楊陸可,王 浩,高鈺杰,嚴(yán) 雪,母 丹,林文雄**,方長旬,2**

(1.福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所/福建省農(nóng)業(yè)生態(tài)過程與安全監(jiān)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 福州 350002;2.作物生態(tài)與分子生理學(xué)福建省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(福建農(nóng)林大學(xué)) 福州 350002)

植物化感作用是一種普遍的生態(tài)學(xué)現(xiàn)象,廣泛存在于農(nóng)田、森林、海洋等生態(tài)系統(tǒng)中,農(nóng)作物、林木、藻類等不同類型的植物均具有化感品種。在農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng),化感水稻(L.)的根系分泌大量的酚酸類、黃酮類、二萜類等化感物質(zhì)抑制周圍雜草的生長。研究表明,化感水稻田間抑草率可達(dá)30%～40%,且對水稻產(chǎn)量和品質(zhì)的影響小。利用化感水稻控制雜草也是可持續(xù)生態(tài)農(nóng)業(yè)的一種發(fā)展趨勢。

酚酸類化合物是一類重要的水稻化感物質(zhì)。化感水稻‘PI312777’的酚酸含量極顯著高于非化感水稻‘Lemont’,其中6 葉期‘PI312777’的酚酸含量達(dá)710 μg?株。這些化感物質(zhì)還能與土壤中特定的微生物相互作用,增強(qiáng)抑草能力。研究發(fā)現(xiàn),化感水稻分泌的阿魏酸與黏細(xì)菌相互作用對稗草[(L.) Beauv.]抑制率達(dá)64.82%,顯著高于單獨(dú)阿魏酸(34.64%)及單獨(dú)黏細(xì)菌(8.26%)的化感作用。酚酸類化合物由苯丙烷代謝途徑合成,苯丙氨酸解氨酶(PAL)是該途徑的關(guān)鍵酶。化感水稻的基因表達(dá)水平顯著高于非化感水稻,這與兩種水稻中基因啟動(dòng)子的活性密切相關(guān)。李蘭蘭等比較了‘PI312777’和‘Lemont’中相同基因成員的啟動(dòng)子活性差異,結(jié)果發(fā)現(xiàn)‘PI312777’中第2 染色體的第3 個(gè)成員基因()啟動(dòng)子的活性高于 ‘Lemont’,并推測這是導(dǎo)致‘PI312777’中酚酸類化合物含量高于非化感水稻‘Lemont’的原因之一; 過量表達(dá)后水稻的酚酸類化合物總量增加,抑草能力提高。此外,茉莉酸甲酯(MeJA)和水楊酸甲酯(MeSA)等小分子物質(zhì)誘導(dǎo)可增強(qiáng)基因的表達(dá),促進(jìn)酚酸類化合物的積累。

植物體內(nèi)酚酸等次生物質(zhì)的合成與轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控作用有關(guān)。MYB 是一類能夠調(diào)控次生代謝的轉(zhuǎn)錄因子。植物中的MYB 轉(zhuǎn)錄因子根據(jù)MYB 域內(nèi)相鄰重復(fù)序列的數(shù)量分為4 種類型,分別為1R-MYB、R2R3-MYB、3R-MYB 和4R-MYB,它們分別含有1 個(gè)、2 個(gè)、3 個(gè)和4 個(gè)MYB 重復(fù)序列。在這4種類型中,R2R3-MYB 因子是MYB 家族的主要成員,參與調(diào)控次生代謝相關(guān)基因的表達(dá)。研究表明,組成型表達(dá)能促進(jìn)玉米(L.)中阿魏酸和綠原酸的積累; 在煙草(L.)、馬鈴薯(L.)、番茄(L.)和雪蓮[(Kar.et Kir).Sch.-Bip.] 4 種植物中分別組成型表達(dá)的馬鈴薯、、基因和擬南芥(L.)中的基因也促使綠原酸含量的增加。葡萄(L.)的也參與了苯丙烷代謝途徑。在擬南芥中,MYB11、MYB12、MYB111 等R2R3-MYB 類 型 的MYB 轉(zhuǎn)錄因子能夠調(diào)控查耳酮異構(gòu)酶、黃烷酮3-羥化酶和黃酮醇合成酶1 的基因表達(dá),這些基因參與了類黃酮的生物合成,從而調(diào)控植物黃酮類化合物積累。利用轉(zhuǎn)錄激活因子VP64 增強(qiáng)水稻中的表達(dá)后,水稻苯丙烷途徑中、、和基因也上調(diào)表達(dá),L-苯丙氨酸含量增加,水稻對稗草的抑制率提高。對MYB57 轉(zhuǎn)錄調(diào)控的基因進(jìn)行研究,結(jié)果顯示MYB57轉(zhuǎn)錄調(diào)控的表達(dá),MAPK11 可與PAL2;3相互作用從而調(diào)控水稻酚酸類化感物質(zhì)的合成。在此基礎(chǔ)上,揭示調(diào)控基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子能夠進(jìn)一步明確水稻化感作用特性形成的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。據(jù)此,本文利用DNA-pull Down 分離了調(diào)控基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子,并研究其外源調(diào)控方式,認(rèn)識MYB57 調(diào)控水稻化感作用的作用網(wǎng)絡(luò)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試水稻材料為國際公認(rèn)的化感水稻品種 ‘PI312777’和非化感水稻品種‘Lemont’,供試受體材料為稗草。

1.2 供試水稻材料的種植

取‘PI312777’和‘Lemont’水稻種子,用25% NaClO表面消毒30 min 后清洗干凈,加入滅菌水于30 ℃培養(yǎng)箱中浸泡16 h。倒掉無菌水,在恒溫培養(yǎng)箱中30 ℃催芽,期間保持種子濕潤。待水稻長至高度約5 cm時(shí)將其移栽至KT 板(4×8 孔)上,每板種植16 棵,后放置于培養(yǎng)盆(70 cm×40 cm×30 cm) 中進(jìn)行水培,光照強(qiáng)度360 μmol?m?s,相對濕度80%～85%,盆的外表均勻涂黑以防止產(chǎn)生綠藻,每周更換新鮮配制的完全營養(yǎng)液。水稻長至3 葉一心時(shí),將提前萌發(fā)好長勢一致的稗草(長出2～3 葉,株高4～5 cm 左右)種植在剩余的16 孔中,稗草與水稻在盆中對稱種植,對照組種植32 株水稻,繼續(xù)在溫室中培養(yǎng)。處理和對照各4 個(gè)重復(fù)。

在與稗草共培處理1 d、3 d、5 d、7 d 后,分別取樣水稻的倒二片完全展開的功能葉和根系,液氮速凍,用于基因組DNA、總RNA 以及葉片可溶性總蛋白的提取。

1.3 茉莉酸甲酯處理化感水稻‘PI312777’和非化感水稻‘Lemont’

將萌發(fā)的‘PI312777’和‘Lemont’種子種植于96孔板,每板種植30 棵,并置于1 L 黑色塑料盆中培養(yǎng),每周更換營養(yǎng)液。待長至3 葉一心時(shí),分別添加終濃度為0.01 mmol?L、0.02 mmol?L、0.05 mmol?L、0.1 mmol?L和0.2 mmol?L茉莉酸甲酯(MeJA)于水稻完全營養(yǎng)液中作為處理組,以不添加MeJA 為對照組,處理組與對照組均設(shè)4 個(gè)重復(fù)。在處理1 d、3 d、5 d 和7 d 時(shí),分別取處理組和對照組水稻根系和倒二片完全展開的功能葉,液氮速凍,用于提取總RNA 和蛋白。

1.4 OsMYB57 基因啟動(dòng)子克隆及其轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子分離

采用植物基因組DNA 提取試劑盒(CW0553S,北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)提取水稻‘PI312777’和‘Lemont’的基因組DNA。采用5′端帶生物素(biotin)標(biāo)記的引物-promoter-F:5′-GCAGTA ACAAGCTAACAGCAGCTGG-3′與-promoter-R:5′-CTTCTTTTGCTTCCTCCCTCCTGAG-3′分別從兩種水稻的基因組DNA 中擴(kuò)增基因啟動(dòng)子用于 DNA-pull down 獲得啟動(dòng)子的結(jié)合蛋白。DNA-pull down 根據(jù)Fang 等方法,提取‘PI312777’和‘Lemont’葉片的可溶性蛋白,使用Dynabeads kilobaseBINDER? Kit (Invitrogen,Thermo Fisher Scientific)試劑盒收集DNA 片段中結(jié)合的蛋白質(zhì)并進(jìn)行SDS-PAGE,切取目標(biāo)蛋白條帶酶解,蛋白質(zhì)鑒定在質(zhì)譜儀器 Q-Exactive HF (Thermo Scientific)上進(jìn)行。

1.5 qPCR 檢測OsMYB57 基因啟動(dòng)子結(jié)合蛋白的基因表達(dá)量

采用TRIzol 法分別提取稗草共培以及茉莉酸甲酯處理1 d、3 d、5 d 和7 d 的‘PI312777’與‘Lemont’水稻葉片、根系的總 RNA 并純化,總RNA 經(jīng)Easy-Script One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix 試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司)逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。以MYB57 啟動(dòng)子結(jié)合蛋白的編碼基因序列為模板設(shè)計(jì)qPCR 引物,并以肌動(dòng)蛋白(actin)基因?yàn)閮?nèi)參基因(表1)。按照TransStart Tip Green qPCR SuperMIX 試劑盒說明書(北京全式金生物技術(shù)有限公司)配置qPCR 反應(yīng)體系,qPCR 在realplex熒光定量PCR 儀(Eppendorf,Germany)中完成,根據(jù)生成的閾值(CT 值),運(yùn)用2法計(jì)算基因的相對表達(dá)量。

表1 本研究中采用的qPCR 引物Table 1 qPCR primers used in this study

1.6 不同濃度茉莉酸甲酯處理下水稻的蛋白表達(dá)量檢測

采用TCA 丙酮法提取蛋白,并在10%/的聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白。采用濕轉(zhuǎn)(80 V,2 h)的方法將蛋白條帶固定于PVDF 膜上,5%脫脂牛奶封閉過夜后,分4 組與MYB57、MAPK11、PAL2;3 和Actin 的特異抗體分別孵育1.5 h。MYB57、MAPK11和PAL2;3 的二抗采用Goat Anti-Rabbit IgG (H+L),actin 的二抗使用Goat Anti-Mouse IgG (H+L),孵育1.5 h 后進(jìn)行ECL (electrochemiluminescence)顯色,并于ChemiDoc MP (Biorad)中進(jìn)行成像。

1.7 不同濃度茉莉酸甲酯處理下水稻分泌液的抑草率評價(jià)

將稗草種子萌發(fā),培養(yǎng)方式同1.3。分別將不同濃度茉莉酸甲酯處理的兩種水稻的根系液進(jìn)行過濾除雜后各收集1.5 L 濾液,然后將長至兩葉一心的稗草分別種植于上述收集的水稻根系液中,每種處理種植25 棵稗草并添加500 mL 濾液,種植第14 d 后對各處理稗草根和葉的長度進(jìn)行測定。將根莖分開殺青,烘干至恒重后測量其干重,并計(jì)算抑制率(%)。抑制率計(jì)算公式為 IR=(1?TR/CK)×100%。其中IR為抑制率(inhibitory ratio),TR 為處理組生長指標(biāo)(treatment),CK 為對照組生長指標(biāo)(control)。數(shù)據(jù)采用DPS 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 OsMYB57 基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子

通過DNA-pull down 獲得‘PI312777’和‘Lemont’的基因啟動(dòng)子所結(jié)合的蛋白,SDS-PAGE檢測結(jié)果顯示,‘PI312777’和‘Lemont’的基因啟動(dòng)子DNA 上均含有結(jié)合蛋白,對照組未經(jīng)生物素標(biāo)記的基因啟動(dòng)子DNA 上未檢測到結(jié)合蛋白(圖1)。

圖1 ‘PI312777’和‘Lemont’水稻中OsMYB57 基因啟動(dòng)子的結(jié)合蛋白Fig.1 Proteins binding on the promoter of OsMYB57 from rice varieties ‘PI312777’ and ‘Lemont’

對啟動(dòng)子上結(jié)合的蛋白進(jìn)行質(zhì)譜鑒定和分析,結(jié)果從‘PI312777’水稻的基因啟動(dòng)子的結(jié)合蛋白中鑒定到具有結(jié)合DNA 功能的蛋白,包括轉(zhuǎn)錄因子basic helix-loop-helix protein 009 (基因:)、LOC_Os04g32590.1 (基因:)、LOC_Os0 2g31160.1 (基因:)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子LOC_Os03g25430.1 (基因:)和LOC_Os03g 50110.1 (基因:); 在‘Lemont’水稻的基因啟動(dòng)子鑒定到具有結(jié)合DNA 功能的蛋白,包括轉(zhuǎn)錄因子LOC_Os04g32590.1、LOC_Os0 2g31160.1 和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子LOC_Os03g25430.1 (表2)。

表2 ‘PI312777’和‘Lemont’水稻中OsMYB57 基因啟動(dòng)子上的結(jié)合蛋白鑒定結(jié)果Table 2 Identification of the proteins binding on the OsMYB57 gene promoter from rice varieties ‘PI312777’ and ‘Lemont’

2.2 OsMYB57 基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄因子的基因表達(dá)量

基因表達(dá)由生物體內(nèi)反式作用因子(轉(zhuǎn)錄因子)作用于順式作用原件(啟動(dòng)子區(qū)域)所決定。對稗草共培下的‘PI312777’和‘Lemont’中的基因啟動(dòng)子上結(jié)合的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的基因表達(dá)量進(jìn)行檢測,qPCR 結(jié)果顯示,稗草共培下的‘PI312777’水稻根系和葉片中的、、和基因表達(dá)都較其單獨(dú)培養(yǎng)的對照組上調(diào),具體表現(xiàn)為先上升后下降,且在根中的上調(diào)表達(dá)量明顯高于葉。在根中,和在5 d 時(shí)上調(diào)表達(dá)量最高,分別上調(diào)100.19 倍、146.44 倍和23.98 倍; 其在相同處理下的‘Lemont’根系中分別上調(diào)4.95 倍、10.22 倍和9.36 倍。稗草脅迫下的‘Lemont’葉片中這3 個(gè)基因的上調(diào)表達(dá)倍數(shù)較大,其在共培5 d 處理組中,表達(dá)量分別上調(diào)35.11 倍、50.53 倍和40.97 倍(圖2)。

圖2 稗草脅迫下‘PI312777’和‘Lemont’水稻中OsMYB57 基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的動(dòng)態(tài)表達(dá)Fig.2 Dynamic gene expression levels of transcriptional regulators of OsMYB57 in rice varieties ‘PI312777’ and ‘Lemont’ co-cultured with barnyardgrass

2.3 茉莉酸甲酯處理下水稻根系中基因的動(dòng)態(tài)表達(dá)

bHLH009 是茉莉酸(JA)信號途徑的調(diào)節(jié)蛋白,在JA 介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中起重要作用。采用qPCR分別檢測了茉莉酸甲脂(MeJA)處理1 d、3 d、5 d 和7 d ‘PI312777’和‘Lemont’根系中的較其各自對照組的表達(dá)變化。在‘PI312777’根系中,不同濃度茉莉酸甲酯處理促進(jìn)了這5 個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的基因表達(dá),其中0.05 mmol?L、0.10 mmol?L和0.20 mmol?L的MeJA 對基因表達(dá)的促進(jìn)效果較為明顯,0.05 mmol?LMeJA 誘導(dǎo)7 d 的‘PI312777’中和基因的表達(dá)量為相同天數(shù)對照組的2.67 倍、5.66 倍、4.90 倍、3.18倍和3.21倍; 0.10 mmol?LMeJA 誘導(dǎo)7 d處理組分別為對照組的97.39 倍、378.72 倍、159.97 倍、243.59 倍和146.94倍; 0.20 mmol?LMeJA誘導(dǎo)組分別為對照組的28.36 倍、244.72 倍、54.95 倍、30.91 倍 和35.82 倍(圖3a-e)。

在‘Lemont’中,MeJA 對上述5 個(gè)基因的誘導(dǎo)作用不及相同處理下的‘PI312777’中上調(diào)表達(dá)程度,0.01 mmol?LMeJA 處理1 d 的‘Lemont’根系中基因上調(diào)表倍數(shù)最大,分別為對照組的39.01 倍、28.99 倍和36.69 倍; 0.20 mmol?LMeJA 處理3 d 的‘Lemont’根系中的上調(diào)表達(dá)倍數(shù)最大,為對照組的16.33 倍和53.26 倍(圖3f-j)。

圖3 不同濃度茉莉酸甲酯處理不同時(shí)間‘PI312777’和‘Lemont’水稻根系中基因的動(dòng)態(tài)表達(dá)Fig.3 Dynamics of gene expression level in the root of ‘PI312777’ and ‘Lemont’ under treatments of different concentrations of methyl jasmonate

2.4 茉莉酸甲酯處理下水稻葉片中基因的動(dòng)態(tài)表達(dá)

qPCR 同時(shí)檢測了MeJA 誘導(dǎo)下的‘PI312777’和 ‘Lemont’葉片中和基因的動(dòng)態(tài)表達(dá)。結(jié)果顯示,葉片中的這些基因上調(diào)表達(dá)程度較其根系中低?！甈I312777’葉片中,MeJA 誘導(dǎo)7 d的基因上調(diào)表達(dá)程度相對較大,其中以0.02 mmol?LMeJA 處理的效果最明顯,5 個(gè)基因分別較對照組上調(diào)4.71 倍、3.33 倍、7.25 倍、3.67 倍和4.25 倍(圖4a-e)。

在‘Lemont’葉 片 中,在0.10 mmol?LMeJA 誘導(dǎo)5 d 的上調(diào)表達(dá)倍數(shù)最大,為對照組的4.94 倍;和基 因分 別在0.05 mmol?L和0.20 mmol?LMeJA 處理7 d 時(shí)的上調(diào)表達(dá)倍數(shù)最大,為對照組的14.70 倍和4.09 倍; 而0.05 mmol?LMeJA 處理3 d 對和基因表達(dá)的誘導(dǎo)效果最明顯,分別為對照組的18.06 倍和20.22 倍(圖4f-j)?？梢?MeJA 處理后,‘Lemont’水稻葉片中的這5 個(gè)基因的響應(yīng)作用存在較大差異。

圖4 不同濃度茉莉酸甲酯處理不同時(shí)間‘PI312777’和‘Lemont’水稻葉片中基因的動(dòng)態(tài)表達(dá)Fig.4 Dynamics of gene expression level in the leaves of ‘PI312777’ and ‘Lemont’ under treatments of different concentrations of methyl jasmonate

2.5 茉莉酸甲酯處理下MYB57、PAL2;3 及MAPK11的蛋白表達(dá)

進(jìn)一步檢測了MeJA 誘導(dǎo)處理下,bHLH009 等轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控的下游基因,以及MYB57 蛋白調(diào)控的和基因編碼的蛋白表達(dá)量。0.10 mmol?L和0.20 mmol?LMeJA 處理下,‘Lemont’中MYB57 和MAPK11 蛋白表達(dá)量均明顯提高; PAL2;3 在處理組的表達(dá)量也高于其在對照組中的表達(dá),但不明顯。在PI312777 中,0.05 mmol?LMeJA 處理下MYB57 和MAPK11 及0.10 mmol?LMeJA 處理下的PAL2;3 蛋白表達(dá)量較對照組明顯提高。且‘PI312777’中的PAL2;3 和MYB57 的表達(dá)量均高于相同處理?xiàng)l件下的‘Lemont’。結(jié)果表明,MeJA 處理能夠誘導(dǎo)提高‘PI312777’和‘Lemont’中MYB57、PAL2;3 和MAPK11 蛋白的表達(dá)量,相同濃度的MeJA 對‘PI312777’的誘導(dǎo)作用大于對‘Lemont’的誘導(dǎo)作用(圖5)。

圖5 不同濃度茉莉酸處理不同時(shí)間‘PI312777’和‘Lemont’水稻中MYB57、PAL2;3 和MAPK11 蛋白的表達(dá)量Fig.5 Protein expression of MYB57,PAL2;3 and MAPK11 in ‘PI312777’ and ‘Lemont’ under treatments of different concentrations of methyl jasmonate for different days

2.6 不同濃度茉莉酸甲酯處理對兩水稻品種生長的影響

比較MeJA 處理下‘PI312777’和‘Lemont’的生長情況,結(jié)果顯示,隨著處理天數(shù)的增加,0.01 mmol?L、0.02 mmol?L和0.05 mmol?L濃度的MeJA 處理能促進(jìn)水稻的生長。但0.1 mmol?L和0.2 mmol?L濃度處理3 d 開始對兩品種水稻的生長產(chǎn)生抑制作用,即表現(xiàn)為低濃度促進(jìn)而高濃度抑制的生理現(xiàn)象,外源添加MeJA 的濃度不高于0.05 mmol?L時(shí),對兩品種水稻的生長具有一定的促進(jìn)作用(圖6)。

圖6 不同濃度茉莉酸甲酯(MeJA)處理不同時(shí)間 ‘PI312777’和‘Lemont’水稻的生長狀況Fig.6 Plant phenotype of ‘PI312777’ and ‘Lemont’ under treatmetns of different concentrations of methyl jasmonate (MeJA) for different days

2.7 茉莉酸甲酯處理下水稻根系分泌液的抑草率

進(jìn)一步測定了MeJA 對稗草生長的影響。結(jié)果顯示,與 未添加MeJA 的對照組相比,0.05 mmol?LMeJA 對稗草的根長和株高均不產(chǎn)生影響; 0.10 mmol?LMeJA 對稗草的根長不產(chǎn)生影響,但顯著抑制了稗草的株高; 0.20 mmol?LMeJA 對稗草的根長和株高均具有顯著的抑制作用(圖7)。

圖7 不同濃度茉莉酸甲酯(MeJA)對稗草生長的影響Fig.7 Effect of different concentrations of methyl jasmonate (MeJA) on barnyardgrass growth

隨著MeJA 添加濃度的增大,‘PI312777’和‘Lemont’根系分泌液對稗草株高的抑制作用不斷增強(qiáng),并且都在0.20 mmol?LMeJA 處理下抑制稗草株高最明顯; 隨添加MeJA 濃度的提高,增強(qiáng)了‘PI312777’根系分泌液對稗草根長的抑制效果,但對‘Lemont’根系分泌液抑制稗草根長則作用不明顯(圖8)。

圖8 不同濃度茉莉酸甲酯處理下‘PI312777’ (PI)和‘Lemont’ (Le)水稻根系分泌液對稗草生長的影響Fig.8 Effect of root exudates of ‘PI312777’ (PI) and ‘Lemont’ (Le) rice induced by different concentrations of methyl jasmonate(MeJA) on barnyardgrass growth

圖9 結(jié)果可以看出,在化感水稻‘PI312777’中,0.05 mmol?L、0.10 mmol?L和0.20 mmol?LMeJA處理的根系分泌液對稗草地上部分干重的抑制率為25.82%、30.52%和32.59%,表現(xiàn)出隨添加 MeJA 濃度的提高抑制率增強(qiáng)的趨勢; 對稗草地下部分干重的抑制率分別為17.01%、30.65 %、30.02%。在非化感水稻‘Lemont’中,上述3 種MeJA 濃度處理的根系分泌液對稗草地上部分干重的抑制率為5.30%、27.85%、35.50%,對稗草地下部分干重的抑制率分別為15.36%、15.13%、?6.44% (圖9)。上述結(jié)果表明,MeJA 能夠誘導(dǎo)增強(qiáng)水稻的化感作用,提高兩種水稻對稗草的抑制率。

圖9 不同濃度茉莉酸甲酯添加下的‘PI312777’和‘Lemont’水稻根系分泌液對稗草干重的抑制率Fig.9 Inhibitory rates of root exudates of ‘PI312777’ and ‘Lemont’ rice induced by different concentrations of methyl jasmonate(MeJA) to the dry weight of barnyardgrass

3 討論與結(jié)論

植物化感物質(zhì)合成與分泌作用是決定化感潛力的關(guān)鍵因素?；兴灸軌蛲ㄟ^苯丙氨酸代謝途徑合成酚酸類化合物對鄰近稗草產(chǎn)生化感抑制作用。苯丙氨酸解氨酶是苯丙氨酸代謝途徑的限速酶,其活性高低決定了水稻對酚酸類化感物質(zhì)的生物合成能力。植物體內(nèi)次生代謝物的合成受到多種轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。前期研究發(fā)現(xiàn)增強(qiáng)一個(gè)R2R3-MYB 轉(zhuǎn)錄因子基因的表達(dá)能夠使苯丙氨酸途徑中上調(diào)表達(dá);染色質(zhì)免疫共沉淀結(jié)果顯示MYB57 能夠通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因的表達(dá),MAPK11 再與PAL2;3蛋白發(fā)生相互作用,間接調(diào)控水稻的苯丙烷代謝,表明了有效調(diào)控水稻的化感抑草能力。

化感作用關(guān)聯(lián)基因表達(dá)的強(qiáng)度與其啟動(dòng)子上轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控密切相關(guān)。對‘PI312777’和‘Lemont’的基因啟動(dòng)子上的轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行研究,在 ‘PI312777’的基因啟動(dòng)子的結(jié)合蛋白中鑒定到LOC_Os04g32590.1、LOC_Os02g31160.1、LOC_Os03g25430.1、bHLH009 等具有轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用的蛋

白,在‘Lemont’的基因啟動(dòng)子的結(jié)合蛋白中鑒定到LOC_Os04g32590.1、LOC_Os02g31160.1、LOC_Os03g25430.1 等具有轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用的蛋白。其中,bHLH009 屬bHLH-TFs 轉(zhuǎn)錄因子家族,是茉莉酸(JA)信號途徑的調(diào)節(jié)蛋白,參與多種生物以及非生物脅迫響應(yīng)過程。大量研究表明,JA 能通過與其他激素或轉(zhuǎn)錄因子間的互作完成很多發(fā)育過程的調(diào)控。MYC 參與調(diào)控大量JA 響應(yīng)基因,能夠與JAZ 蛋白結(jié)合,是JAZ 抑制劑的靶點(diǎn)。MYC2 是第一個(gè)被報(bào)道的家族成員,它與MYC3、MYC4 和MYC5 共同作用,響應(yīng)JA 并介導(dǎo)調(diào)控植物生理過程,如根系生長抑制、肥力以及對病原體和昆蟲的抗性,MYCs 因而被認(rèn)為是連結(jié)環(huán)境和植物反應(yīng)的重要樞紐。稗草脅迫下,‘PI312777’和‘Lemont’水稻中的基因表達(dá)均上調(diào),表明稗草作為環(huán)境脅迫因子能夠觸發(fā)水稻的JA 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑; 與‘Lemont’相比,‘PI312777’根系中基因的上調(diào)表達(dá)增加倍數(shù)更為顯著,可見‘PI312777’對稗草脅迫的響應(yīng)作用更加靈敏,有利于‘PI312777’化感抑草作用的形成。此外,‘PI312777’與‘Lemont’相比,其基因的上調(diào)表達(dá)倍數(shù)更高,使得bHLH009 轉(zhuǎn)錄調(diào)控的基因在‘PI312777’中的表達(dá)豐度也高于其在‘Lemont’中的表達(dá),這也從一方面解釋了化感水稻 ‘PI312777’中基因表達(dá)水平較高的原因。

外源添加MeJA 處理下,‘PI312777’和‘Lemont’中的基因上調(diào)表達(dá),其在根系中的上調(diào)表達(dá)倍數(shù)高于葉片中的上調(diào)倍數(shù),且隨著MeJA 添加濃度的提高,基因上調(diào)表達(dá)倍數(shù)增加,并以0.10 mmol?L濃度處理的誘導(dǎo)效果最為顯著,bHLH009 轉(zhuǎn)錄調(diào)控的下游基因以及與MYB57 相互作用的MAPK11 的基因和蛋白表達(dá)水平也隨著上調(diào)。外源MeJA 處理下及MAPK11 的表達(dá)變化表明了化感水稻中基因?qū)A 信號的有效響應(yīng)以及JA 信號分子誘發(fā)的調(diào)控作用。MeJA 誘導(dǎo)也促進(jìn)了水稻根系分泌化感物質(zhì),其中0.20 mmol?L的MeJA 誘導(dǎo)使得‘PI312777’的化感抑草能力提高效果最為顯著,但該濃度對水稻的生長也產(chǎn)生一定的抑制作用; 0.05 mmol?LMeJA 對水稻生長還有一定的促進(jìn)作用。Bi 等研究了外源分別施用MeJA 和水楊酸甲酯(MeSA)對水稻化感作用的影響,結(jié)果也顯示MeJA 和MeSA 處理均提高了水稻PAL 酶和肉桂酸4-羥化酶(C4H)的基因表達(dá)豐度和酶活,促進(jìn)了水稻酚類物質(zhì)的積累,且水稻葉片提取液對稗草的抑制作用也增強(qiáng)。Fang等采用RNA 干擾和基因過量表達(dá)技術(shù)分別抑制和增強(qiáng)了‘PI312777’的JA 合成關(guān)鍵基因(allene oxide cyclase)表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達(dá)基因使得水稻的內(nèi)源JA 含量增加,、、等苯丙烷代謝相關(guān)基因上調(diào)表達(dá),水稻中原兒茶酸、對羥基苯甲酸、阿魏酸、苯甲酸和肉桂酸等酚酸類化合物含量增加,水稻化感抑制稗草作用提高; 抑制表達(dá)則結(jié)果相反。這些結(jié)果也證實(shí)了JA 及其合成對水稻化感抑草能力的調(diào)控作用。本研究在此基礎(chǔ)上,進(jìn)一步揭示了化感水稻響應(yīng)JA 的受體蛋白bHLH009 及其下游調(diào)控基因,從而促進(jìn)酚酸類化感物質(zhì)合成的分子機(jī)制。此外,已有的研究表明,MeJA 或JA 處理能夠提高水稻抗蟲性和抗機(jī)械損傷等,但對水稻的產(chǎn)量則具有抑制作用; 因此,如何合理噴施MeJA 提高水稻抗性并盡量降低其對水稻產(chǎn)量的影響,是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實(shí)踐中值得進(jìn)一步深入探索的問題。

綜上所述,基因的表達(dá)受bHLH009 轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控; 稗草脅迫下,‘PI312777’中基因上調(diào)表達(dá)且高于‘Lemont’,體現(xiàn)了‘Lemont’和‘PI312777’對稗草脅迫信號響應(yīng)的靈敏性差異。bHLH009 是JA 信號途徑的調(diào)節(jié)蛋白,外源添加MeJA 能夠提高基因的表達(dá),MYB57、MAPK11 和PAL2;3 蛋白的表達(dá)水平也提高,有利于促進(jìn)水稻根系分泌酚酸類化感物質(zhì),提高水稻對稗草的化感抑制作用; 其中添加0.05 mmol?LMeJA 不會(huì)抑制水稻生長，且有效提高水稻化感抑草能力。上述結(jié)果揭示了稗草脅迫下,化感水稻通過JA 途徑調(diào)控MYB57 表達(dá),促進(jìn)水稻合成酚酸類化感物質(zhì)抑制稗草生長的轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程與機(jī)制。