張玉琳， 楊寒珺， 李超程， 張凡凡*， 馬春暉*

(1. 石河子大學(xué)動物科技學(xué)院， 新疆 石河子 832000；2. 新疆科構(gòu)生物科技有限公司， 新疆 石河子 832000)

雜交構(gòu)樹(Broussonetiapapyrifera)是?？茦?gòu)樹屬的一種多年生木本植物，是由中國科學(xué)院植物研究所通過雜交育種技術(shù)開發(fā)的具有突出抗逆性及多用途的速生新品種[1]。雜交構(gòu)樹莖、葉粗蛋白質(zhì)含量較高(20%以上)，且富含鈣和各類氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)[2]，將其用作飼料可在一定程度上緩解“人畜爭糧”的矛盾，且可以豐富地區(qū)飼草資源，彌補目前我國蛋白質(zhì)飼料短缺。當(dāng)前，雜交構(gòu)樹全株的利用方式主要為調(diào)制青貯飼料。大量研究證實，經(jīng)青貯發(fā)酵能夠有效減緩雜交構(gòu)樹營養(yǎng)物質(zhì)的流失，軟化木質(zhì)素或植物纖維，改善其適口性，提高家畜對飼料營養(yǎng)成分的消化率[3-5]。

理想的青貯飼料在發(fā)酵過程中，主要由乳酸菌主導(dǎo)，乳酸菌能有效調(diào)節(jié)青貯原料微生物區(qū)系，進而改善青貯的發(fā)酵進程，確保青貯飼料營養(yǎng)成分的保存；而這一過程中，不同乳酸菌類型、數(shù)量、活性、多樣性等均會影響青貯飼料的發(fā)酵品質(zhì)[6-8]，因此明確主導(dǎo)青貯發(fā)酵的乳酸菌對于青貯的調(diào)制是十分必要的。研究表明，乳酸菌在青貯體系中需盡快增殖占據(jù)支配地位，其數(shù)量必須達(dá)到105cfu·g-1FW以上[9-10]；而雜交構(gòu)樹原料表面附著乳酸菌數(shù)量較少(<105cfu·g-1FW)[11]，因此為確保青貯飼料的發(fā)酵品質(zhì)，需要外源添加優(yōu)良乳酸菌菌種。乳酸菌根據(jù)其發(fā)酵葡萄糖的形式可分為同質(zhì)型和異質(zhì)型。同質(zhì)型乳酸菌主要通過糖酵解途徑產(chǎn)生乳酸，青貯中如植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)、乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)、戊糖片球菌(Pedococcuspentosaceus)等同質(zhì)型乳酸菌在發(fā)酵過程中能夠迅速積累大量乳酸，從而降低發(fā)酵體系內(nèi)的pH值，且能夠有效降低乙醇和氨態(tài)氮的含量，并提高乳酸和乙酸的比值[12-13]。異質(zhì)型乳酸菌基本都是通過磷酸解酮酶途徑產(chǎn)生乳酸、乙酸等，其不僅比同質(zhì)型發(fā)酵產(chǎn)酸能力差，且發(fā)酵過程中會產(chǎn)生CO2，增加了營養(yǎng)物質(zhì)的損失。青貯中如布氏乳桿菌(Lactobacillusbuchneri)、發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillusfermentum)等異質(zhì)型乳酸菌，雖然轉(zhuǎn)化乳酸的效率較差，且消耗青貯飼料中的營養(yǎng)物質(zhì)較多，但其產(chǎn)生的乙酸等揮發(fā)性脂肪酸能有效抑制霉菌的生長，且可通過提高青貯飼料的有氧穩(wěn)定性以彌補潛在的營養(yǎng)損失[12-13]。因此，鑒于二者的優(yōu)勢有所不同，兩類乳酸菌在青貯中往往聯(lián)合使用[6-7]。然而，并不是任何條件下乳酸菌劑都可以發(fā)揮作用，且沒有一種菌劑被認(rèn)為是絕對有效的[14]，當(dāng)青貯原料的可溶性碳水化合物、干物質(zhì)含量達(dá)不到要求，或添加的菌株不能在原料上生長繁殖時，菌株均不能在青貯發(fā)酵體系中建立優(yōu)勢，其應(yīng)有效果也得不到體現(xiàn)。因此，鑒于乳酸菌特性及適應(yīng)環(huán)境的不同，需要設(shè)定不同營養(yǎng)條件，以確保其在不同發(fā)酵原料上的作用[15]。

為研制適應(yīng)不同青貯原料的乳酸菌青貯制劑，近年來有關(guān)牧草中天然附著乳酸菌分離鑒定及其在青貯飼料中應(yīng)用的研究諸多，其中不乏從不同的牧草原料中篩選出耐低溫、耐鹽、產(chǎn)酸能力強的乳酸菌[16-18]。而縱觀以往研究發(fā)現(xiàn)，關(guān)于雜交構(gòu)樹的研究主要集中在外源添加乳酸菌改善青貯品質(zhì)和家畜生產(chǎn)性能等方面[1-5,11]，其原料表面附著優(yōu)勢乳酸菌情況尚不明確。因此，本試驗以雜交構(gòu)樹青貯為原料，對其附著的乳酸菌進行了分離鑒定，以篩選出適合雜交構(gòu)樹青貯用的優(yōu)良乳酸菌菌株，為雜交構(gòu)樹專用化菌劑的研發(fā)提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 青貯飼料樣品

雜交構(gòu)樹(雜交構(gòu)樹‘201’)種植于新疆維吾爾自治區(qū)石河子地區(qū)143團雜交構(gòu)樹種植示范基地(44°52′ N，85°50′ E；海拔335 m)，待株高長至1.5 m左右，于2020年9月22日利用青飼料收獲機全株收割，將原料短切至1～2 cm，采用裹包青貯法調(diào)制成青貯，裹包密度500 kg·m-3，裹包規(guī)格半徑50 cm，高100 cm，裹包膜厚度0.1 mm，裹包層數(shù)8～10層，置于18℃～23℃條件下發(fā)酵60 d后取樣(隨機挑選5包中的原料)，進行乳酸菌的分離鑒定。

1.2 乳酸菌的分離與純化

每包均取制作的青貯20 g，分別裝于有180 mL無菌生理鹽水的錐形瓶中密封，置于搖床上以120 r·min-1搖動2 h(37℃)，取出后靜置。在超凈工作臺中，用無菌生理鹽水進行梯度稀釋，取四個適宜梯度(10-5，10-6，10-7，10-8)涂板，每個梯度2個重復(fù)，采用涂布平板法，在MRS，M17培養(yǎng)基(含有碳酸鈣)中37℃厭氧培養(yǎng)48～72 h。之后，觀察菌落形態(tài)、大小、顏色、光澤，選擇有溶鈣圈的典型菌落進行革蘭氏染色、油鏡鏡檢及過氧化氫酶觸試驗。凡是革蘭氏染色陽性、過氧化氫酶陰性的菌株均初步認(rèn)定為乳酸菌，分別在MRS，M17培養(yǎng)基上以劃線的方式(四區(qū)劃線法)分離純化培養(yǎng)2～3次。用MRS和M17液體培養(yǎng)基富集(30℃，24 h)，與等體積的甘油混合，封裝，—80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 乳酸菌的鑒定

1.3.1生理生化鑒定 根據(jù)菌株的鏡檢結(jié)果可將其初步區(qū)分乳酸桿菌和乳酸球菌，將保存?zhèn)溆玫娜樗峋昊罨?4 h，參照凌代文[19]和劉慧[20]的方法進行乳酸菌生理生化特性鑒定，以3%的接種量將乳酸菌菌懸液接入MRS，M17液體培養(yǎng)基中，分別在4，10，30，45℃不同溫度條件下培養(yǎng)，其中4℃下培養(yǎng)10 d，10℃和30℃下培養(yǎng)3 d，45℃下培養(yǎng)7 d，觀察乳酸菌菌株的生長情況。分別在pH值為3.0，3.5，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0及含有3.0%和6.5% NaCl的MRS,M17液體培養(yǎng)基中30℃培養(yǎng)48 h，觀察乳酸菌菌株的耐酸能力和耐鹽能力。采用細(xì)菌微量生化鑒定管(由青島海博生物科技有限公司提供)檢測乳酸菌對18種碳源的利用情況。

1.3.2乳酸菌的16S rDNA序列測定 將純化后的乳酸菌培養(yǎng)液按試劑盒說明提取各菌株DNA，DNA提取試劑盒由北京全式金生物技術(shù)有限公司提供。PCR擴增采用細(xì)菌通用引物FA-27F：5′-GCAGAGTTCTCGGAGTCACGAAGAGTTTGA-TCCTGGCTCAG-3′和RA-1495R：5′-AGCGGATCACTTCACACAGGACTACGGGTACCTTGTT-ACGA-3′，反應(yīng)體系為(50 μL)：DNA模板5 μL，引物27F和1495R(10 μmol·L-1)各1 μL，2×Master Mix 25 μL，ddH2O補足至50 μL。反應(yīng)程序為：95℃ 10 min，95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 45 s，30個循環(huán)。將PCR擴增產(chǎn)物送往生工生物工程股份有限公司(上海)測序。

1.3.3生長速率和產(chǎn)酸速率測定 將乳酸菌菌懸液以3%的接種量接種于MRS，M17液體培養(yǎng)基中(兩種液體培養(yǎng)基的初始pH均調(diào)為6.2)，37℃恒溫培養(yǎng)24 h。以未加菌懸液的液體培養(yǎng)基為空白對照，每隔2 h取一次樣，用紫外可見分光光度計(日立，U-2910)測定各樣品的OD600 nm值，以培養(yǎng)時間(h)為橫坐標(biāo)，相對應(yīng)的吸光值(OD)為縱坐標(biāo)，繪制成統(tǒng)計圖。用酸度計(上海雷磁，PHSJ-3F)測定發(fā)酵液pH，根據(jù)不同發(fā)酵時間(h)對應(yīng)的發(fā)酵液的pH平均值的變化繪制產(chǎn)酸速率曲線。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用Excel 2018對所有試驗數(shù)據(jù)進行整理，采用Origin 2017軟件進行繪圖，乳酸菌的16S rDNA序列在GenBank中進行比對，用MEGA 7.0中的Clustal W對最近類群的序列進行多重比較分析，并通過該軟件的鄰近法(Neighbor-Joining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定各菌株分類地位[21]。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌菌株的生理生化特性

8株從雜交構(gòu)樹青貯中分離得到的乳酸菌菌株的鏡檢及生理生化特性分別如圖1和表1所示，所有菌株革蘭氏染色均為陽性，觸酶試驗呈陰性。其中G4，G7，G9，G10和G12細(xì)胞呈桿狀，無芽孢，無運動性，在pH為3.5的條件下能夠生長，這些鑒定結(jié)果符合乳桿菌(Lactobacillusspp.)的生物學(xué)特性。菌株Q3，Q5和Q7細(xì)胞在顯微鏡下呈單、對或成鏈排列的橢圓形或球形，無芽孢，無運動性，這些鑒定結(jié)果符合乳球菌(Lactococcusspp.)的生物學(xué)特性。產(chǎn)氣試驗中菌株G4，G7，G9，Q3，Q5和Q7發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，為同質(zhì)型發(fā)酵乳酸菌；菌株G10和G12發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，屬于異質(zhì)型發(fā)酵乳酸菌。從分離菌株在不同溫度的生長情況來看，所有菌株均能夠在4℃，10℃，30℃和45℃生長或微弱生長，和其他三個溫度條件相比，4℃低溫明顯抑制了菌株的生長；在不同pH值條件下的生長情況表明，當(dāng)pH為3.0時，大部分菌株的生長受到抑制，僅菌株Q3，Q5和Q7能在pH為3.0的條件下生長，菌株G4在pH為3.0和3.5的條件下不生長，其它菌株能在pH3.5～pH9.0范圍內(nèi)生長或微弱生長；所有菌株在3%和6.5% NaCl條件下生長良好。

圖1 乳酸菌革蘭氏染色結(jié)果Fig.1 The results of gram stain of lactic acid bacteria

表1 乳酸菌的生理生化特性Table 1 Physiological and biochemical characteristics of lactic acid bacteria

選取18種碳源對分離的8株乳酸菌進行碳源發(fā)酵試驗，結(jié)果見表2，菌株G4，G9除了鼠李糖不能利用以外，其余糖、醇均可利用；菌株G7不能利用棉子糖、鼠李糖和松三糖，其余糖、醇均可利用；菌株G10，G12不能利用鼠李糖、松三糖、海藻糖、甘露醇，乳糖的利用情況為可變反應(yīng)；菌株Q3，Q5不能利用乳糖、鼠李糖、松三糖和山梨醇，棉子糖的利用情況為可變反應(yīng)，其余糖、醇均可發(fā)酵利用；菌株Q7不能利用鼠李糖、松三糖，乳糖的利用情況為可變反應(yīng)。

表2 乳酸菌碳源發(fā)酵試驗Table 2 Carbon source tests for lactic acid bacteria fermentation

2.2 乳酸菌菌株16S rDNA基因序列分析

經(jīng)BLAST比較鑒定，8株菌與標(biāo)準(zhǔn)菌株的序列相似性均達(dá)到了97.5%以上。將每種菌各選部分參考菌株構(gòu)建系統(tǒng)進化樹(圖2)，結(jié)果表明，G4，G7，G9與植物乳桿菌(L.plantarum)的進化親緣度為100%，G10，G12與短乳桿菌(L.brevis)的進化親緣度為99%，Q3，Q5與屎腸球菌(E.faecium)的進化親緣度為100%，Q7與戊糖片球菌(P.pentosaceus)的進化親緣度為100%。依據(jù)16S rDNA基因序列的同源性分析，確定G4，G7，G9為植物乳桿菌(L.plantarum)，G10，G12為短乳桿菌(L.brevis)，Q3，Q5為屎腸球菌(E.faecium)，Q7為戊糖片球菌(P.pentosaceus)，G4，G7，G9，G10，G12，Q3，Q5，Q7在Genbank中的登錄號為MZ008357—MZ008364。用于構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹的乳酸菌參考菌株見表3。

圖2 乳酸菌基于16S rDNA的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of the lactic bacterium strains according to 16S rDNA sequences

表3 乳酸菌菌株的16S rDNA基因序列分析結(jié)果Table 3 Gene sequence analysis of 16S rDNA of lactobacillus strains

2.3 乳酸菌菌株的產(chǎn)酸速率及生長特性

不同菌株的產(chǎn)酸速率曲線見圖3A，除菌株G10外，其余菌株培養(yǎng)液的pH值在24 h之內(nèi)均能降到4.5以下。其中，G4，G7，G9，G10和G12有相似的產(chǎn)酸速率，0～8 h產(chǎn)酸速率較慢，8～12 h逐漸變快；Q3，Q5和Q7有相似的產(chǎn)酸速率，0～8 h產(chǎn)酸速率較快，8～10 h有回升趨勢，10～24 h逐漸變緩。菌株G4，G7和G9產(chǎn)酸能力較強，在培養(yǎng)24 h后pH降至4.01，4.03，4.15；菌株G10產(chǎn)酸能力較弱，在培養(yǎng)24 h后pH降至4.55。

不同菌株的生長速率曲線結(jié)果見圖3B，由圖可知，在培養(yǎng)2 h后菌株Q3，Q5和Q7進入對數(shù)生長期，其余菌株約在6 h后進入對數(shù)生長期，所有菌株在12 h后進入穩(wěn)定期，且24 h內(nèi)未出現(xiàn)遲滯期。各菌株的生長速率與產(chǎn)酸速率基本表現(xiàn)一致，在菌株進入生長期時產(chǎn)酸速率會上升，穩(wěn)定期時產(chǎn)酸速率則趨于平緩。

圖3 乳酸菌菌株的產(chǎn)酸速率及生長速率Fig.3 Acid production rate and growth rate of lactic acid bacteria strains

3 討論

研究表明，植物表面附生乳酸菌更能適應(yīng)植物生存環(huán)境，因此，從植物原料發(fā)酵過程中分離篩選青貯用優(yōu)良乳酸菌是最為簡單、高效和快捷的方法[22]。由于傳統(tǒng)的微生物鑒定法較為復(fù)雜，對于界限模糊的相似菌株，鑒定結(jié)果可能會不準(zhǔn)確，而微生物分子生物學(xué)鑒定方法能夠彌補這些缺點，客觀、方便、高效的解決許多菌種的分類問題，因而研究中通常使用傳統(tǒng)的生理生化鑒定法結(jié)合微生物分子生物學(xué)法來對分離的細(xì)菌進行綜合鑒定[23-24]。本研究從雜交構(gòu)樹青貯中分離得到8株乳酸菌，通過16S rDNA基因序列分析表明，G4，G7，G9為植物乳桿菌，G10，G12為短乳桿菌，Q3，Q5為屎腸球菌，Q7為戊糖片球菌。研究表明，植物乳桿菌模式株能夠發(fā)酵鼠李糖以外的所有糖[19]，這與本研究所分離的菌株G4，G9的發(fā)酵特性一致，而菌株G7除不能利用棉子糖、鼠李糖和松三糖，其余糖、醇均能利用；短乳桿菌模式株不能發(fā)酵纖維二糖、松三糖、甘露糖、鼠李糖、海藻糖、甘露醇和山梨醇[19]，本研究分離出的菌株G10,G12能夠利用纖維二糖、甘露糖、山梨醇，與模式株有一定差異；菌株Q3，Q5不能發(fā)酵利用鼠李糖、松三糖和棉子糖[19]，其余糖、醇均能利用，這與屎腸球菌模式株的結(jié)果一致；戊糖片球菌模式株不能利用蔗糖、鼠李糖、山梨醇[19]，而本研究分離的菌株Q7可以利用蔗糖、山梨醇，與模式株有差異，這可能是由于同一屬種的乳酸菌對同一種糖的發(fā)酵能力存在差異。目前，用于乳酸菌種屬鑒定的生理生化標(biāo)準(zhǔn)較模糊[25]，因此糖發(fā)酵能力只能作為一種參考，應(yīng)用分子生物學(xué)方法與傳統(tǒng)方法結(jié)合來鑒定乳酸菌更為準(zhǔn)確[26]。

產(chǎn)酸和生長速率是用以衡量相同條件下菌種利用資源發(fā)酵能力的參數(shù)，也是篩選優(yōu)良乳酸菌菌株的重要指標(biāo)[27]。本研究中所有乳酸菌在發(fā)酵過程中遲滯期不明顯，說明其在培養(yǎng)液中生長繁殖速度快，可使乳酸菌數(shù)量迅速增多，增強發(fā)酵，迅速降低pH值[28]。其中菌株G4,G7和G9生長速率和產(chǎn)酸能力更強，理論上可用于促進青貯飼料中乳酸發(fā)酵，而其在功能上是否與其它飼草源分離的植物乳桿菌有所差異還有待繼續(xù)研究。以往研究表明，用作青貯菌劑的微生物應(yīng)具有均一發(fā)酵途徑，可廣泛利用各種可溶性碳水化合物產(chǎn)生大量的乳酸，能適應(yīng)較大的溫度范圍，耐酸能力強，能快速降低pH值(至少使pH值最終達(dá)4.0)，從而能夠抑制其他有害微生物生長[29-30]。本研究中，所有菌株均能夠在4℃～45℃,3%和6.5% NaCl濃度下生長；僅有菌株Q3,Q5和Q7在pH為3的條件下能生長，其余菌株能在pH3.5～9.0范圍內(nèi)生長或微弱生長，體現(xiàn)出較強的耐酸、耐鹽能力及較廣的溫度適應(yīng)范圍。

青貯發(fā)酵過程中，適溫條件下乳桿菌的活力及生長速度均優(yōu)于乳球菌[15]，且乳桿菌更易于分離，因此乳酸菌青貯添加劑菌種首選植物乳桿菌[31]；而由于實際生產(chǎn)中單獨添加某一種乳酸菌并不能達(dá)到最佳的青貯效果，因此通常將植物乳桿菌和其他菌種復(fù)合添加作為青貯乳酸菌制劑，其中腸球菌(Enterococcusspp.)、片球菌(Pediococcusspp.)等同質(zhì)型乳酸菌在發(fā)酵初期繁殖旺盛，往往作為發(fā)酵的啟動乳酸菌，廣泛用于與植物乳桿菌一起構(gòu)成復(fù)合青貯添加劑[28-32]，在發(fā)酵初期創(chuàng)造良好的酸性環(huán)境，從而為乳酸菌的生長提供有利條件。國內(nèi)外常見的青貯乳酸菌添加劑是將植物乳桿菌與乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)復(fù)合添加[22，33]；亦或是植物乳桿菌與糞鏈球菌(Streptococcusfaecalis)的混合接種[34-35]，這些乳酸菌制劑在實際應(yīng)用中明顯改善了青貯品質(zhì)。同時，諸多研究也證實，將植物乳桿菌等同質(zhì)型乳酸菌與異質(zhì)型乳酸菌聯(lián)合接種不僅可改善青貯品質(zhì)，且可有效提高青貯有氧穩(wěn)定性，減少二次發(fā)酵[6-7]。本試驗篩出的乳酸菌均為青貯用常見菌種，對于各菌株之間如何配伍及其應(yīng)用效果，以及它們之間有無相互促進或拮抗的作用，能否為提高雜交構(gòu)樹青貯品質(zhì)提供乳酸菌資源，還需要在后續(xù)試驗中進一步研究。

4 結(jié)論

綜上所述，本研究從雜交構(gòu)樹青貯中分離得到8株乳酸菌，均具有較強的耐酸、耐鹽能力及較廣的溫度適應(yīng)范圍，以及廣泛的發(fā)酵碳源特征。經(jīng)16S rDNA序列分析，3株為植物乳桿菌，2株為短乳桿菌，2株為屎腸球菌，1株為戊糖片球菌，其中，3株植物乳桿菌的產(chǎn)酸能力最強，生長速率最快，可作為制備雜交構(gòu)樹青貯的飼料添加劑。