劉春增, 張 夢,3*, 史鵬飛, 郭曉彥, 聶良鵬, 呂玉虎, 凌敬偉, 潘滋亮, 鄭春風(fēng), 李本銀

(1. 河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物營養(yǎng)與資源環(huán)境研究所， 河南 鄭州 450002； 2. 信陽市農(nóng)業(yè)科學(xué)院， 河南 信陽 464000；3. 河南省作物分子育種研究院， 河南 鄭州 450002)

紫云英(Astragalussinicus)是豆科黃耆屬越年生草本植物，是我國南方稻田重要的冬季綠肥，具有培肥地力、降低化肥依賴、提升稻米產(chǎn)量和品質(zhì)的作用[1-2]。隨著我國農(nóng)業(yè)向高質(zhì)量發(fā)展方向邁進，紫云英種植面積逐年增加，對其種子的需求量也隨之增大。報道顯示，氣候條件[3]、播種時期[4]、施肥[5]影響紫云英種子產(chǎn)量。但是作為無限花序豆科作物，紫云英由下而上逐漸開花結(jié)莢[9]，不同枝位花序開花時間相差30天，成熟時間相差20天[3]，最佳收獲期一般在65%～75%莢果成熟時[6]。但受品種和氣候的影響，收獲時紫云英莖稈貪青現(xiàn)象普遍存在，較高的含水率影響紫云英莢果的機械化收割以及莢果脫離分選。此外，紫云英成熟過程中莢果發(fā)生自然脫落，脫落率可達3.3%～24.1%[7]，且主要發(fā)生在底部高成熟度莢果[6]，對繁種產(chǎn)量和質(zhì)量造成嚴重影響。貪青造成機械收割不便、過熟導(dǎo)致莢果損失，已成為紫云英規(guī)?；狈N面臨的技術(shù)問題。

化學(xué)催枯劑已廣泛用于油菜(Brassicanapus)、棉花(Gossypiumherbaceum)、水稻(Oryzasativa)、大豆(Glycinemax)等作物，可有效促進作物成熟，快速降低植株和籽粒水分，降低機械收獲損失[8-9]。王正偉等[11]研究發(fā)現(xiàn)百草枯可加快紫花苜蓿(Medicagosativa)植株干燥脫水過程，而紫花苜蓿種子產(chǎn)量和千粒重并未降低。然而，百草枯因其生物毒性，已在我國全面禁用。目前，敵草快(Diquat)被廣泛用于作物催枯[10]。喬醒等[8]研究發(fā)現(xiàn)，敵草快在油菜上脫水效果顯著，殘留量符合國家安全標準。紫云英作為豆科綠肥作物，花莢及種子性狀是否受催枯劑影響，后茬作物萌發(fā)生長對殘留敵草快的敏感性尚不清楚，制約了敵草快作為催枯劑在綠肥種子生產(chǎn)中的應(yīng)用。本研究通過在紫云英成熟期人工噴施不同濃度敵草快，連續(xù)測定不同部位莖稈含水率及莢果性狀，分析了敵草快的催枯效應(yīng)及對其產(chǎn)量的影響，檢測了不同器官敵草快殘留量并以紫云英和水稻種子為受體測定了環(huán)境毒理學(xué)參數(shù)，旨在為紫云英種子生產(chǎn)中催枯劑的施用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗地點及材料

研究地點位于河南省信陽市平橋區(qū)信陽市農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗示范基地(32°14′ N，114°13′ E，海拔60 m)，該地屬亞熱帶向暖溫帶過渡區(qū)，年均日照1 900～2 000 h；年平均氣溫15℃，降雨量1 060 mm；土壤系黃褐土發(fā)育而成的水稻土，pH值6.6，有機質(zhì)含量10.7 g·kg-1，全氮含量1.04 g·kg-1，速效磷含量14.1 mg·kg-1，速效鉀含量60.4 mg·kg-1。試驗以紫云英品種‘信紫1號’為研究對象，敵草快(山東三農(nóng)生物科技有限公司，測定其有效成分含量為200 g·L-1)為催枯劑。于2019年9月30日進行紫云英播種，播種量22.5 kg·hm-2，以225 kg·hm-2過磷酸鈣為基肥，后期不追施其他肥料，管理同當?shù)爻Ｒ?guī)。

1.2 試驗設(shè)計

于2020年5月8日(此時75%莖枝結(jié)莢、25%莖枝開花)上午10∶00—11∶00，進行敵草快葉面噴施。依據(jù)敵草快有效成分濃度設(shè)置3個處理(20 g·L-1(High)、10 g·L-1(Median)和5 g·L-1(Low))，以葉面噴施清水為對照(CK)，各處理3次重復(fù)，每小區(qū)(5 m×6 m)噴施處理溶液或?qū)φ账芤? L，處理后6 h內(nèi)未下雨。

1.3 植株含水率測定

于處理后第2 d和第6 d的8∶00—9∶00在各小區(qū)隨機采集植株樣品10株，依據(jù)莖節(jié)位置由下而上選取第1至第3節(jié)位(底部，Lower)、第3至第5節(jié)位(中部，Middle)以及第5節(jié)位以上(頂部，Upper)莖稈，稱取鮮重后，80℃烘干2 d，稱取干重，計算含水率。

1.4 莢果性狀調(diào)查

于敵草快處理后第0，1，2，4，6 d的7∶00—9∶00，在試驗小區(qū)內(nèi)隨機選取1 m×1 m樣方，貼近地面手工收割地上部，運回室內(nèi)進行莢果性狀調(diào)查。由下而上依據(jù)著生部位分別采集第1～2，3～4及5以上枝位莢果，以花序為單元，進行成熟度分級、記錄單位面積各類花莢的總花序數(shù)(包括莢果)。根據(jù)前期研究結(jié)果[6]，對紫云英莢果成熟度分級辦法進行簡化：黑色莢果賦值為4，灰色莢果賦值為3，綠色莢果賦值為2，花賦值為1，進行分類并賦值，根據(jù)賦值和莢果個數(shù)計算調(diào)查單位面積的莢果成熟指數(shù)。將收集的莢果充分散開后自然晾干，至果皮指壓即碎時(含水量10%左右)信封分裝，稱取花莢總重，脫粒后測定種子產(chǎn)量及千粒重。

1.5 敵草快殘留及毒理學(xué)測定

于處理后第6 d各小區(qū)隨機采集紫云英10株，莢果、莖分別干冰保存送至農(nóng)業(yè)部油料及制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心(武漢)，采用氣相色譜法[12]對其進行敵草快農(nóng)藥殘留檢測。以紫云英種子和水稻種子為受體，在收獲當年10月進行敵草快的毒理學(xué)生物測試：配制10-5～104mg·L-1敵草快水溶液，于雙層濾紙培養(yǎng)皿(90 mm)中均勻撒入30粒水稻種子或50粒紫云英種子，加入5 mL敵草快待測水溶液并封口，重復(fù)5次，以去離子水為對照，20℃暗培養(yǎng)。基于去離子水培養(yǎng)預(yù)實驗結(jié)果，在培養(yǎng)后第2，4，6 d測定發(fā)芽率，第7 d利用數(shù)碼相機對水稻、紫云英幼苗拍照并進行水稻胚根長、胚芽鞘長以及紫云英幼苗株高圖像測量。其中水稻胚根長為萌發(fā)生長出根系的總長，紫云英株高則為子葉至根尖的長度。

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2013和SPSS 18軟件進行數(shù)據(jù)錄入和統(tǒng)計分析，多因素方差分析采用SPSS內(nèi)嵌的通用線性模型(GLM法)，多重比較(Post Hoc Multiple Comparison)分別采用Scheffé法(樣本量不同，毒理學(xué)測試中的幼苗性狀)和Turkey HSD法(樣本量相同，含水率、莢果性狀、敵草快殘留量)，在P<0.05水平下檢查差異顯著性。利用ImageJ軟件測定所有發(fā)芽水稻胚根長、胚芽鞘長以及紫云英幼苗株高。種子相對發(fā)芽率計算如下：

式中，Gt為處理受體發(fā)芽率，G0為對照受體發(fā)芽率。

成熟指數(shù)，表示某一時期枝位的莢果成熟水平[6]，計算方法如下：

式中，Iij為第i天第j枝位的莢果成熟指數(shù)，n為成熟等級值(詳見1.4部分)，Pn為對應(yīng)成熟度莢果在該時期該枝位上莢果數(shù)量的占比，以百分數(shù)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 施用敵草快對植株含水率的影響

敵草快處理后紫云英莖稈含水率顯著下降，不同部位響應(yīng)敏感性存在差異(表1)。處理后第2 d，紫云英底部和中部莖稈含水率在各處理間無顯著差異，高濃度敵草快處理下頂部莖稈的含水率顯著低于對照(P<0.05)，降幅達13.1%。第6 d，敵草快處理紫云英底部、中部、頂部莖稈含水率均顯著低于對照(P<0.05)，降幅分別達22.7%～29.4%，41.3%～45.9%，42.58%～44.13%，底部含水率降幅低于中部和頂部。值得注意的是，第2 d和第6 d對照莖稈含水率并未顯著下降，說明敵草快催枯效果顯著，但在處理后第6 d 3個濃度敵草快處理下植株莖稈含水率無顯著差異。

表1 敵草快處理后不同時期紫云英莖稈含水率Table 1 Moisture content of Astragalus sinicus stem at different periods after diquat treatments 單位：%

2.2 施用敵草快對紫云英莢果性狀的影響

調(diào)查時期、敵草快濃度、枝位對莢果性狀具有顯著作用(表2)。試驗期間(0～6 d)紫云英總花序數(shù)、花莢總重?zé)o顯著變化，而種子產(chǎn)量、千粒重、成熟指數(shù)顯著升高(P<0.05)；紫云英總花序數(shù)、花莢總重及種子產(chǎn)量受敵草快處理顯著影響(P<0.05)，呈現(xiàn)隨敵草快濃度升高逐漸降低的趨勢；結(jié)莢枝位對總花序數(shù)、花莢總重、種子產(chǎn)量、千粒重、成熟指數(shù)均有影響(P<0.05)，底部性狀最優(yōu)。對上述3個因子交互效應(yīng)分析發(fā)現(xiàn)，敵草快處理并未與時期、枝位產(chǎn)生交互效應(yīng)，噴施中高濃度的敵草快水溶液會造成花莢脫落及籽粒顯著減少，但并未加速莢果成熟。

表2 敵草快處理后紫云英花莢及產(chǎn)量性狀Table 2 Flowers-pods and yield characters of Astragalus sinicus after diquat treatments

2.3 敵草快對莢果的催枯特征

敵草快主要作用于紫云英幼嫩部分或綠色器官。如圖1所示，花序及成熟度較低的莢果(圖1中2～3號)經(jīng)過敵草快處理后，呈枯黃萎縮狀，莢果明顯脫水，與正常成熟脫水莢果存在明顯差別。但達到成熟的莢果(圖1中1號)顏色為黑色或棕色，外觀受敵草快作用不明顯，莢果中籽粒飽滿。

圖1 敵草快對紫云英花莢的催枯特征Fig.1 Characteristics of the flower-pods of Astragalus sinicus after diquat application注：圖中數(shù)字顯示成熟度，其中1為成熟、2為綠色未成熟莢果、3為花序。照片拍攝于施藥后第6 dNote：1 for mature,2 for green un-mature,3 for flowers. The photos were taken on the 6th day after application

2.4 敵草快殘留量

處理6 d后，莢果中敵草快殘留量高于莖，隨處理濃度升高而逐漸升高(圖2)。其中，高濃度處理紫云英莢果中敵草快殘留量達2.34 μg·g-1，莖殘留0.42 μg·g-1，顯著高于中濃度處理(0.70 μg·g-1和0.16 μg·g-1)和低濃度處理(0.05 μg·g-1和0.01 μg·g-1)及對照的敵草快殘留量(P<0.05)。對照莢果中亦檢測出0.026 μg·g-1殘留，推測施藥過程敵草快飄散，造成了污染。

圖2 紫云英莖和莢果的敵草快殘留量Fig.2 Residue amount of diquat in stems and pods注：圖中誤差項為均值±標準誤。不同小寫字母者表示差異顯著(P<0.05)Note：Error bar indicated mean±SE. Different letters indicated significant difference between levels at the 0.05 level

2.5 敵草快生物毒性評價

以紫云英及后茬作物水稻種子作為受體，評價敵草快生物毒性。研究發(fā)現(xiàn)，受體相對發(fā)芽率隨敵草快濃度升高呈“S”型特征變化(圖3)。在敵草快濃度為1 000～10 000 mg·L-1時，敵草快完全抑制水稻和紫云英發(fā)芽；在敵草快濃度為0.1～100 mg·L-1時，水稻發(fā)芽率隨敵草快濃度降低而逐漸升高，當敵草快濃度≤0.1 mg·L-1時，相對發(fā)芽率高于100%；紫云英種子相對發(fā)芽率則在敵草快濃度為10～100 mg·L-1逐漸升高，敵草快濃度≤10 mg·L-1時，相對發(fā)芽率高于100%。敵草快濃度對幼苗生長存在顯著影響(表3)。當敵草快濃度≥1 mg·L-1時，水稻胚芽鞘生長受到顯著抑制，濃度≥0.1 mg·L-1時，水稻胚根受到顯著抑制；而紫云英則在敵草快濃度≥10 mg·L-1時生長受到顯著抑制。綜合發(fā)芽率和幼苗生長情況，水稻對于敵草快的敏感性高于紫云英，其安全閾值為0.01 mg·L-1，紫云英則為1 mg·L-1。

圖3 不同濃度敵草快對水稻(a)和紫云英(b)種子發(fā)芽率的影響Fig.3 Germination response of Oryza sativa (a) and Astragalus sinicus (b) seeds to diquat注：圖中誤差項為均值±標準誤。對照水稻種子第4 d和第6 d的絕對發(fā)芽率分別為60.0%和77.0%，紫云英種子第2 d和第4 d的絕對發(fā)芽率分別為63.5%和75.4%Note：Error bar indicated mean±SE. The absolute germination rate of Oryza sativa seeds at 4 d and 6 d were 60.0% and 77.0%,the absolute germination rate of Astragalus sinicus seeds at 2 d and 4 d were 63.5% and 75.4%

表3 不同濃度敵草快對水稻和紫云英幼苗生長的影響Table 3 Effects of diquat on seedling growth of Oryza sativa (a) and Astragalus sinicus

3 討論

3.1 噴施敵草快對紫云英的催枯作用

本研究中，敵草快施用6 d后，紫云英中部和頂部莖稈含水率下降至30%～40%，底部下降至54%～61%，顯著低于對照(75%～83%)，敵草快顯著降低了紫云英莖稈含水率。有報道顯示敵草快具有催熟的效果。喬醒等[8]研究發(fā)現(xiàn)，施用敵草快后3～4 d，油菜角果皮逐漸變?yōu)楹稚?，而對照角果在?～6 d才開始變黃，但其催熟作用主要表現(xiàn)在中上部角果上。本研究采用成熟指數(shù)[6]表征紫云英莢果顏色變化，發(fā)現(xiàn)敵草快處理并未顯著影響莢果成熟度(表2)，與喬醒等[8]研究不同，原因可能是紫云英正常成熟過程莢果呈“綠—褐—黑”，敵草快處理6 d內(nèi)綠色莢果逐漸枯黃，枯黃色未在成熟指數(shù)指標體系，因此施用敵草快未影響紫云英整體的成熟指數(shù)。但是，不同部位莖稈脫水速率存在差異，表現(xiàn)為頂部>中部>底部，原因可能是敵草快為聯(lián)吡啶類傳導(dǎo)性觸殺滅生性除草劑，通過植物綠色組織吸收[10，13]，而噴施條件下頂部綠色組織截留更多敵草快藥劑，導(dǎo)致葉片、綠色莖稈等活性組織結(jié)構(gòu)破壞，植株對于水分的結(jié)合能力、主動傳導(dǎo)能力降低，水分大量散失；底部則由于接觸較少的敵草快，加之近地面相互遮蔽不利于水分散失，所以脫水速率較低。紫云英黑色莢果在噴施敵草快后并未受到影響(圖1)，而花序和綠色莢果則在施藥后均呈現(xiàn)非正常脫水的枯黃色。據(jù)此可見，噴施敵草快主要作用于紫云英幼嫩器官，對植株頂部的作用效果強于底部，高濃度敵草快則加速器官脫水過程。

3.2 過量敵草快對紫云英種子產(chǎn)量的影響

施用催枯劑可以加速植株脫水，便于機械收獲。研究發(fā)現(xiàn)，大豆、棉花、苜蓿的莖稈的剪切強度和拉伸強度與含水率密切相關(guān)[14-16]。因此，脫水催枯可提高作物收割效能，便于籽粒收獲和保存。油菜在噴施敵草快6 d后，角果和籽粒含水量分別下降52.66%和24.84%，而油菜籽千粒重及品質(zhì)均未產(chǎn)生顯著差異[8]。本研究中，噴施高濃度敵草快顯著降低了紫云英總花莢數(shù)、莢果總重和種子產(chǎn)量，但未對千粒重產(chǎn)生顯著影響(表2)。由于敵草快是傳導(dǎo)性觸殺滅生性除草劑，可迅速被綠色植物組織吸收，通過干擾植物細胞膜、破壞光合作用而快速發(fā)揮效果[10，13]。據(jù)此推測，高濃度敵草快一方面降低了花莢數(shù)量(頂部新生莢果死亡、底部成熟莢果脫落)，造成籽粒供給能力不足；另一方面，器官快速脫水造成未成熟莢果籽粒受損，結(jié)實率下降[17]。此外，低濃度敵草快處理下，紫云英總花莢數(shù)、莢果總重和種子產(chǎn)量均未受顯著影響，原因既可能是花莢與莖對敵草快敏感度存在差異，又可能是頂部存在截留效應(yīng)使中下部莢果脫水速率適中未造成明顯的落莢損失。由于紫云英在成熟過程中，80%以上的種子產(chǎn)量來源于中下部莢果[6]，因此，雖然頂部尚有花序及幼嫩莢果，若選擇恰當時期噴施適當濃度催枯劑(敵草快)，可實現(xiàn)紫云英種子“穩(wěn)產(chǎn)提質(zhì)”。

3.3 敵草快在紫云英種子生長中的應(yīng)用風(fēng)險

敵草快毒性較低，但仍然具有生態(tài)學(xué)毒性風(fēng)險。楊亞哲等[18]測定了敵草快對水藻的毒性，其中對羊角月芽藻(Selenastrumcapricornutum)的 72 h的半數(shù)效應(yīng)濃度為 3.16×10-2mg·L-1，對大型溞(Daphniamagna)48 h的半數(shù)效應(yīng)濃度為 1.18×10-2mg·L-1。成云峰等[19]對敵草快生態(tài)毒性進行了研究，發(fā)現(xiàn)敵草快對蜜蜂(Apismellifera)、蚯蚓(Eiseniafetida)、斑馬魚(Brachydaniorerio)低毒，而對家蠶(Bombyxmori)、日本鵪鶉(Coturnixjaponica)、大型溞中毒。紫云英主要在稻田種植擴繁，因此施用敵草快危害的主要受體作物應(yīng)是紫云英和水稻。本研究中，敵草快對于水稻和紫云英發(fā)芽及幼苗生長的抑制效應(yīng)呈“S”型，高濃度抑制效應(yīng)顯著。水稻種子萌發(fā)對于敵草快的半數(shù)效應(yīng)濃度為1～10 mg·L-1，紫云英種子萌發(fā)對于敵草快的半數(shù)效應(yīng)濃度為10～100 mg·L-1，兩者敏感性顯著低于藻類[17]，與魚類和蜜蜂相似[19]。敵草快對于水稻和紫云英種子屬于低毒性[20]。然而，高濃度處理莢果中敵草快殘留量達2.34 μg·g-1，莖殘留0.42 μg·g-1，以200 g·m-2莢果和300 g·m-2莖葉計算[6]，單位面積敵草快殘留為0.59 mg·m-2，假設(shè)20 mm降水條件敵草快完全洗脫(實際上應(yīng)無法完全洗脫，若紫云英翻壓為水田，水量應(yīng)遠高于20 mm)濃度為0.295 mg·L-1，中濃度和低濃度處理則為0.064 mg·L-1和0.006 mg·L-1，由于水稻和紫云英對于敵草快的安全閾值分別為 0.01 mg·L-1和1 mg·L-1(圖3和表3)，因此可以確定低濃度敵草快的施用對水稻生產(chǎn)是安全的，而紫云英種子在3個處理下均是安全的。若考慮敵草快在稻田的漂移，依據(jù)對不同生物的半致死濃度，低濃度敵草快施用對水藻、大型溞、家蠶、蜜蜂、魚類也具有安全性[18-19]。

4 結(jié)論

敵草快能夠顯著降低成熟期紫云英莖稈含水率，施用6 d后紫云英中部和頂部莖稈含水率下降至30%～40%，底部下降至54%～61%，可以滿足機械化收割需要。但是，高濃度(20 g·L-1)敵草快處理顯著降低紫云英總花莢數(shù)、莢果總重，影響種子產(chǎn)量；而施用中高濃度(≥10 g·L-1)敵草快，紫云英莖稈殘留的敵草快對于水稻具有一定毒害風(fēng)險。綜合考慮脫水效果、莢果性狀和產(chǎn)量、殘留及對受體的毒性情況，噴施低濃度(5 g·L-1)敵草快適用于紫云英種子生產(chǎn)，殘留不足以影響水稻接茬。