廖立 田衛(wèi)東

口腔疾病研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 國(guó)家口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心 口腔轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)教育部工程研究中心 口腔再生醫(yī)學(xué)國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室 四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院創(chuàng)傷整形外科，成都610041

感染、炎癥、外傷、手術(shù)等多種因素均可導(dǎo)致口腔頜面部組織的缺損和缺失發(fā)生率高，嚴(yán)重?fù)p害患者身心健康。目前，牙髓壞死、牙周組織破壞、頜骨缺損和頜面部軟組織缺損等是采用非生理性修復(fù)或生物材料替代，無法實(shí)現(xiàn)組織再生和生理結(jié)構(gòu)的重建。為突破口腔頜面部組織再生修復(fù)面臨的技術(shù)瓶頸，亟需尋求新的生物治療策略。

間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是廣泛分布于骨、脂肪、牙髓、牙周膜等結(jié)締組織中的一類重要的成體干細(xì)胞，具有強(qiáng)大的自我更新和多向分化潛能，在局部組織發(fā)育、穩(wěn)態(tài)維持、修復(fù)和再生中發(fā)揮關(guān)鍵作用[1]。MSCs能從體內(nèi)獲取并在體外進(jìn)行擴(kuò)增，目前已被應(yīng)用于骨、軟骨、皮膚、肌肉等多種組織的再生修復(fù)[1-2]。雖然基于MSCs的細(xì)胞治療已在多種組織再生中取得顯著的療效，但制備困難、保存和運(yùn)輸、細(xì)胞異質(zhì)性、長(zhǎng)期體內(nèi)存活引起的潛在風(fēng)險(xiǎn)和倫理問題等限制了其臨床使用。目前干細(xì)胞治療仍局限于缺乏有效治療手段的危重病癥，難以廣泛推廣。

研究證實(shí)，MSCs主要通過三條途徑促進(jìn)組織再生：1）直接分化為組織細(xì)胞；2）通過免疫調(diào)節(jié)功能改善局部再生微環(huán)境；3）通過釋放多種生物活性成分，促進(jìn)組織再生[1,3-4]。其中，MSCs的旁分泌作用越來越受到關(guān)注。研究者逐漸聚焦于解析MSCs分泌的關(guān)鍵生物活性成分，探索無細(xì)胞的治療策略，以克服MSCs細(xì)胞治療中面臨的限制[5]。

最新研究[6]證實(shí)，胞外囊泡（extracellular vesi‐cles，EVs）是MSCs的重要分泌成分之一，在MSCs介導(dǎo)的多種組織修復(fù)再生中發(fā)揮關(guān)鍵作用。研究者們[6-7]廣泛探索了MSCs分泌的EVs（MSCEVs）在骨、脂肪、心肌、神經(jīng)及多種口腔組織再生中的作用，證明MSC-EVs是一類具有臨床轉(zhuǎn)化潛力的重要生物活性物質(zhì)。與MSCs細(xì)胞治療在應(yīng)用上相比，MSC-EVs具有成分簡(jiǎn)單、作用途徑明確、低免疫原性、致瘤風(fēng)險(xiǎn)低、易儲(chǔ)存、可避免倫理問題等多種優(yōu)勢(shì)，且無需考慮細(xì)胞存活和異常分化等問題。據(jù)此，MSC-EVs可能成為一種全新的無細(xì)胞治療手段用于組織再生，從而有效規(guī)避MSCs在應(yīng)用上的限制，推動(dòng)再生醫(yī)學(xué)的進(jìn)展。目前，全球已注冊(cè)的EVs臨床研究已超過200項(xiàng)，其中有2項(xiàng)應(yīng)用EVs治療口腔疾病的研究已開始招募志愿者。隨著基礎(chǔ)科學(xué)研究和產(chǎn)品應(yīng)用開發(fā)的推動(dòng)，EVs有望在組織再生、藥物輸送、免疫治療和疾病診斷等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。因此，本文對(duì)近年來MSC-EVs在口腔組織再生中的基礎(chǔ)研究及應(yīng)用探索進(jìn)行總結(jié)，并對(duì)MSC-EVs在轉(zhuǎn)化應(yīng)用中面臨的問題展開討論和展望，以期推動(dòng)相關(guān)研究及轉(zhuǎn)化應(yīng)用。

1 MSC-EVs的定義、分類和基本成分

1.1 EVs的定義和分類

EVs是由細(xì)胞產(chǎn)生并分泌到細(xì)胞外的一類帶有脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)的小囊泡。細(xì)胞分泌的EVs具有明顯的異質(zhì)性，根據(jù)產(chǎn)生機(jī)制的不同可分為外泌體（exosomes）、微囊泡（micro vesicles）和凋亡小體（apoptotic body）三類。其中，外泌體是通過膜內(nèi)吞途徑產(chǎn)生，粒徑大小為40～200 nm，平均粒徑在100 nm，表達(dá)四次跨膜蛋白超家族、Alix、tumor susceptibility 101（TSG101）等特異性的標(biāo)志物。微囊泡是通過細(xì)胞膜向胞外而突出形成小泡，并釋放入細(xì)胞外，粒徑大小為200～2 000 nm，表達(dá)整合素、選擇素、CD40等標(biāo)志物。凋亡小體則是在細(xì)胞凋亡過程中通過胞膜皺縮內(nèi)陷，分割包裹胞質(zhì)而形成[8]。因?yàn)榈蛲鲂◇w具有一定的特殊性，本文僅集中探討MSCs分泌的外泌體及微囊泡。

因?yàn)槠涮赜械漠a(chǎn)生方式，EVs含有豐富的蛋白、脂質(zhì)、核酸（miRNA、mRNA、DNA）等生物活性物質(zhì)[9]。更重要的是，釋放入胞外的EVs可以通過表面特異的配體/受體結(jié)合或者非特異吸附的方式與靶細(xì)胞結(jié)合，通過胞吞作用、微胞飲作用、內(nèi)吞作用等多種方式將其攜帶的物質(zhì)運(yùn)送入靶細(xì)胞內(nèi)，調(diào)節(jié)靶細(xì)胞功能，從而發(fā)揮細(xì)胞間信息交流的作用[10]。

1.2 MSCs分泌豐富的EVs

研究證實(shí)，骨髓、脂肪、臍帶以及牙髓、牙周膜、頜骨等組織來源的MSCs，均能夠分泌數(shù)量豐富的外泌體和微囊泡。已有多項(xiàng)研究[11-12]對(duì)MSC-EVs的成分進(jìn)行了系統(tǒng)性的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)MSCs-EVs中含有多種生物活性物質(zhì)，主要包括蛋白（轉(zhuǎn)錄因子、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子和酶等）、RNA（mRNA、siRNNA、miRNA等）、DNA（ss‐DNA、dsDNA等）和脂類（花生四烯酸、二十二碳六烯酸、磷脂酸、溶血卵磷脂等）。

因?yàn)槠洚a(chǎn)生方式，MSC-EVs攜帶的物質(zhì)與MSCs有一定程度的相似性，含有多種MSCs的特有成分和活性物質(zhì)。通過比較MSCs和MSCs來源EVs中的蛋白質(zhì)表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在MSCs表達(dá)的總共6 342種蛋白中，有1 927種也表達(dá)于EVs[12]。而功能學(xué)研究也證明EVs的生物學(xué)活性往往與其來源的MSCs是相似的，同樣具有促增殖、抗凋亡、促進(jìn)血管形成和免疫調(diào)節(jié)等多種功能。

需要注意，不同組織來源和不同狀態(tài)下MSCs分泌的EVs中的成分存在差異，可能導(dǎo)致其具有完全不同的生物學(xué)活性[13]。如牙髓來源MSC-EVs與骨髓來源MSC-EVs具有不同的免疫調(diào)節(jié)功能[14]；骨髓來源MSCs-EVs可促進(jìn)干細(xì)胞向成骨方向分化，而脂肪來源的MSC-EVs更有利于干細(xì)胞向成脂方向分化[15]。也有研究[16]報(bào)告，骨質(zhì)疏松患者來源的骨髓MSCs高表達(dá)miR-21，從而具有抑制骨再生的作用；而在腫瘤等疾病中，骨髓MSCs分泌的EVs成分會(huì)發(fā)生改變，并促進(jìn)腫瘤形成[17]。因此，在本文中僅探討健康組織來源的MSC-EVs。

2 MSC-EVs具有促進(jìn)組織再生的功能

MSC-EVs可以被組織細(xì)胞、免疫細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等多種細(xì)胞所攝取和吞噬，從多個(gè)途徑影響組織再生修復(fù)的進(jìn)程。這種多因素的協(xié)同作用，可能是MSC-EVs具有強(qiáng)大促組織再生能力的關(guān)鍵。

2.1 MSC-EVs促進(jìn)組織細(xì)胞再生

2.1.1 細(xì)胞增殖功能 MSCs可以通過釋放EVs調(diào)控局部組織細(xì)胞的增殖，從而維持組織穩(wěn)態(tài)平衡和再生。研究[18]發(fā)現(xiàn)，在牙發(fā)育過程中，上皮與牙胚間充質(zhì)細(xì)胞之間通過EVs相互傳遞重要的信號(hào)物質(zhì)，調(diào)控細(xì)胞的有序擴(kuò)增，從而實(shí)現(xiàn)牙的正常發(fā)育。體外研究[19]也發(fā)現(xiàn)，牙囊MSC-EVs可以促進(jìn)炎癥狀態(tài)下牙周膜細(xì)胞的增殖，從而改善牙周炎狀態(tài)下的牙槽骨修復(fù)再生。

2.1.2 細(xì)胞分化 已有多項(xiàng)研究[15]證實(shí)了MSC-EVs具有促進(jìn)干細(xì)胞分化的作用?？傮w而言，MSCEVs的促分化功能與其來源細(xì)胞的譜系具有緊密聯(lián)系。如骨髓來源MSCs-EVs可有效促進(jìn)干細(xì)胞向成骨方向分化，脂肪來源MSCs-EVs可促進(jìn)細(xì)胞向成脂方向分化。但也有研究[20]發(fā)現(xiàn)同種MSCs來源的EVs可以促進(jìn)干細(xì)胞向不同的方向分化，可能與靶細(xì)胞的種類和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)所使用的誘導(dǎo)條件有關(guān)。

2.1.3 細(xì)胞存活 MSC-EVs具有維持細(xì)胞存活、減少細(xì)胞凋亡的功能。在缺氧、炎癥等病理?xiàng)l件下，MSC-EVs可通過維持組織細(xì)胞存活而促進(jìn)組織再生。在心肌缺血、下肢缺血等動(dòng)物模型中均觀察到，使用MSC-EVs可以有效地預(yù)防和減少局部組織細(xì)胞的凋亡，從而加速組織再生過程。其作用可能是通過減少細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激等途徑來實(shí)現(xiàn)[21]。

2.1.4 細(xì)胞遷移功能 多種組織來源的MSC-EVs均可以促進(jìn)成纖維細(xì)胞的遷移，并且呈現(xiàn)出一定的劑量效應(yīng)[22]。在皮膚創(chuàng)傷模型中，MSC-EVs通過加速局部細(xì)胞的遷移促進(jìn)皮膚缺損愈合[23]。其作用途徑是通過轉(zhuǎn)運(yùn)Wnt3α等細(xì)胞因子以及非編碼RNA等，提高組織細(xì)胞的遷移能力[23]。

2.2 血管及神經(jīng)再生作用

血管和神經(jīng)再生是組織再生的必需環(huán)節(jié)?？焖俚难茉偕椭亟梢詾榻M織細(xì)胞提供足夠的氧氣和營(yíng)養(yǎng)支持；而神經(jīng)再生可以通過神經(jīng)分泌因子促進(jìn)組織改建，并恢復(fù)組織器官感覺和運(yùn)動(dòng)功能。研究證明，EVs除直接促進(jìn)局部組織細(xì)胞的再生修復(fù)外，可同時(shí)促進(jìn)血管和神經(jīng)再生，從而加速組織修復(fù)。如脂肪MSC-EVs通過轉(zhuǎn)運(yùn)miRNA（miR-125a等）促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞介導(dǎo)的血管再生功能[24]；牙周膜MSC-EVs通過傳遞血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）等因子促進(jìn)血管再生[25]。骨髓MSC-EVs可以通過減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)而保護(hù)神經(jīng)元，減少神經(jīng)系統(tǒng)損傷[26]。

2.3 免疫調(diào)節(jié)功能

局部的炎癥和免疫反應(yīng)對(duì)組織再生具有重要影響。EVs可以通過與免疫細(xì)胞表面直接結(jié)合或?qū)?nèi)容物運(yùn)輸至免疫細(xì)胞內(nèi)部的方式，調(diào)控T細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞功能[27]。已有研究[28]發(fā)現(xiàn)MSC-EVs可促進(jìn)初始T細(xì)胞向Th17和Treg細(xì)胞分化，并調(diào)控巨噬細(xì)胞的極化，使損傷局部的炎癥細(xì)胞從發(fā)揮炎癥促進(jìn)作用轉(zhuǎn)變?yōu)榘l(fā)揮炎癥抑制作用，從而改善組織再生的微環(huán)境。

3 MSC-EVs在口腔組織再生中的應(yīng)用研究

EVs具有強(qiáng)大的生物活性和多種作用途徑，已被嘗試用于多種疾病治療[29]。此外，EVs可將多種活性分子攜帶入靶細(xì)胞內(nèi)，轉(zhuǎn)運(yùn)效率高于脂質(zhì)體等常規(guī)的藥物載體，并且不易被免疫系統(tǒng)所清除，可作為理想的藥物遞送載體。目前，MSC-EVs已被用于口腔頜面部組織再生的臨床前研究，并取得了較為理想的療效，展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景。

3.1 牙髓再生

MSC-EVs可以通過直接促進(jìn)牙髓干細(xì)胞/前體細(xì)胞的增殖分化和促進(jìn)牙髓血管再生兩條途徑來共同加快牙髓再生。研究[30]發(fā)現(xiàn)，人根尖牙乳頭MSC-EVs可促進(jìn)牙髓局部的MSCs增殖和向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化，從而促進(jìn)牙髓牙本質(zhì)復(fù)合體的再生；同時(shí)，MSC-EVs可以促進(jìn)牙髓中的內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移以及促血管形成功能[31]。Huang等[32]研究發(fā)現(xiàn)，牙髓細(xì)胞來源的EVs通過激活絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPK）通路促進(jìn)牙髓干細(xì)胞成骨分化；在體內(nèi)異位移植試驗(yàn)中，牙髓細(xì)胞來源EVs可促進(jìn)牙髓干細(xì)胞介導(dǎo)的牙髓再生[32]。本團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，除了MSC來源的EVs以外，人牙上皮細(xì)胞分泌的EVs也可調(diào)控人牙乳頭細(xì)胞功能，通過激活Wnt通路促進(jìn)人牙乳頭細(xì)胞成牙分化而實(shí)現(xiàn)牙髓再生[19]。

3.2 牙周組織再生

牙周炎所致炎癥微環(huán)境是導(dǎo)致局部干細(xì)胞功能異常和再生缺陷的關(guān)鍵。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)MSCEVs可以提高牙周炎組織中干細(xì)胞的成骨分化能力，減輕炎癥對(duì)于局部干細(xì)胞的抑制作用。本團(tuán)隊(duì)研究[19]證實(shí)，牙囊干細(xì)胞來源EVs可促進(jìn)炎癥下牙周膜MSCs的增殖能力，并恢復(fù)其成骨分化和遷移能力。利用包載牙囊干細(xì)胞EVs的水凝膠，可有效治療牙周炎所致頜骨缺損。此外，本團(tuán)隊(duì)還發(fā)現(xiàn)骨髓MSCs來源的EVs，可以通過調(diào)控骨保護(hù)素（osteoprotegerin，OPG）-核因子κB受體活化因子配體（receptor activator for nuclear factor-κB li‐gand，RANKL）-核因子κB受體活化因子（recep‐tor activator of nuclear factor-κB，RANK）信號(hào)通路抑制破骨細(xì)胞功能，并促進(jìn)巨噬細(xì)胞由M1型向M2型的轉(zhuǎn)化，從而緩解牙周炎所致的牙槽骨吸收[33]。

3.3 頜骨及軟骨再生

MSC-EVs對(duì)于骨再生修復(fù)具有促進(jìn)作用[34]。研究發(fā)現(xiàn)，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mes‐enchymal stem cells，BMSCs）來源的EVs與生物材料混合后移植可以促進(jìn)骨缺損再生修復(fù)，其機(jī)制主要是通過上調(diào)骨誘導(dǎo)性miRNA（miR-22-3p、miR-381-3p、miR-146a-5p、miR-503-5p、Hsa-miR-483-3p和Hsa-miR-129-5p）和下調(diào)骨抑制性miRNA（Hsa-miR-32-5p、Hsa-miR-133a-3p和Hsa-miR-204-5p），從而激活PI3K/Akt和MAPK等信號(hào)通路而發(fā)揮作用[35]。MSCs-EVs也可以通過轉(zhuǎn)運(yùn)長(zhǎng)鏈非編碼RNA而下調(diào)骨抑制性miRNA，間接促進(jìn)成骨分化[36]。因?yàn)镸SC-EVs同時(shí)具有促新骨形成和血管再生功能，有望應(yīng)用于頜骨缺損修復(fù)和頜骨壞死的治療[20]。

此外，MSC-EVs也具有促進(jìn)軟骨修復(fù)再生的功能。MSCs在成軟骨分化過程中分泌的EVs，可以提高BMSCs的成軟骨分化能力，可能用于軟骨修復(fù)再生[37]。其機(jī)制可能是MSCs分化過程中產(chǎn)生的EVs攜帶有多種成軟骨分化相關(guān)miRNA，從而進(jìn)入受體細(xì)胞后可調(diào)控其成軟骨分化[37]。有研究發(fā)現(xiàn)骨髓MSC-EVs可通過激活蛋白激酶B（pro‐tein kinase B，PKB），細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ex‐tracellular regulated protein kinases，ERK）及腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine monophosphate-acti‐vated protein kinase，AMPK）信號(hào)，抑制白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1 beta，IL-1β）造成的軟骨破壞，促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨的修復(fù)和再生，從而可應(yīng)用于顳下頜關(guān)節(jié)炎的治療[38]。

3.4 頜面部軟組織再生

頜面部皮膚、脂肪、黏膜等軟組織缺失缺損不僅影響正常生理功能，還嚴(yán)重影響面容、心理和生活。隨著人們對(duì)于生活品質(zhì)的追求不斷提高，頜面部的醫(yī)美手術(shù)和治療需求也快速增長(zhǎng)。臍帶等組織來源的MSC-EVs已被發(fā)現(xiàn)在皮膚創(chuàng)傷修復(fù)中具有較好效果，MSC-EVs可以激活Wnt通路并抑制轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（transforming growth factorβ，TGF-β）通路，在促進(jìn)傷口愈合的同時(shí)有效抑制局部成纖維細(xì)胞增生所致的瘢痕形成[39]。脂肪MSC-EVs能夠促進(jìn)脂肪再生和維持脂肪移植物的存活，并應(yīng)用于局部的軟組織缺損和移植充填[40]。也有研究[41]提示臍帶MSC-EVs具有一定的抗衰老作用，可通過傳遞增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）進(jìn)入衰老的骨髓MSCs中，從而逆轉(zhuǎn)干細(xì)胞的衰老。目前已有基于MSC-EVs的美容護(hù)膚產(chǎn)品上市，顯示出廣闊的應(yīng)用前景[42]。

綜上，MSC-EVs富含生物活性物質(zhì)，可在細(xì)胞間進(jìn)行高效的物質(zhì)遞送和信息交換。目前研究證實(shí)，多種MSCs來源的EVs不僅具有促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移和多向分化的能力，還能夠調(diào)控血管形成、神經(jīng)再生和改善局部微環(huán)境，通過多種途徑提高組織損傷修復(fù)和再生能力。目前MSC-EVs已被應(yīng)用于牙髓、牙周組織、頜骨、顳下頜關(guān)節(jié)、頜面軟組織等多種口腔頜面部組織的修復(fù)再生及疾病治療中，展現(xiàn)出較大的應(yīng)用潛力（圖1）。

圖1 MSC-EVs通過多種途徑促進(jìn)口腔頜面部組織再生Fig 1 MSC-EVs promote the regeneration of oral and maxillofacial tissue through multiple approaches

4 展望

雖然MSC-EVs在組織再生領(lǐng)域中的研究取得了快速進(jìn)展，學(xué)界和產(chǎn)業(yè)界也清醒的認(rèn)識(shí)到，MSC-EVs的大規(guī)模臨床應(yīng)用仍面臨多個(gè)重大的問題，需要進(jìn)一步的深入探索和科研攻堅(jiān)。

在基礎(chǔ)研究方面：MSC-EVs發(fā)揮組織再生功能的機(jī)制復(fù)雜，其中的關(guān)鍵活性成分尚待明確；目前的研究主要采用體外培養(yǎng)的MSCs所分泌的EVs，而MSCs在體內(nèi)原位分泌的EVs的作用仍需更先進(jìn)和精確的研究手段來探索；已有研究仍處于臨床前研究階段，尚無嚴(yán)格的循證醫(yī)學(xué)證據(jù)比較其與現(xiàn)有臨床治療手段之間的優(yōu)劣。在應(yīng)用研究方向：臨床級(jí)EVs的大規(guī)模生產(chǎn)、EVs的標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)、純化、制備和保存、針對(duì)EVs異質(zhì)性的精細(xì)制備和產(chǎn)品研發(fā)、EVs生產(chǎn)質(zhì)量控制等諸多核心環(huán)節(jié)仍面臨瓶頸問題[43]，需要進(jìn)一步研發(fā)和優(yōu)化MSC-EVs的提取和純化技術(shù)，改進(jìn)EVs的保存體系并進(jìn)行嚴(yán)格的驗(yàn)證。同時(shí)相關(guān)監(jiān)管機(jī)構(gòu)和部門也需要組織專家進(jìn)行深入研討，及時(shí)出臺(tái)相關(guān)的法規(guī)及管理要求。此外，在原生的MSC-EVs的基礎(chǔ)上，如何通過改性、人為設(shè)計(jì)和修飾使其具有更強(qiáng)的效果及更高的安全性也是未來研究的重點(diǎn)[44]。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。