史源鈞，米思遠，俞 英

(中國農業(yè)大學動物科技學院，北京 100193)

畜禽擁有許多復雜的經濟性狀，近十余年來，研究者已通過全基因組關聯(lián)分析等方式鑒定到了大量與這些經濟性狀密切相關的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)位點，但是這些位點大多數(shù)位于基因組的非編碼區(qū)[1-3]?；蚪M的遺傳信息通過何種方式影響畜禽的復雜性狀仍未得到全面地闡明。生物中心法則指出，遺傳信息由DNA流向RNA，最后流向蛋白質，在這一過程中往往伴隨著復雜的調控模式。RNA作為遺傳物質表達過程中最為重要的中間環(huán)節(jié)，有160余種RNA修飾被報道，這些修飾主要參與基因的轉錄及轉錄后調控過程[4]，如N6-甲基腺嘌呤(N6-methyladenosine，m6A)、N1-甲基腺嘌呤(N1-methyladenosine，m1A)[5]及5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine，m5C)[6]等修飾(圖1)[7]。其中，m6A在真核生物RNA修飾中豐度最高且具有較高的保守性，其最早在1974年被發(fā)現(xiàn)于真核生物mRNA及l(fā)ncRNA中[8]。研究發(fā)現(xiàn)，m6A修飾廣泛分布于人類細胞中超7 000個mRNAs及300個lncRNAs中[9]。據估計，分離出的RNA中m6A甲基化修飾的量占總腺苷量的0.1%～0.4%(即每條mRNA有3～5個m6A修飾位點)，且主要在終止密碼子、3′-端及內部長外顯子中富集[10]。此外，近期研究發(fā)現(xiàn)，被修飾的RNA含有共有基序RRACH(R=A/G,H=A/C/U)[11]。目前，人類及模式生物上大量的研究已經表明，m6A廣泛參與生長發(fā)育、代謝及炎癥反應等相關過程[11-12]。作者就哺乳動物m6A研究的最新前沿動態(tài)進行了闡述，并重點探討了m6A對于畜禽復雜經濟性狀的意義及相關應用前景。

圖1 RNA常見修飾方式及其常見位置(修改自[7])Fig.1 Overview of common nucleotide modifications on RNA (modified from[7])

1 m6A修飾的分子機制

m6A甲基化修飾是RNA中腺嘌呤上第6位的氨基發(fā)生甲基化的一種修飾方式，在生物體內是一個可逆的過程，在細胞核內由甲基轉移酶復合物(writers)、去甲基化酶(erasers)共同作用，以調控m6A在RNA上修飾的位點及豐度，并由讀取蛋白(readers)調節(jié)RNA可變剪接、出核運輸、翻譯及降解過程(圖2)。

圖2 m6A甲基化修飾機制Fig.2 The mechanism of m6A methylation

1.1 m6A甲基化酶復合物

研究顯示，m6A甲基化主要由S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine,SAM)作甲基供體，通過大型甲基轉移酶復合物(m6A methyltransferase complex,MTC)來實現(xiàn)整個甲基化過程。 MTC由甲基轉移酶METTL3(methyltransferase-like 3)和METTL14(methyltransferase-like 14)組成的功能性異源二聚體為催化核心，由WTAP(Wilm’s tumour-1-associated protein)蛋白作其載體，最后由其他相關蛋白因子如KIAA1429、RBM15等共同完成m6A甲基化的過程[13]。在這個大型MTC中，METTL3可以催化SAM，將甲基由SAM轉移至腺苷酸上；METTL14作為METTL3的同源物，可以穩(wěn)定METTL3的空間構象保持其生物活性，并識別可甲基化的RNA，促進甲基化過程[14]。WTAP作為甲基轉移酶復合物中第3個關鍵組成成分，募集由METTL3和METTL14組成的異源二聚體；同時還可以募集可甲基化的mRNA及l(fā)ncRNA，并加速甲基化過程[15]。研究證明，在HeLa細胞中敲低METTL3，m6A修飾水平降低了30%；同樣，敲低METTL14或WTAP，HeLa細胞整體m6A修飾水平均有不同程度的下降[9]。雖然三者甲基化活性相對偏低，但因其相結合形成穩(wěn)定的復合物后可顯著提升彼此的甲基化活性，由METTL3、METTL14及WTAP組成的MTC甲基化活性顯著升高[16]。此外，METTL3和METTL14的同源物METTL16也可利用SAM單獨完成m6A甲基化過程[11]。一般情況下，m6A甲基化過程需要在細胞核內完成，但在一些特殊情況下(如病毒的復制)也可在細胞質內完成[17]。

1.2 m6A去甲基化酶

m6A去甲基化酶主要功能是去除受m6A修飾RNA上的甲基基團。目前已被發(fā)現(xiàn)的m6A去甲基化酶只有ALKBH5(ALKB homolog 5)和FTO(又名ALKBH9,ALKB homolog 9) 2種。 由于ALKBH9最早被發(fā)現(xiàn)與肥胖有關，因此命名為FTO(fat mass obesity associate)[18]，二者同屬ALKB族蛋白，且在發(fā)揮作用時都需要氧氣及二價鐵的參與[19],但二者在去甲基化的機制上有所不同。ALKBH5主要在細胞核內富集，除去甲基化外還可調節(jié)mRNA的加工、代謝及出核運輸[20],其去甲基化過程一步完成，不產生任何中間體[21]。而FTO在細胞質內的去甲基化過程中主要通過分步氧化的方式完成：首先將甲基(m6A)氧化成羥甲基(N6-羥甲基腺苷，hm6A)；之后再將其進一步氧化成甲?；?N6-甲酰基腺苷，f6A)；最后在多種酶的作用下還原成腺苷[22]。這種方式從動力學角度來看反應更容易進行，F(xiàn)TO通過分步氧化甲基，不斷加大修飾基團與腺苷之間的極性，更利于修飾基團的脫除。此外，F(xiàn)TO還可以調節(jié)前體mRNA的剪切[23-24]。

1.3 m6A讀取蛋白

m6A讀取蛋白主要由YTH域蛋白組成，包括2個亞型：YTHDFs(YTH domain family proteins)和YTHDCs(YTH domain containing proteins)。YTHDFs主要包括3種蛋白：YTHDF1、YTHDF2和YTHDF3;YTHDCs主要包括2種蛋白：YTHDC1和YTHDC2[25]。此外，除YTH域蛋白外，m6A讀取蛋白也包括eIF3和hnRNPs等多種蛋白。除了少部分讀取蛋白在細胞核內發(fā)揮作用外，大多數(shù)作用場所在細胞質內。對于YTHDFs蛋白而言，不同的YTHDF蛋白會結合到不同的m6A修飾區(qū)域上[26]，并影響下游被修飾RNA的可變剪接、翻譯、降解及RNA穩(wěn)定性[27]。 從實際功能上看，YTHDF1、YTHDF3、YTHDC2及eIF3蛋白可誘導經m6A甲基化修飾的mRNA進行翻譯。但由于m6A甲基化在終止密碼子附近富集，遠離翻譯起始位點[28]，m6A對mRNA翻譯的促進作用僅存在于可環(huán)化的RNA中[29]，其原因可能是由于mRNA發(fā)生環(huán)化后，終止密碼子和起始密碼子相鄰導致m6A可促進mRNA的翻譯。 此外，YTHDF2、YTHDF3、YTHDC1及YTHDC2可將m6A誘導至P-body[30]，并募集CCR4-NOT復合物，將轉錄本腺苷酸化并降解[31]。在熱應激情況下，YTHDF2可轉移至核內，通過限制去甲基化酶FTO的去甲基化過程來維持體內m6A甲基化水平的穩(wěn)定[32]。由于被m6A修飾的mRNA區(qū)域通常缺乏二級結構，致使YTHDC1與hnRNP有利于與其結合從而發(fā)生選擇性剪切[33-34]。

2 m6A修飾的檢測技術

為檢測m6A修飾整體及特異位點的豐度，研究者基于液相色譜、質譜、免疫沉淀及測序等多種技術手段開發(fā)出了定量、定點的m6A甲基化修飾檢測方法(圖3)?？紤]到試驗的高效性及準確性，目前針對m6A的定量分析主要有Dot Blot法[35]、液相色譜-質譜聯(lián)用(LC-MS)及基于液質聯(lián)用優(yōu)化出的高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質譜技術(LC-MS/MS)[36]等方法。m6A整體豐度的改變只能在一定程度上說明m6A修飾發(fā)生變化，但若是在檢測中發(fā)現(xiàn)整體豐度無明顯變化并不能說明m6A修飾無變化，有可能是部分修飾位點發(fā)生變化而整體豐度變化不明顯[37]，因此，需要在后續(xù)針對m6A修飾的位點及單基因m6A修飾的變化進行進一步檢測。目前，對于m6A位點的定位檢測主要有基于免疫沉淀技術及測序技術的m6A測序[9](m6A-seq)、m6A免疫沉淀測序[10](methylated RNA immunoprecipitation sequencing,MeRIP-seq)、m6A單核苷酸分辨率交聯(lián)與免疫沉淀定位法[38](methylation individual-nucleotide-resolution crosslinking and immunopre-cipitation,miCLIP)等技術。而針對單基因的檢測主要是甲基化RNA免疫共沉淀實時熒光定量PCR(methylated RNA immunoprecipitation quantitative Real-time PCR,MeRIP-qPCR)和利用m6A位點進行特異性切割及放射性標記后再進行連接輔助萃取和薄層層析方法(site-specific cleavage and radioactive-labeling followed by ligation-assisted extraction and thin-layer chromatography,SCARLET)2種，但二者存在著不同的優(yōu)缺點。MeRIP-qPCR操作簡便但精度不足，無法定位到單堿基；SCARLET可定位到單堿基水平但其操作繁瑣，不適合大范圍使用[39]。近幾年，研究者開發(fā)出了一系列不需要抗體的單基因檢測技術，如基于單堿基延伸和連接的qPCR法[40](single-base elongation- and ligation-based qPCR amplification method,SELECT)和FTO輔助的化學交聯(lián)法[41](FTO-assisted chemical labeling method,m6A-SEAL)等。此外，單分子實時測序(single molecule Real-time seqencing,SMRT-seq)[42-43]和單分子納米孔測序[44]也為RNA修飾的檢測提供了新的可能。

圖3 m6A主要檢測方法Fig.3 The main detection techniques of m6A

3 m6A修飾在動物復雜性狀方面的研究

3.1 m6A調控動物生長發(fā)育

由于m6A在生物體內分布極為豐富，近年來關于m6A對動物體生長發(fā)育影響的研究也越來越多。研究表明，m6A甲基化修飾對脂肪的形成起到了關鍵的調節(jié)作用，在脂肪組織中m6A去甲基化酶FTO及讀取蛋白YTHDF2均可通過介導ATG5、ATG7轉錄本m6A修飾豐度影響其轉錄本豐度和脂肪前體細胞自噬過程，最終調節(jié)脂肪組織的形成[45]。在家養(yǎng)動物上，斷奶仔豬飼糧中添加支鏈氨基酸(branched-chain amino acids,BCAA)可顯著下調腹側、背側及肝臟脂肪組織中m6A的總體豐度，從而影響其脂質代謝及沉積[46]。在肌肉發(fā)育的不同階段m6A修飾也發(fā)揮了重要的調控作用，如在骨骼肌發(fā)育相關通路中大量蛋白轉錄本均受到不同程度m6A修飾的調控，隨著骨骼肌的發(fā)育，m6A讀取蛋白胰島素樣生長因子2 mRNA結合蛋白1(insulin-like growth factor 2 mRNA-binding protein 1，IGF2BP1)表達量在不斷降低，為了證明該過程中m6A修飾發(fā)揮了關鍵作用，研究人員在成肌細胞中分別敲降IGF2BP1以及m6A讀取蛋白METTL14，發(fā)現(xiàn)肌細胞出現(xiàn)了類似表型變化[47]。此外，在動物表皮mRNA的m6A修飾差異同樣顯著影響到皮膚組織及動物絨毛的發(fā)育[48-49]。

研究發(fā)現(xiàn)，動物性情對動物經濟性狀及動物福利有顯著影響[50]，在近期對神經發(fā)育及疾病的研究中同樣證明了m6A對大腦發(fā)育、衰老及阿爾茲海默癥有重要影響。據報道，5XFAD阿爾茲海默癥小鼠3′-端非編碼區(qū)m6A水平顯著低于野生型對照小鼠，而這些差異甲基化區(qū)域內的基因參與了在阿爾茨海默癥發(fā)病過程中受到影響的生物過程，如突觸傳遞和離子轉運調節(jié)等[51]，因此，在今后m6A修飾對畜禽神經系統(tǒng)發(fā)育的影響同樣值得關注。

3.2 m6A對于畜禽繁殖的影響

在畜禽繁殖及發(fā)育中同樣發(fā)現(xiàn)m6A發(fā)揮了重要作用。研究表明，m6A甲基化修飾及其相關調控因子在誘導豬多能干細胞(porcine induced pluripotent stem cells,piPSCs)分化中發(fā)揮了重要的調控作用。由于Janus激酶2(Janus kinase 2，JAK2)和細胞因子信號抑制劑3(suppressor of cytokine signaling 3，SOCS3)轉錄本的3′-端存在m6A修飾，METTL3缺失會導致JAK2和SOCS3轉錄本m6A水平降低。由于這2種基因編碼的蛋白在JAK2-STAT3通路中發(fā)揮了重要作用，其表達量的下降進一步導致了JAK2-STAT3通路的沉默，從而阻斷Kruppel樣因子4(kruppel like factor 4，KLF4)和SRY轉錄因子2(SRY-box transcription factor 2，SOX2)基因的轉錄，而這2種基因編碼的蛋白在維持細胞多能性及自我更新中發(fā)揮了重要作用，其缺失會顯著影響piPSCs的自我更新并誘導其發(fā)生分化[52]。此外，在正常生殖細胞的發(fā)育過程中m6A甲基化修飾同樣起到了重要的調控作用，如m6A對卵泡的發(fā)育過程(外層顆粒細胞對卵泡的發(fā)育、成熟及排卵)有重要的調控作用[53]。而在顆粒細胞中m6A存在高豐度的修飾，且修飾豐度會隨著卵泡的發(fā)育發(fā)生動態(tài)的變化，在顆粒細胞增殖、類固醇分泌及卵泡發(fā)育過程中，顆粒細胞內參與m6A甲基化修飾的基因均出現(xiàn)顯著的差異表達[54]。

3.3 m6A對畜禽熱應激的影響

近幾十年來，全球變暖導致世界各地出現(xiàn)了持續(xù)性高溫及頻繁的極端炎熱天氣，由于奶牛、豬及家禽等家養(yǎng)動物受熱應激的影響較大，給養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的損失。研究發(fā)現(xiàn)，轉錄組m6A甲基化水平會隨著熱應激的發(fā)生而出現(xiàn)顯著變化，而KEGG通路富集分析顯示，這些差異m6A修飾的基因主要富集在Wnt、轉化生長因子-β(transforming growth factor-beta，TGF-β)等與應激響應和脂質代謝相關的通路[55]。m6A甲基化調節(jié)了熱休克蛋白(heat shock proteins,HSPs)基因的表達，而m6A修飾的HSPs轉錄本的差異表達可能取決于m6A位點及其豐度[56]，一方面，隨著熱應激的發(fā)生，m6A甲基化相關調控因子表達量升高，導致熱休克蛋白(HSP70、HSP90、HSP110)轉錄本m6A甲基化水平和表達量出現(xiàn)明顯上升，從而影響動物對于熱應激的反應[57]；另一方面，熱應激提升了部分mRNA的5′-端非編碼區(qū)m6A甲基化修飾豐度，增強了mRNA的翻譯。值得注意的是，在此過程中m6A甲基化讀取蛋白YTHDF2從細胞質內幾乎全部遷移至細胞核內發(fā)揮作用，且在熱應激發(fā)生后，YTHDF2蛋白表達水平與HSP70出現(xiàn)了同步上調，細胞m6A甲基化豐度增加了近4倍[32]。此外，熱應激會影響畜禽的生產性狀，當仔豬發(fā)生熱應激反應后，肝臟及腹部脂肪組織中m6A甲基化相關調節(jié)因子的表達水平出現(xiàn)顯著上調，參與脂肪代謝相關基因的表達量出現(xiàn)了顯著上升。在此過程中，肝臟及腹部脂肪組織中脂肪代謝基因轉錄本可能受到m6A甲基化的調節(jié)，從而影響了仔豬后續(xù)脂肪的沉積[58]。同時，生物為了應對熱應激，在生命早期可通過m6A去甲基化酶FTO影響腦營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)轉錄本m6A甲基化修飾豐度，進而影響其表達量，從而改變生物后期對熱應激的反應[59]。而BDNF作為體內含量最多的神經營養(yǎng)因子，其廣泛存在于中樞及周圍神經系統(tǒng)中[60]，對生物神經系統(tǒng)發(fā)育、精神疾病及某些癌癥均有重要影響[61-62]。

3.4 m6A對于炎癥反應及癌癥的調控

越來越多的研究表明，m6A修飾在炎癥反應中發(fā)揮著至關重要的作用。引起炎癥反應的病原因素主要有病毒和細菌兩大類，如許多編碼抗病毒蛋白的干擾素刺激基因(interferon stimulating genes，ISGs)的轉錄本被m6A修飾，m6A的修飾促進某些ISGs的翻譯，增強干擾素的抗病毒作用[63]；但也有研究表明，病毒自身的m6A甲基化修飾可通過抑制雙鏈RNA(double-stranded RNA，dsRNA)的形成，削弱Rig樣受體(Rig-like receptors，RLRs)對病毒的識別，從而促進病毒的免疫逃逸[64]。此外，在某些DNA病毒感染下，m6A調節(jié)因子hnRNPA2B1可識別病毒DNA促進m6A修飾，從而觸發(fā)先天免疫反應[65]。在對家畜的相關研究中發(fā)現(xiàn)，豬流行性腹瀉病毒受到大量m6A修飾的調控，宿主甲基化酶METTL3、METTL14及去甲基化酶FTO對病毒RNA的m6A修飾起到了重要的調節(jié)作用，讀取蛋白YTHDF可通過影響病毒RNA的穩(wěn)定性從而影響病毒的復制，該研究證明在病毒感染后，宿主通過下調去甲基化酶FTO使宿主m6A修飾豐度提高[66]。近期對于2019新型冠狀病毒(COVID-19)的研究發(fā)現(xiàn)，新型冠狀病毒具有m6A修飾，且病毒m6A豐度降低，可促進其與RIG-Ⅰ的結合，并增強宿主細胞下游先天免疫信號通路和炎癥基因表達，且新型冠狀肺炎重癥患者m6A甲基化酶顯著偏低[67]。

細菌引起的機體炎癥反應可引起機體m6A水平的改變。當細菌感染小鼠角膜后，角膜組織可通過提高甲基化酶METTL3的表達量而提高其整體甲基化水平，從而起到抗感染的作用[68]。除此之外，在動物腸道中也有相似發(fā)現(xiàn)，腸毒性大腸桿菌感染后，機體可通過“FOXO6-METTL3-m6A-GPR161信號通路”提高METTL3基因的表達水平，從而提高m6A修飾豐度，促進腸防御素的表達[69]。

在對癌癥的研究中發(fā)現(xiàn)，m6A修飾對肺癌、胃癌、胰腺癌、肝癌、急性髓系白血病等多種癌癥都有重要影響[70]。針對m6A去甲基化酶FTO及甲基化酶METTL3在急性髓系白血病中的異常表達，已有課題組開發(fā)出了一系列小分子靶向藥物，使m6A的研究具有臨床意義[71-73]。

3.5 m6A修飾調控蛋白與畜禽經濟性狀關系

研究表明，畜禽m6A修飾豐度的高低對其經濟性狀會產生較大影響，m6A修飾對畜禽繁殖、生長和抗應激等多方面均有重要意義，部分相關研究結果見表1。

表1 m6A修飾與畜禽經濟性狀的關系

續(xù)表

4 m6A甲基化修飾與其他表觀修飾之間的聯(lián)系

除m6A對于RNA代謝的調控外，其他表觀修飾形式與m6A之間同樣存在緊密聯(lián)系，如磷酸化、類泛素化修飾對m6A相關蛋白因子的調控、m6A對非編碼RNA的調控及組蛋白修飾與m6A之間的互作。研究發(fā)現(xiàn)，在m6A對RNA調控的基礎上，m6A去甲基化酶ALKBH5及讀取蛋白YTHDF2也存在翻譯后的類泛素化修飾調控。一方面，經類泛素化修飾后的YTHDF2對于m6A修飾的RNA具有更強的親和力，可促進其降解[87]，而m6A去甲基化酶ALKBH5在經磷酸化及類泛素化修飾之后活性顯著降低，并使DNA損傷修復相關蛋白表達量提高，減小了活性氧對DNA造成的損傷[88]；另一方面，m6A不僅在mRNA中發(fā)揮作用，同時還可影響非編碼RNA的剪接、折疊及成熟。在lncRNA中，m6A修飾可通過改變RNA構象增強其與異質性核糖核蛋白C(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein C，HNRNPC)的結合能力，并促進其成熟[34]。在細胞對miRNA的加工中也有類似發(fā)現(xiàn)，RNA結合蛋白HNRNPA2B1(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A2/B1)可特異性識別m6A并與其所在RNA片段結合，誘導pri-miRNA成熟[89]。

m6A甲基化修飾與組蛋白修飾之間聯(lián)系最為密切，組蛋白修飾作為經典的表觀修飾途徑之一，對于生物生長發(fā)育、疾病發(fā)生、炎癥及癌癥均有顯著影響。研究發(fā)現(xiàn)，H3K36me3的富集峰與m6A在轉錄本中的富集峰在分布上趨于一致，H3K36me3可被METTL14識別并直接結合，隨后在轉錄過程中促進甲基化酶復合物與RNA聚合酶Ⅱ結合，進而在轉錄過程中引導m6A在轉錄本中沉積[90]。m6A對組蛋白的修飾同樣具有顯著影響，如m6A水平下降可引起細胞中H3K27me2水平的整體下降[59]；m6A甲基化讀取蛋白YTHDF2能抑制白細胞介素6(interleukin 6，IL-6)基因啟動子區(qū)H3K27me3的去甲基化過程，影響炎癥因子的表達，從而影響細菌對宿主細胞的侵染過程[91]。上述研究不僅將m6A修飾與生物生命活動聯(lián)系起來，更證明了m6A修飾與各種表觀修飾之間的相互作用，豐富了表觀遺傳調節(jié)過程。

5 展 望

m6A作為RNA上豐度最高的表觀修飾形式，在人類及模式生物中已經開展了大量的研究工作，m6A已被證實在生長發(fā)育、繁殖及免疫等眾多生物過程中發(fā)揮著重要的調控作用。因此，m6A可能會影響畜禽生長發(fā)育等很多過程，m6A在畜禽復雜性狀形成中所發(fā)揮的作用及m6A與其他表觀修飾間的互作有待進一步深入探究。盡管目前m6A測序仍然存在費用昂貴、高通量測序所需的RNA起始量較多等缺陷，但相信在不久后的將來，隨著測序技術的不斷改進與提升，畜禽上m6A方面的數(shù)據將得到不斷擴充，這將有助于今后對畜禽繁殖過程的解析及遺傳改良策略的優(yōu)化。