黃小霞，張家國，張長峰，俞濤濤，華茂圳，孫崇德，王林波

（1.水產科學國家級實驗教學示范中心（上海海洋大學），上海 201306；2.山東省農產品貯運保鮮技術重點實驗室，山東 濟南 250103；3.國家農產品現(xiàn)代物流工程技術研究中心，山東 濟南 250103；4.山東商業(yè)職業(yè)技術學院，山東 濟南 250103；5.濟南市農業(yè)局水產技術推廣站，山東 濟南 250103）

中國是大豆的發(fā)源地，亦是大豆的主要消耗大國。隨著經濟的發(fā)展，糧食和飼料行業(yè)對大豆的需求不斷加大，國內的大豆產量已滿足不了我國對大豆需求量，因而需要依靠進口大豆來滿足市場的需求。我國應用的大豆約80%以上依靠進口[1]，據(jù)統(tǒng)計，2017年的大豆進口量達9.554×107t[2]，2018年的大豆進口量達8.803×107t。隨著對大豆需求量的增大，大豆進口量隨之升高，達到了全球大豆貿易量的60%，我國已躍升成為全球第一大豆進口國[3]。進口的大豆多以轉基因大豆為主，產地來源于巴西、美國、阿根廷等國家。目前，轉基因大豆是種植范圍最廣、產量最大的轉基因作物品種，其中以抗草甘膦轉基因大豆為主[4]。該大豆1996年獲準進行商業(yè)化種植[4]，隨后得到廣泛的推廣與利用。迄今，抗草甘膦轉基因大豆的商業(yè)化種植已有20余年的歷史，其種植面積亦一直在增長。據(jù)統(tǒng)計，到2016年全球轉基因大豆的種植面積超過8.600×107km2[5]，2018 年達到了 9.590×107km2，相比 1996 年，其種植面積增長了100多倍[6]。超過26個國家/地區(qū)在種植轉基因作物，44個國家/地區(qū)在進口轉基因作物[7]。據(jù)報道，2002年美國約有70%的抗草甘膦轉基因大豆被應用于動物飼料[8]?？梢?，抗草甘膦轉基因大豆在全球范圍內得到了廣泛的種植和利用。

然而，抗草甘膦轉基因大豆的安全性亦一直備受人們的關注。其中，轉基因大豆的營養(yǎng)學評價是評估其安全性的前提和基礎，常常采取“實質等同性”原則與傳統(tǒng)大豆進行營養(yǎng)學評價，若符合該原則，即認為是同等的，也被認為是安全的。最早，“實質等同性”這一概念由世界經濟與合作發(fā)展組織提出，是轉基因作物安全性的評價原則，其目的在于評估轉基因食品與傳統(tǒng)食品的營養(yǎng)成分的區(qū)別，若無區(qū)別則表示該轉基因食品符合這一原則，與傳統(tǒng)食品具有實質等同性[9]。本試驗以抗草甘膦轉基因大豆為研究對象，以非轉基因大豆做對照，分析比較兩者的營養(yǎng)及抗營養(yǎng)因子組分，以評估其是否具有實質等同性，旨在為轉基因大豆的應用及安全性評價提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆（抗草甘膦轉基因大豆為美國進口，非轉基因大豆為中國吉林省產）：山東省飼料工業(yè)有限公司，兩種大豆均使用熒光檢測儀確定大豆的品種。

大豆球蛋白酶聯(lián)免疫吸附測定法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒：上海滬鼎生物科技有限公司。鹽酸、冰乙酸、氫氧化鈉、濃硫酸、石油醚（均為分析純）：天津市科密歐化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

氨基酸自動分析儀（LA8080）：天美（中國）科學儀器有限公司；氣相色譜儀（7980A）、反相高效液相色譜（1260）：安捷倫科技（中國）有限公司；可見分光光度計（TU-1901）：上海元析儀器有限公司；凱氏定氮儀（ALVA）：濟南阿爾瓦儀器有限公司；熒光檢測儀（FD-600）：上海飛測生物科技有限公司。

1.3 檢測指標及方法

1.3.1 常規(guī)營養(yǎng)成分

兩種大豆的水分、灰分（灼燒法）、粗蛋白（凱氏定氮法）、粗脂肪含量分別參照GB/T 6435—2014《飼料中水分的測定》、GB/T 6438—2007《飼料中粗灰分的測定》、GB/T 6432—2018《飼料中粗蛋白的測定》、GB/T 6433—2006《飼料中粗脂肪的測定》檢測。

1.3.2 氨基酸

氨基酸組成及含量參照GB/T 28246—2000《飼料中氨基酸的測定》測定，其中，17種氨基酸含量采用常規(guī)水解法進行檢測；色氨酸含量的檢測采用堿水解法處理，采用反相高效液相色譜（reversed-phase high performance liquid chromatography，RP-HPLC）法測定。

1.3.3 脂肪酸

脂肪酸組成參照GB/T 21514—2008《飼料中脂肪酸含量的測定》測定，樣品前處理完成后進行檢測，計算出各種脂肪酸的占比。

1.3.4 大豆抗營養(yǎng)因子

大豆球蛋白采用大豆球蛋白ELISA試劑盒（酶聯(lián)免疫法）測定；胰蛋白酶抑制因子采用國標GB 5009.224—2016《大豆制品中胰蛋白酶抑制劑活性的測定》測定，用可見分光光度計測定吸光度，據(jù)此計算胰蛋白酶抑制劑的活性。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

所有的試驗數(shù)據(jù)為測定3次數(shù)據(jù)的平均值，采用EXCEL進行處理。

2 結果與分析

2.1 常規(guī)營養(yǎng)成分

抗草甘膦轉基因大豆與非轉基因大豆的常規(guī)成分見表1。

表1 抗草甘膦轉基因大豆與非轉基因大豆的營養(yǎng)組分Table 1 Nutritional components of glyphosate-resistant genetically modified soybeans and non-transgenic soybeans %

由表1結果可以看出，抗草甘膦轉基因大豆水分含量為9.90%，稍低于非轉基因大豆的10.72%，但差異不大；轉基因大豆的粗灰分含量為4.82%，也稍低于非轉基因大豆的5.06%，兩者亦差異不大；轉基因大豆的粗蛋白含量為41.47%，非轉基因大豆為41.76%，兩者基本相同；然而，轉基因大豆粗脂肪含量為19.61%高于非轉基因大豆的18.09%，轉基因大豆比非轉基因大豆高出1.52%。

2.2 氨基酸組成

轉基因大豆和非轉基因大豆氨基酸組成和含量的測定結果見表2。

由表2可知，兩種大豆分別檢測出18種氨基酸。其中，轉基因大豆中酪氨酸含量為1.14%，高于非轉基因大豆的0.95%，其他17種氨基酸含量均低于非轉基因大豆；且轉基因大豆中天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸含量分別為3.53%、5.67%和2.09%，而非轉基因大豆分別為4.03%、6.53%和2.63%，分別比非轉基因大豆低0.50%、0.86%和0.54%。

表2 抗草甘膦轉基因大豆與非轉基因大豆的氨基酸組成Table 2 Amino acid composition of glyphosate-resistant genetically modified soybeans and non-transgenic soybeans %

2.3 脂肪酸組成

采用氣相色譜法測定了抗草甘膦轉基因大豆和非轉基因大豆中脂肪酸含量和組成，結果見表3。

表3 抗草甘膦轉基因大豆與非轉基因大豆的脂肪酸組成Table 3 Fatty acid composition of glyphosate-resistant genetically modified soybeans and non-transgenic soybeans %

從表3可以看出，兩種大豆的脂肪酸種類存在一定的差異，在轉基因大豆中檢測出13種脂肪酸，而在非轉基因大豆中檢測出8種脂肪酸。轉基因大豆中棕櫚酸、硬脂酸和油酸占比分別為18.46%、6.15%、23.86%，分別高出非轉基因大豆5.17%、2.28%、8.19%；而非轉基因大豆中亞油酸和亞麻酸占比分別為55.88%、11.10%，遠高出轉基因大豆12.75%、2.70%。轉基因大豆中飽和脂肪酸占比24.61%，非轉基因大豆中飽和脂肪酸僅占比17.16%，比非轉基因大豆高7.45%；而轉基因大豆不飽和脂肪酸占比75.39%，比非轉基因大豆低7.26%。另外，在轉基因大豆中還檢出了花生酸、花生一烯酸、花生二烯酸、二十二碳酸及二十四碳酸等5種脂肪酸。

2.4 抗營養(yǎng)因子含量

檢測抗草甘膦轉基因大豆與非轉基因大豆的大豆球蛋白與胰蛋白酶抑制因子含量，具體結果見表4。

表4 抗草甘膦轉基因大豆與非轉基因大豆抗營養(yǎng)因子含量Table 4 Anti-nutritional factor content of glyphosate-resistant genetically modified soybeans and non-transgenic soybeans

從表4可知，轉基因大豆中大豆球蛋白平均含量為79.92 g/kg，較非轉基因大豆高出約15.98%。從胰蛋白酶抑制因子測定結果來看，非轉基因大豆中的含量平均為9.52 mg/g，較轉基因大豆高出約23.00%。

3 討論

3.1 抗草甘膦轉基因大豆中營養(yǎng)組分的實質等同性分析

大豆種植過程中常噴灑除草劑——草甘膦，一般是通過干擾雜草中莽草酸的代謝途徑，影響其芳香族氨基酸的合成，從而達到去除雜草的目的[10]，而抗草甘膦轉基因大豆可以在這種環(huán)境中健康生長。種植抗草甘膦轉基因大豆可使產量提高，人力減少，經濟效益可觀[11]，然而，人為導入外源基因可能會導致蛋白質或氨基酸發(fā)生改變。為此，在轉基因大豆的實質等同性研究中，研究人員檢測分析轉基因大豆的營養(yǎng)組分，同非轉基因大豆作對比，若無明顯差異即表示存在實質等同性，如 Padgette 等[12]、Taylor等[13]研究人員通過對比抗草甘膦轉基因大豆與非轉基因大豆的營養(yǎng)成分認為，兩者的蛋白質、氨基酸、脂肪等營養(yǎng)水平相同；朱元招等[14]通過分析對比了抗草甘膦轉基因大豆與非轉基因大豆的多項營養(yǎng)指標，結果表明，兩種大豆的常規(guī)營養(yǎng)成分、氨基酸、脂肪酸等指標均差異不大，具有營養(yǎng)學實質等同性；葉增民等[15]測定的抗草甘膦轉基因大豆的蛋白質、脂肪等組分與非轉基因大豆差異不大，基本相同。以上各研究結果均表示轉基因大豆與非轉基因大豆在營養(yǎng)成分上具有實質等同性。

然而，曹柏營[16]研究認為，抗草甘膦轉基因大豆與非轉基因大豆相比，前者脂肪酸含量較低，但種類無太大差異；Rui等[17]通過測定大豆油的脂肪酸，結果發(fā)現(xiàn)抗草甘膦轉基因大豆中脂肪酸總量較高，高出了非轉基因大豆12.6%；譚建莊[18]發(fā)現(xiàn)抗草甘膦轉基因豆粕的蛋白含量高出非轉基因豆粕2.58%，其中17種氨基酸中（除胱氨酸外），天冬氨酸和亮氨酸顯著高于非轉基因豆粕，其他氨基酸則稍高于非轉基因豆粕；金紅等[19]使用氣相色譜法檢測了大豆的脂肪酸，結果顯示，抗草甘膦轉基因大豆中棕櫚酸與硬脂酸含量較高。本試驗結果與上述結果類似，本試驗中檢測的轉基因大豆與非轉基因大豆結果表示，兩者18種氨基酸種類相同，但含量具有一定的差異，同時轉基因大豆中脂肪酸含量較高，其脂肪酸種類及占比與非轉基因大豆存在一定的差異。由此可見，抗草甘膦轉基因大豆與非轉基因大豆營養(yǎng)組成還具有一定的差異，并不具有實質等同性。但仍需考慮各研究人員選取的轉基因大豆與非轉基因大豆的品種、生長環(huán)境以及在樣品處理方法、測定方法對組分的影響。

3.2 抗草甘膦轉基因大豆中抗營養(yǎng)因子的實質等同性分析

抗營養(yǎng)因子為主要存在于植物中的一類物質，由植物代謝產生，可對動物營養(yǎng)物質的消化、吸收產生抗營養(yǎng)作用。其中，大豆中存在的抗營養(yǎng)因子包括蛋白酶抑制因子、異黃酮、抗原蛋白等物質[20]?？共莞熟⑥D基因大豆中導入的外源基因，會影響大豆莽草酸的代謝途徑，該靶途徑芳香族氨基酸又是黃酮類物質的前體物質[21]，因此，抗草甘膦轉基因大豆可能因為外源基因的轉入導致相關抗營養(yǎng)因子發(fā)生改變。

國內外有關學者對抗草甘膦轉基因大豆中抗營養(yǎng)因子實質等同性進行了研究報道，如，Padgette等[12]研究檢測了大豆的植酸磷、胰蛋白酶抑制因子、脲酶活性和蛋白溶解度等抗營養(yǎng)因子指標，發(fā)現(xiàn)抗草甘膦轉基因大豆與非轉基因大豆的含量沒有差異；Zhou等[22]檢測的異黃酮、凝集素、胰蛋白酶抑制劑等指標亦與親本大豆的接近；朱元招等[14]采用大豆胰蛋白酶抑制因子單克隆抗體試劑盒檢測結果顯示，抗草甘膦轉基因大豆與非轉基因大豆的胰蛋白酶抑制因子含量基本等同。

本試驗結果與上述報道不同，本研究結果顯示，非轉基因大豆中胰蛋白酶抑制因子含量較高，比轉基因大豆高出約23.00%；而且轉基因大豆中大豆球蛋白含量高出非轉基因大豆15.98%。可見，大豆球蛋白與胰蛋白酶抑制因子含量在兩種大豆中存在較大差異。類似的研究，如葉增民等[15]發(fā)現(xiàn)抗草甘膦豆粕中異黃酮平均含量為1.865 6 mg/g，而本土豆粕中異黃酮平均含量為4.783 3 mg/g，兩者差異明顯；曹柏營等[16]發(fā)現(xiàn)抗草甘膦大豆的酚類物質的含量顯著高于非轉基因大豆；金紅等[19]檢測的抗草甘膦轉基因大豆黃酮含量高出非轉基因大豆20.27%～22.65%，總酚含量高出53.49%～105.81%，酚酸含量高出16.12%～29.36%。以上結果均表示，抗草甘膦轉基因大豆的酚類物質、黃酮類等與非轉基因大豆存在較大差異，但在本試驗中未測定這兩類物質。結合上述研究可見，抗草甘膦轉基因大豆的黃酮類、酚類物質、大豆球蛋白、胰蛋白酶抑制因子或許產生變化。因此，抗草甘膦轉基因大豆與非轉基因大豆在抗營養(yǎng)因子含量上亦不具有實質等同性。

4 結論

綜上，抗草甘膦轉基因大豆粗脂肪含量遠高于非轉基因大豆，兩者的氨基酸組成、脂肪酸組成及占比、大豆球蛋白及胰蛋白酶抑制因子含量都存在一定的差異，因此，抗草甘膦轉基因大豆與非轉基因大豆在營養(yǎng)學上不具有實質等同性。