對葡萄酒中的黃烷醇類、黃酮醇類及吡喃型花色苷類物質(zhì)質(zhì)量濃度的提高均具有較大的促進作用。

圖1 酚類物質(zhì)單體質(zhì)量濃度變量間的相關(guān)性分析Fig.1 Correlation analysis of individual phenolics in different treatments

圖2 樣品間各酚類物質(zhì)單體的差異倍數(shù)變化Fig.2 Fold change in concentrations of individual phenolics between two groups

2.6 PLS-DA分析結(jié)果

為明晰葡萄酒中某單一酚類物質(zhì)組分對不同樣本的分類貢獻，本研究進一步對酚類物質(zhì)單體質(zhì)量濃度和總質(zhì)量濃度數(shù)據(jù)建立了PLS-DA模型。在PLS-DA得分圖中（圖3A）可以看出，第一主成分解釋了總變異的98.6%，第二主成分可解釋0.8%的變異，且乙烯利處理組樣品均位于X正半軸，對照組樣品均位于X負半軸，對照組和乙烯利處理組的重復觀察組均分別聚為一類并可被明顯分開，由此可見，乙烯利處理組和對照組間酚類物質(zhì)組分質(zhì)量濃度差異顯著。

為進一步找出對模型結(jié)果分離起貢獻作用的物質(zhì)，得到了PLS-DA模型的投影變量重要性（variable important for the projection，VIP）圖（圖3B），圖中VIP值代表了各單體物質(zhì)對不同組別的貢獻，VIP值越大，該物質(zhì)的質(zhì)量濃度在處理組間的差異越顯著，其對樣本的分類貢獻越大。本研究以VIP值大于1為界限進行篩選，共識別出3 種差異成分，以VIP值大于0.5為界限共識別出6 種差異成分或指標，依次為花色苷酚總質(zhì)量濃度（A31）、二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷（A1）、二甲花翠素-3-O-(6-O-乙?；?葡萄糖苷（A2）、甲基花翠素-3-O-(6-O-乙?；?葡萄糖苷（A14）質(zhì)量濃度以及非花色苷酚總質(zhì)量濃度（NA27）、沒食子酸（NA17）質(zhì)量濃度。因此，花色苷酚中的二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷、二甲花翠素-3-O-(6-O-乙酰化)葡萄糖苷、甲基花翠素-3-O-(6-O-乙酰化)葡萄糖苷和非花色苷酚中的沒食子酸是乙烯利處理組和對照組之間的主要差異成分，且這4 種成分在乙烯利處理組中具有較高的貢獻值，這說明與對照相比，乙烯利處理能提高葡萄酒中二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷、二甲花翠素-3-O-(6-O-乙酰化)葡萄糖苷、甲基花翠素-3-O-(6-O-乙?；?葡萄糖苷類花色苷和沒食子酸類物質(zhì)的質(zhì)量濃度。此外，二甲花翠素-3-O-(6-O-反式香豆?；?葡萄糖苷（A3）、兒茶素（NA5）和表棓兒茶素（NA1）對對照組樣品的貢獻較大，但VIP值較低，表明外源乙烯利處理不利于葡萄酒中香豆?；亩谆ù渌仄咸烟擒疹惢ㄉ蘸蛢翰杷仡惖狞S烷醇類物質(zhì)的積累。

圖3 不同處理組‘赤霞珠’葡萄酒酚類物質(zhì)單體的PLS-DA分析Fig.3 Partial least squares discriminant analysis (PLS-DA) of individual phenolics between different treatments

2.7 外源乙烯利對葡萄酒中不同類別酚類物質(zhì)質(zhì)量濃度和比值的影響

葡萄果實和葡萄酒中的花色苷主要有花翠素、花青素、甲基花翠素、甲基花青素和二甲花翠素5 種主要形式，它們以單糖苷及其?；难苌锏男问酱嬖谟谄咸压ず推咸丫浦小１狙芯績山M酒樣中5 類花色苷質(zhì)量濃度比較結(jié)果如圖4A所示，二甲花翠素類是‘赤霞珠’葡萄酒中質(zhì)量濃度最高的一類花色苷，其次是甲基花翠素類，而質(zhì)量濃度最低的一類花色苷是花青素類。結(jié)果表明，與對照組相比，乙烯利處理顯著提高了葡萄酒中二甲花翠素類、甲基花翠素類和甲基花青素類花色苷的質(zhì)量濃度，花翠素和花青素類花色苷的質(zhì)量濃度也表現(xiàn)為乙烯利處理組高于對照組，但差異不顯著。

根據(jù)葡萄果實中花色苷代謝途徑，花色苷可以分為來源于F3’H途徑的花色苷和來源于F3’5’H途徑的花色苷，來源于F3’H途徑的3’-羥基取代花色苷包括花青素和甲基花青素類的糖苷態(tài)和?；擒諔B(tài)花色苷，來源于F3’5’H途徑的3’5’-羥基取代花色苷，包括花翠素、甲基花翠素和二甲花翠素類的糖苷態(tài)和?；擒諔B(tài)花色苷[22]。如圖4B所示，本研究中3’5’-羥基取代與3’-羥基取代花色苷的比例結(jié)果表明，乙烯利處理的葡萄酒中3’5’/3’-羥基取代花色苷的比例高于對照組，同時甲基化/未甲基化花色苷的比例也表現(xiàn)為乙烯利處理組高于對照組。本研究中葡萄酒花色苷的?；ㄒ阴；拖愣辊；?，按照?；?未?；〈幕ㄉ毡壤M行分析，結(jié)果顯示乙烯利處理組葡萄酒中?；?未?；〈幕ㄉ毡壤缘陀趯φ战M，但差異并不顯著。吡喃花色苷是葡萄酒體重要呈色物質(zhì)中的一種新型花色苷衍生物，基本結(jié)構(gòu)是在5 種基本花色苷或其相應?；ㄉ盏幕A上，與乙醛、丙酮酸等化合物反應形成[23]，其對葡萄酒的橙紅色色調(diào)貢獻較大，具有較高的穩(wěn)定性及良好的色澤特性[24-25]。本研究中檢測到的吡喃型花色苷屬于Vitisin A類吡喃花色苷，即為花色苷單體與丙酮酸反應形成[25]，而乙烯利處理也顯著提高了吡喃/非吡喃花色苷的比例，使得葡萄酒的花色苷具有良好的色澤且穩(wěn)定性增加。

圖4 外源乙烯利對不同類別酚類物質(zhì)質(zhì)量濃度和比值的影響Fig.4 Effect of exogenous ethophen on the contents and ratios of different types of phenolics in wine samples

葡萄酒中的非花色苷酚類物質(zhì)主要分為黃酮醇類、黃烷醇類、羥基苯甲酸類和羥基肉桂酸類4 類，如圖4C所示，除羥基肉桂酸質(zhì)量濃度低于對照組外，乙烯利處理能提高葡萄酒中黃烷醇、黃酮醇和羥基苯甲酸的質(zhì)量濃度，且黃酮醇和羥基苯甲酸類物質(zhì)與對照組間具有顯著差異（P＜0.05）。

非花色苷酚類物質(zhì)的來源也可以分為F3’H途徑和F3’5’H途徑。F3’H途徑中二氫山柰酚可轉(zhuǎn)化為二氫槲皮素，并進一步通過黃酮醇合成酶、無色花色素還原酶和花色素還原酶的催化作用，生成槲皮素、二氫槲皮素、異鼠李亭類黃酮醇和兒茶素、表兒茶素等二羥基黃烷醇，而F3’5’H途徑中二氫山柰酚轉(zhuǎn)化為二氫楊梅素，并通過原花色素合成酶、無色花色素還原酶和花色素還原酶的催化作用生成楊梅酮、二氫楊梅酮、丁香亭類黃酮醇和棓兒茶素、表棓兒茶素等三羥基黃烷醇[26]。本研究中，乙烯利處理組葡萄酒中3’5’/3’-羥基取代的黃烷醇和3’5’/3’-羥基取代的黃酮醇的比例均低于對照組（圖4D），表明外源乙烯利處理使葡萄合成3’5’-羥基取代的非花色苷酚的代謝途徑減少，更多地向合成3’-羥基取代的槲皮素類二羥基黃酮醇和兒茶素、表兒茶素類二羥基黃烷醇的方向流動。

3 討 論

葡萄果實中的酚類物質(zhì)可分為花色苷和非花色苷，除染色品種外，花色苷類物質(zhì)主要在紅色品種的果皮中合成，在葡萄果實成熟過程中，花色苷的合成主要受到光照、溫度、激素等因素的影響[27-28]。前人的研究結(jié)果表明，外源乙烯處理的葡萄果實中具有較高含量的花翠素和花青素類物質(zhì)，而利用乙烯受體抑制劑1-甲基環(huán)丙烯則顯著抑制葡萄果實花色苷含量的積累[11,29-30]；進一步研究證明，外源乙烯處理是通過上調(diào)花色苷合成途徑中的VvCHS、VvUFGT和VvMYBA1等基因的表達來促進花色苷的積累[14-15]。本研究中葡萄酒中的花色苷類物質(zhì)以二甲花翠素和花翠素的單糖苷和乙?；Y(jié)合態(tài)的方式為主，乙烯利處理顯著地提高了葡萄酒中的二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷、二甲花翠素-3-O-(6-O-乙?；?葡萄糖苷、甲基花翠素-3-O-葡萄糖苷、甲基花翠素-3-O-(6-O-乙?；?葡萄糖苷和花色苷的總質(zhì)量濃度，這與前人的研究結(jié)果[11,14,29]一致?；谇捌谘芯恐赋銎咸丫浦谢ㄉ盏目偭颗c飽和度（C值）及紅-綠色調(diào)（a值）呈顯著的正相關(guān)[31]，本研究中乙烯利處理的葡萄酒色度指標a值和C值增加也可能與葡萄酒中花色苷質(zhì)量濃度較高有關(guān)。此外，本實驗中二甲花翠素、甲基花翠素、甲基花青素的反式香豆酰化的花色苷單體和花青素、花翠素的乙?；胺词较愣辊；ㄉ召|(zhì)量濃度則不受乙烯利處理的影響，可能與酰基轉(zhuǎn)移酶基因的表達不受乙烯信號的調(diào)控有關(guān)，但具體作用機制有待進一步研究。

非花色苷酚包括酚酸類、黃酮醇類、黃烷醇類等物質(zhì)，釀酒葡萄果實中黃酮醇類物質(zhì)主要在果皮中合成和積累[32]，黃烷醇類物質(zhì)則主要存在于果皮、果梗和種子中[33]，而酚酸類物質(zhì)則主要貯存在葡萄果肉細胞中[34]。葡萄果實中非花色苷酚類物質(zhì)含量受成熟度、栽培方式、環(huán)境因素如光照和溫度等多種因素的影響[1,28]。前期的研究結(jié)果表明，外源乙烯利處理能夠提高葡萄果皮中原花色素類物質(zhì)的含量[15]。本實驗的葡萄酒中非花色苷酚主要以兒茶素、表兒茶素和沒食子酸等黃烷醇類和羥基苯甲酸類物質(zhì)為主，乙烯利處理顯著提高了葡萄酒中表兒茶素、沒食子酸及非花色苷酚的總質(zhì)量濃度，這與乙烯利處理能夠上調(diào)葡萄果皮中與黃烷醇類物質(zhì)合成有關(guān)的VvLAR1、VvLAR2、VvANR和VMYBPA1等基因表達有關(guān)[16]。酚酸類物質(zhì)與植物的抗逆性有關(guān)，在遭受生物和非生物脅迫時植物體內(nèi)的酚酸類物質(zhì)會大量累積以提高抗逆性[34]，植物體內(nèi)的酚酸類物質(zhì)主要通過苯丙烷代謝途徑生成，來自莽草酸途徑的莽草酸經(jīng)過轉(zhuǎn)氨作用形成苯丙氨酸，隨后在苯丙氨酸解氨酶（L-phenylalanine ammonia-lyase，PAL）、肉桂酸-4-羥化酶（cinnamate-4-hydroxylase，C4H）、香豆酰輔酶A連接酶（4-coumarate-CoA ligase，4CL）等作用下，分別形成反式肉桂酸、香豆酸、阿魏酸等酚酸[35]。有研究表明，乙烯、赤霉素、水楊酸等均能夠誘導PAL、C4H和4CL活性和基因表達水平的增高[34,36-37]，本研究中乙烯利處理顯著促進葡萄酒中沒食子酸質(zhì)量濃度的增高，可能是因為乙烯利通過激活苯丙烷類代謝酶系統(tǒng)的表達，參與了調(diào)控葡萄果實中酚酸類物質(zhì)的合成。

葡萄酒的色度及顏色穩(wěn)定性由花色苷的含量和組成決定，來源于F3’5’H途徑的花翠素、甲基花翠素和二甲花翠素的單糖苷及其?；瓦拎吞擒諔B(tài)類的花色苷屬于3’5’-羥基取代花色苷，與3’-羥基取代花色苷相比具有更多的羥基[38-39]。一般羥基數(shù)量越多，花色苷的藍色色調(diào)越明顯，而甲氧基化越嚴重，花色苷的紅色色調(diào)越明顯，穩(wěn)定性也越強[40]。本研究中，乙烯利處理組葡萄酒中二甲花翠素、甲基花翠素和甲基花青素類花色苷質(zhì)量濃度顯著增加，同時3’5’-羥基化和甲基化花色苷的比例均上升，PLS-DA研究結(jié)果也進一步證明二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷、二甲花翠素-3-O-(6-O-乙?；?葡萄糖苷和甲基花翠素-3-O-(6-O-乙?；?葡萄糖苷3 類物質(zhì)對乙烯利處理組的分類貢獻較大，這說明乙烯利處理能夠使葡萄酒中的花色苷的甲基化水平和羥基化水平增高，這對葡萄酒的紅藍色調(diào)和色澤穩(wěn)定性起到積極作用。Cano-Lopez等指出，吡喃型花色苷對葡萄酒中的紅-黃色色調(diào)的貢獻較大[41]，乙烯利處理后的葡萄酒中吡喃型花色苷的比例顯著上升，進一步表明乙烯利處理使葡萄酒整體的顏色更深，并呈現(xiàn)出更加偏向紅-黃色的表現(xiàn)，這也與葡萄酒的紅綠色調(diào)（a值）和黃藍色調(diào)（b值）上升的研究結(jié)果相一致。

葡萄酒中非花色苷酚類物質(zhì)黃烷醇和黃酮醇物質(zhì)按其羥基化程度不同也可分為3’5’-羥基化取代的三羥基和3’-羥基取代的二羥基黃烷醇或黃酮醇。前人研究結(jié)果指出，兒茶素、表兒茶素類二羥基黃烷醇與棓兒茶素、表棓兒茶素類三羥基黃烷醇相比具有更強的抗氧化能力[42]，同時二羥基黃酮醇中的槲皮素比三羥基黃酮醇中的楊梅酮相比具有更強的清除活性氧自由基的能力[43]。本研究中乙烯利處理后的葡萄酒中3’5’/3’-羥基取代的黃烷醇和3’5’/3’-羥基取代的黃酮醇的比例均低于對照組，表明乙烯利處理后葡萄果實非花色苷酚的代謝途徑向3’的方向流動增加，二羥基黃烷醇與二羥基黃酮醇比例增加，進而使得乙烯利處理的葡萄酒具有更強的抗氧化和活性氧自由基清除能力。

綜上所述，乙烯利處理葡萄果實能提高葡萄酒色度值及紅黃色色調(diào)，并提高葡萄酒中以二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷和二甲花翠素-3-O-(6-O-乙?；?葡萄糖苷為主的大部分單體花色苷及以表兒茶素和沒食子酸為主的大部分單體非花色苷酚質(zhì)量濃度。乙烯利處理能夠提高葡萄酒中3’5’-羥基取代、甲基化和吡喃型花色苷的比例，并提高3’5’-羥基取代的黃烷醇和3’5’-羥基取代的黃酮醇類物質(zhì)的比例。田間應用乙烯利處理的葡萄酒具有較高質(zhì)量濃度的花色苷和非花色苷酚，可被選用于釀酒葡萄的栽培生產(chǎn)中。