鄭海英，楊春艷，李玲玉，唐麗萍，鄭 威，尚江華

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院廣西水牛研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水牛遺傳繁育技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧 530001)

卵丘細(xì)胞是卵母細(xì)胞周圍的一種顆粒細(xì)胞，具有維持卵母細(xì)胞減數(shù)分裂停滯狀態(tài)，幫助誘導(dǎo)減數(shù)分裂恢復(fù)和促進(jìn)細(xì)胞質(zhì)成熟等特殊的生理功能。卵丘細(xì)胞的增殖、擴(kuò)展和凋亡會(huì)影響卵母細(xì)胞成熟、受精及后續(xù)早期胚胎的發(fā)育。卵丘-卵母細(xì)胞在體外成熟培養(yǎng)過程中易受外界環(huán)境影響，細(xì)胞內(nèi)氧化-抗氧化系統(tǒng)平衡易被打破，引起卵丘-卵母細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生過多的活性氧(ROS)，使卵丘-卵母細(xì)胞遭受氧化損傷，進(jìn)而影響卵母細(xì)胞體外成熟并降低胚胎體外生產(chǎn)效率[1]。白藜蘆醇(resveratrol，RES)屬非黃酮類多酚化合物，是一種天然植物抗毒素，存在于花生、葡萄、紫斑牡丹、桑椹和虎杖等多種植物中，RES具有抗氧化、抗腫瘤[2]、抗炎[3]、抗凋亡[4]和抗衰老[5]等多種生物活性。RES通過影響卵母細(xì)胞膜和氧化體系來清除自由基，調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞周期、增殖和凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，提高胚胎發(fā)育潛能[6]。研究發(fā)現(xiàn)，0.5 μmol/L RES能提高綿羊卵丘細(xì)胞的擴(kuò)展和孕酮(P4)的濃度，并減少卵母細(xì)胞內(nèi)ROS含量，增強(qiáng)了卵母細(xì)胞抗氧化能力以促進(jìn)卵母細(xì)胞體外成熟[7-8]。邢鵬等[9]研究發(fā)現(xiàn)，50 μmol/L RES顯著提高了人卵泡顆粒細(xì)胞抗凋亡基因B淋巴細(xì)胞瘤-2(Bcl-2)表達(dá)量，降低了凋亡標(biāo)記基因半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)表達(dá)量，從而增強(qiáng)了顆粒細(xì)胞的抗凋亡能力，但添加10 μmol/L RES則無顯著差異。Wang等[10]研究發(fā)現(xiàn)，1 μmol/L RES能夠提高牛卵丘細(xì)胞擴(kuò)展和卵丘細(xì)胞P4分泌量，并通過調(diào)節(jié)牛卵母細(xì)胞抗氧化酶相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)卵母細(xì)胞成熟。在豬上的研究發(fā)現(xiàn)，添加2 μmol/L RES顯著下調(diào)了Caspase-3和促凋亡基因Bcl-2相關(guān)蛋白(Bax)的表達(dá)，抑制了卵母細(xì)胞凋亡[11]。同時(shí)Li等[12]研究發(fā)現(xiàn)，添加2 μmol/L RES維持了豬卵母細(xì)胞內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)等抗氧化酶在一個(gè)平衡狀態(tài)。另外研究顯示，成熟液中添加1 μmol/L RES，同樣能夠提高小鼠卵母細(xì)胞內(nèi)CAT和超氧化物歧化酶1(SOD1)的表達(dá)，改善卵母細(xì)胞的質(zhì)量[13]。在氧化應(yīng)激狀態(tài)下，10 μmol/L RES顯著下調(diào)小鼠心肌及內(nèi)皮細(xì)胞p21蛋白表達(dá)量，延緩了細(xì)胞衰老[14]。目前，關(guān)于RES對(duì)水牛卵丘-卵母細(xì)胞體外成熟的影響及其作用尚不明確。因此，本試驗(yàn)以水牛卵丘細(xì)胞為研究對(duì)象，探究添加RES對(duì)卵丘細(xì)胞活力、激素分泌及卵丘擴(kuò)展相關(guān)基因(透明質(zhì)酸合酶2(HAS2)、穿透素3(PTX3)、前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2(PTGS2))、凋亡相關(guān)基因(Bcl-2、Bax、Caspase-3、細(xì)胞周期蛋白激酶抑制因子(p21))和抗氧化酶相關(guān)基因(SOD1、CAT)表達(dá)的影響，為研究RES對(duì)水牛卵母細(xì)胞成熟及發(fā)育的作用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 卵巢采集 試驗(yàn)所用水牛卵巢取自南寧市某屠宰場(chǎng)。采集的水牛卵巢放入含有雙抗、溫度為25～30 ℃的生理鹽水保溫杯中，在2～3 h 送回實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 主要試劑 DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清(FBS)均購自Gibco公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑SYBR?Premix ExTaqTM購自寶生物工程(大連)有限公司；雌二醇(E2)和P4ELISA試劑盒均購自江蘇酶標(biāo)生物科技有限公司；白藜蘆醇、二甲基亞砜(DMSO)、青霉素、鏈霉素、磷酸緩沖液(PBS)、胰蛋白酶、透明質(zhì)酸酶均購自Sigma公司。

RES濃儲(chǔ)液配制：使用DMSO溶解白藜蘆醇，配制20 mmol/L的濃儲(chǔ)液。

1.2 方法

1.2.1 水牛卵丘細(xì)胞的收集與培養(yǎng) 用10 mL注射器穿刺抽吸卵巢上4～8 mm大小卵泡的卵泡液。在體視顯微鏡下用撿卵針挑選細(xì)胞質(zhì)均勻、包裹有2層以上卵丘細(xì)胞的卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體(cumulus oocyte complexes,COCs)，用PBS液清洗3次，轉(zhuǎn)入0.1%透明質(zhì)酸酶中消化并用移液槍反復(fù)吹打使卵丘細(xì)胞與卵母細(xì)胞完全分離，挑出裸露的卵母細(xì)胞。用1.5 mL離心管收集卵丘細(xì)胞混懸液，2 500 r/min離心5 min，棄上清后用DMEM培養(yǎng)液離心洗滌2次。將收集的卵丘細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)(培養(yǎng)液為：DMEM培養(yǎng)基+10%FBS+100 U/mL青霉素+100 μg/mL鏈霉素)，24 h細(xì)胞開始貼壁生長。培養(yǎng)2～3 d，貼壁細(xì)胞達(dá)到50%～60%匯合度即可進(jìn)行添加白藜蘆醇分組試驗(yàn)：以DMEM+10% FBS為基礎(chǔ)液，將RES濃儲(chǔ)液配制成1、10、20、30、40、50、60 μmol/L的培養(yǎng)液，以不加RES(0 μmol/L)為對(duì)照組。 所有試驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.2.2 細(xì)胞活力測(cè)定 將水牛原代卵丘細(xì)胞調(diào)整為105/mL,以每孔100 μL接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，在37 ℃、5% CO2、100%飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞匯合度達(dá)50%時(shí)，棄去原培養(yǎng)液，添加0(對(duì)照組)、1、10、20、30、40、50、60 μmol/L的RES繼續(xù)培養(yǎng)12、24、36、48及60 h時(shí)，分別更換新培養(yǎng)液100 μL和CCK-8 10 μL，于培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h后，采用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度，測(cè)定波長為450 nm。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。 以只加培養(yǎng)液的孔為空白組。 細(xì)胞活力(%)=(D處理組-D空白組)/(D對(duì)照組-D空白組)×100。通過檢測(cè)各組的細(xì)胞活力篩選最佳RES濃度及處理時(shí)間進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)液中激素含量檢測(cè) 對(duì)照組和最佳RES濃度組水牛卵丘細(xì)胞培養(yǎng)36 h后，用移液槍吸取細(xì)胞上清液，采用ELISA法測(cè)定E2和P4的含量。

1.2.4 總RNA提取、反轉(zhuǎn)錄及實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè) 對(duì)照組和最佳RES濃度組水牛卵丘細(xì)胞培養(yǎng)36 h后，用PBS清洗3次，用微量RNA提取試劑盒提取水牛卵丘細(xì)胞總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。然后根據(jù)GenBank中牛HAS2、PTX3、PTGS2、Bcl-2、Bax、Caspase-3、SOD1、CAT和p21基因的參考序列，利用NCBI Primer Blast設(shè)計(jì)引物(表1)，引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。以β-actin為內(nèi)參基因，以cDNA為模板，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)各基因的表達(dá)。PCR反應(yīng)體系15 μL：SYBR?Premix ExTaqTMⅡ7.5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.3 μL，cDNA 1.0 μL，ddH2O 5.9 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸60 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)，用Roche LightCycler 480采集熒光信號(hào)并分析，用2-△△Ct方法計(jì)算各目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物信息

續(xù)表

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(One-Way ANOVA)，采用Duncan’s法進(jìn)行多重比較，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用GraphPad Prism 5.0軟件進(jìn)行繪圖。P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 RES對(duì)水牛原代卵丘細(xì)胞增殖活力的影響

由表2可知，與對(duì)照組相比，在體外培養(yǎng)24～36 h內(nèi)，1、10和20 μmol/L RES組水牛卵丘細(xì)胞的增殖活力均有升高趨勢(shì)，在培養(yǎng)36 h時(shí)，10 μmol/L RES組細(xì)胞活力顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，1和20 μmol/L RES組與對(duì)照組差異不顯著(P>0.05)。但培養(yǎng)36 h后，隨著添加時(shí)間的延長，細(xì)胞增殖活力呈逐漸下降趨勢(shì)，且40、50和60 μmol/L RES組無論作用時(shí)間長短，細(xì)胞活力均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，抑制卵丘細(xì)胞生長。10 μmol/L RES組細(xì)胞活力最強(qiáng)，因此，選擇10 μmol/L RES為后續(xù)試驗(yàn)的最佳添加濃度。

表2 不同濃度RES組水牛原代卵丘細(xì)胞的增殖活力

2.2 RES對(duì)水牛原代卵丘細(xì)胞E2和P4分泌的影響

由圖1可知，與對(duì)照組相比，10 μmol/L RES組水牛卵丘細(xì)胞E2和P4分泌量均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。

與對(duì)照組相比，*，差異顯著(P<0.05)；**，差異極顯著(P<0.01)；無*，差異不顯著(P>0.05)。下同Compared with control group, *, Significant difference (P<0.05)；**，Extremely significant difference (P<0.01)；No *, No significant difference (P>0.05). The same as below圖1 RES對(duì)水牛原代卵丘細(xì)胞E2、P4分泌的影響Fig.1 Effects of RES on E2 and P4 secretion of buffalo primary cumulus cells

2.3 RES對(duì)水牛原代卵丘細(xì)胞擴(kuò)展、凋亡和抗氧化相關(guān)基因表達(dá)的影響

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，10 μmol/L RES組卵丘細(xì)胞擴(kuò)展相關(guān)基因PTX3、抗凋亡基因Bcl-2、抗氧化基因SOD1的mRNA表達(dá)量均顯著增加(P<0.05)，PTGS2基因表達(dá)量極顯著增加(P<0.01)，HAS2和CAT基因表達(dá)量均無顯著差異(P>0.05)；促凋亡基因Bax、p21和Caspase-3的表達(dá)量極顯著或顯著降低(P<0.01；P<0.05)(圖2)。

圖2 RES對(duì)水牛原代卵丘細(xì)胞HAS2、PTX3、PTGS2、Bax、Bcl-2、Caspase-3、SOD1、CAT及p21基因相對(duì)表達(dá)量的影響Fig.2 Effects of RES on the relative expression of HAS2,PTX3,PTGS2,Bax,Bcl-2,Caspase-3,SOD1,CAT and p21 genes of buffalo primary cumulus cells

3 討 論

卵丘細(xì)胞作為卵母細(xì)胞周圍的一種顆粒細(xì)胞，在卵泡發(fā)育和成熟卵泡排卵或閉鎖過程中發(fā)揮著重要作用，且顆粒細(xì)胞分化、增殖及其與卵母細(xì)胞之間的信號(hào)交流決定著卵母細(xì)胞的命運(yùn)。同時(shí)卵巢顆粒細(xì)胞是雌性動(dòng)物體內(nèi)重要的類固醇激素分泌細(xì)胞，可合成并分泌E2和P4及其他一些細(xì)胞因子，這些類固醇激素對(duì)于雌性動(dòng)物的正常生理節(jié)律和妊娠過程均至關(guān)重要。本研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度RES對(duì)水牛卵丘細(xì)胞的增殖活力及E2和P4分泌有一定影響，體外培養(yǎng)36 h內(nèi)低濃度RES促進(jìn)細(xì)胞增殖，36 h后細(xì)胞增殖能力逐漸下降。而無論培養(yǎng)時(shí)間長短，高濃度RES均抑制卵丘細(xì)胞增殖。在培養(yǎng)36 h，10 μmol/L RES條件下，卵丘細(xì)胞增殖能力最強(qiáng)，卵丘細(xì)胞E2和P4分泌量增加。Ortega等[15]在大鼠上的研究顯示，10和30 μmol/L RES對(duì)顆粒細(xì)胞培養(yǎng)24和48 h的P4分泌量無顯著影響，同時(shí)隨濃度的升高顯著降低E2分泌量及芳香化酶基因(CYP19)的表達(dá)。Basly等[16]研究MFC-7細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，10和25 μmol/L RES表現(xiàn)出E2興奮性作用，而0.1和1 μmol/L則表現(xiàn)出抗E2樣作用。本研究結(jié)果與上述10 μmol/L RES的研究結(jié)果不一致，可能與添加RES培養(yǎng)時(shí)長和細(xì)胞類型不同有關(guān)。而與在綿羊[7]和牛[10]上細(xì)胞E2分泌量降低結(jié)果正好相反，推測(cè)RES是通過正反饋?zhàn)饔么龠M(jìn)水牛卵丘細(xì)胞E2的分泌。因?yàn)镽ES既可作為一種選擇性的E2受體調(diào)節(jié)劑,也可作為芳香化酶的抑制劑，在不同的動(dòng)物試驗(yàn)中表現(xiàn)出不同程度的E2受體激動(dòng)劑活性[17]，并競(jìng)爭(zhēng)性地與卵丘細(xì)胞上的E2受體結(jié)合，當(dāng)卵丘-卵母細(xì)胞的E2受體達(dá)到飽和狀態(tài)，便會(huì)通過負(fù)反饋?zhàn)饔谜{(diào)節(jié)降低卵丘細(xì)胞E2的分泌量。

本試驗(yàn)檢測(cè)卵丘細(xì)胞擴(kuò)展、凋亡和抗氧化相關(guān)基因的mRNA表達(dá)量發(fā)現(xiàn),10 μmol/L RES能顯著上調(diào)水牛卵丘細(xì)胞PTX3、PTGS2、Bcl-2和SOD1基因的表達(dá)量，顯著下調(diào)Bax、Caspase-3和p21基因的表達(dá)量。卵丘細(xì)胞擴(kuò)展依靠相關(guān)基因的參與，以保證卵丘細(xì)胞的完整、擴(kuò)展及卵母細(xì)胞的成熟。卵丘細(xì)胞的擴(kuò)展程度是評(píng)價(jià)卵母細(xì)胞成熟及其質(zhì)量的關(guān)鍵指標(biāo)之一，卵丘擴(kuò)展相關(guān)基因HAS2、PTGS2和PTX3促進(jìn)卵丘細(xì)胞的增殖和擴(kuò)展[18]。HAS2主要參與卵丘細(xì)胞外基質(zhì)透明質(zhì)酸酶的合成，PTGS2參與相關(guān)激素的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，PTX3在卵丘細(xì)胞外基質(zhì)的組織中起關(guān)鍵作用[19]。研究發(fā)現(xiàn)，體外成熟培養(yǎng)液中添加2 μmol/L RES可提高豬的卵丘細(xì)胞擴(kuò)展、極體形成及調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞成熟過程中的基因表達(dá)[11]。RES作為一種抗氧化劑，具有很強(qiáng)的活性氧清除能力，能夠清除氧自由基和羥自由基，并通過調(diào)節(jié)與細(xì)胞凋亡有關(guān)基因的表達(dá)，可減少細(xì)胞凋亡[20]。本研究結(jié)果與人卵泡顆粒細(xì)胞添加50 μmol/L RES的研究結(jié)果基本一致，但與添加10 μmol/L RES的結(jié)果不同[15]。Kwaka等[11]研究發(fā)現(xiàn)，添加2 μmol/L RES對(duì)豬卵母細(xì)胞Bcl-2基因的表達(dá)無顯著影響，但明顯下調(diào)了Caspase-3和Bax基因的表達(dá)，抑制了卵母細(xì)胞凋亡。該研究結(jié)果與在牛[17]和山羊[21]卵母細(xì)胞研究的結(jié)果一致。然而，在人乳腺癌細(xì)胞體外培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)RES存在劑量依賴效應(yīng)，低濃度促進(jìn)細(xì)胞分裂、抑制細(xì)胞凋亡，高濃度則抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡[22]。另外對(duì)在豬卵母細(xì)胞研究顯示，添加10 μmol/L的RES時(shí)，Bax基因表達(dá)量升高，Bcl-2基因表達(dá)量下降，細(xì)胞呈現(xiàn)凋亡狀態(tài)，Bcl-2基因表達(dá)量甚至低于對(duì)照組[23]。 這與Lee等[24]和Torres等[17]添加高濃度RES所得研究結(jié)果類似，但與本研究添加10 μmol/L的RES研究結(jié)果恰好相反，推測(cè)這可能與不同物種、不同細(xì)胞類型、不同的細(xì)胞培養(yǎng)基成分及添加后培養(yǎng)時(shí)長差異有關(guān)。體外培養(yǎng)過程中會(huì)產(chǎn)生氧化應(yīng)激從而導(dǎo)致卵丘-卵母細(xì)胞的衰老和死亡，而抗氧化酶對(duì)于機(jī)體的抗氧化能力起到重要的作用。大量的體外研究表明，添加一定濃度的RES，細(xì)胞內(nèi)的ROS水平明顯降低，能夠緩解多種因素誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激[25]。對(duì)小鼠和豬的研究發(fā)現(xiàn)，添加一定濃度的RES顯著提高了卵母細(xì)胞CAT、SOD1和Bcl-2基因的表達(dá)量，維持了豬卵母細(xì)胞內(nèi)SOD和CAT等抗氧化酶基因在一個(gè)平衡狀態(tài)，從而改善卵母細(xì)胞的質(zhì)量[12-13，23]。當(dāng)細(xì)胞受到氧化應(yīng)激時(shí)，細(xì)胞周期異常調(diào)控會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞增殖失控等細(xì)胞正常功能異常發(fā)生。p21基因是抑癌基因，具有誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯、促進(jìn)細(xì)胞衰老和凋亡等功能，p21在細(xì)胞凋亡、分化方面具有重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激狀態(tài)下，10 μmol/L RES顯著下調(diào)小鼠心肌及內(nèi)皮細(xì)胞p21蛋白量，延緩了衰老[14]。Liang等[26]對(duì)中年小鼠注射RES可以有效改善氧化應(yīng)激引起的輸卵管卵母細(xì)胞衰老。本研究結(jié)果顯示，10 μmol/L RES顯著上調(diào)SOD1基因的表達(dá)量，下調(diào)p21基因的表達(dá)量，與上述研究結(jié)果基本一致。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，添加10 μmol/L RES體外培養(yǎng)36 h能夠顯著提高水牛卵丘細(xì)胞增殖活力，促進(jìn)卵丘細(xì)胞分泌E2和P4，顯著促進(jìn)水牛卵丘細(xì)胞擴(kuò)展相關(guān)基因(PTX3、PTGS2)、凋亡抑制基因Bcl-2和抗氧化基因SOD1的相對(duì)表達(dá)，并顯著降低促凋亡基因Bax、Caspase-3和p21的表達(dá)。 說明10 μmol/L RES能夠促進(jìn)水牛卵丘細(xì)胞增殖和擴(kuò)展，提高卵丘細(xì)胞抗氧化能力的同時(shí)減少細(xì)胞凋亡，并參與水牛卵丘細(xì)胞激素分泌的調(diào)節(jié)。