張羽婷劉江趙行何楊陳謙明

1.口腔疾病研究國家重點實驗室 國家口腔疾病臨床醫(yī)學研究中心中國醫(yī)學科學院口腔黏膜癌變與防治創(chuàng)新單元四川大學華西口腔醫(yī)院口腔黏膜病科，成都610041；2.呼吸健康研究所靶向示蹤研究室，疾病分子網(wǎng)絡前沿科學中心，四川大學華西醫(yī)院呼吸與重癥醫(yī)學科，成都610041

5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）是臨床上廣泛使用的廣譜抗代謝抗癌藥物，主要適用于結(jié)直腸癌、胃癌、乳腺癌、頭頸部鱗狀細胞癌等[1]，它主要通過抑制DNA和RNA的合成，導致細胞凋亡而發(fā)揮抗腫瘤作用[2]。但其對正常組織較大的毒副作用，如消化道癥狀、靜脈炎、骨髓抑制等[3-5]，限制了它的應用。因此，對5-FU的結(jié)構(gòu)修飾和優(yōu)化一直以來都受到了廣泛的關(guān)注。為了降低5-FU的毒性，設計合成高效、減毒的5-FU先導化合物成為一種重要的方法?？茖W家們利用小分子的氨基酸、短肽、卟啉、縮醛等對5-FU的結(jié)構(gòu)進行修飾獲得了許多5-FU衍生物[6-12]，或?qū)⑿》肿拥?-FU與高分子載體相結(jié)合[13]進行藥物遞送，雖然取得了一些進展，但大部分藥物仍對正常細胞毒性較大。

糖類藥物具有高親水性，可以與生物大分子相連形成糖綴合物，并常常作為生物信使的載體等，且糖苷類化合物具有一定程度的抗癌活性。糖基藥物作用于細胞表面后需要糖轉(zhuǎn)運蛋白才能進入細胞內(nèi)部，因此對細胞及機體的干擾明顯小于直接進入細胞內(nèi)的藥物[8]。由于腫瘤細胞和正常細胞葡萄糖代謝方式的差異，以及半乳糖識別相關(guān)受體在一些腫瘤細胞表面高表達等原因，已有很多文獻報道以葡萄糖、半乳糖等修飾的5-FU單糖苷類似物在抗腫瘤治療中具有更低的毒性。乳糖是由一分子葡萄糖與一分子半乳糖構(gòu)成的二糖，然而以二糖為糖基的5-FU糖苷類衍生物尚未有報道。

基于以上研究背景，筆者提出假說：以乳糖為糖基的5-FU核苷衍生物比5-FU具有更低毒性。因此，本研究以對5-FU進行減毒為目的，設計合成一類5-FU先導化合物，借鑒核苷的合成方法合成了以乳糖為糖基的5-FU衍生物Ⅰa和Ⅰb，合成路線如圖1，并探究其體外毒性及初步抗腫瘤活性。

圖1 Ⅰa和Ⅰb的合成路線Fig 1 Synthetic route ofⅠa andⅠb

1 材料和方法

1.1 儀器和試劑

1.1.1 儀器 DU-800型紫外分光光度計（Beckman公司，美國），AVⅡ-400 MHz型核磁共振儀、ESI-Q-TOF-MS型電噴霧四級桿飛行時間質(zhì)譜儀（Bruker公司，德國），酶標檢測儀（Thermo Fish‐er Scientific公司，美國）。

1.1.2 主要試劑 5-FU（Sigma Aldrich公司，美國）；全乙酰化乳糖（Toronto Research Chemicals公司，加拿大）；其余均為分析純；1,2-二氯乙烷、乙腈用五氧化二磷蒸餾5 h后收集中間組分得到；K-SFM培養(yǎng)基、DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清（GIBCO公司，美國），DMEM高糖培養(yǎng)基、磷酸緩沖鹽溶液（Hyclone公司，美國）；細胞計數(shù)試劑盒8（cell counting kit-8，CCK-8）（DOJINDO同仁化學研究所，日本）。

1.2 化合物的制備

將0.3 g 5-FU溶于40 mL六甲基二硅烷中，加入350μL三甲基氯硅烷，140℃下攪拌回流3 h后，低壓蒸除溶劑。再向其中加入40 mL已經(jīng)過無水處理的1,2-二氯乙烷，1.1 g全乙?；樘?，冰浴冷卻，0℃時加入500μL四氯化錫。攪拌反應數(shù)分鐘，轉(zhuǎn)入50℃油浴，繼續(xù)攪拌回流反應。通過薄層色譜法監(jiān)測反應進程，當反應終止，低壓蒸除溶劑，用二氯甲烷（4×50 mL）萃取，合并有機相，依次用飽和碳酸氫鈉、水洗滌，再用無水硫酸鈉干燥，低壓蒸除溶劑。將粗產(chǎn)物通過硅膠層析柱分離提純，得到產(chǎn)物Ⅰa（430 mg，36.1%）和Ⅰb（460 mg，38.7%）。

1-全乙?；樘腔?5-FU（Ⅰa）：UV(CH3OH):λmax=261 nm(8 258)。核磁共振氫譜（1H nuclear magnetic resonance，1HNMR）、(400 MHz,DMSOd6)δ(ppm):11.95(s,1H,NH),8.30(d,J=7.2 Hz,1H,5-H),5.97(d,J=9.1 Hz,1H,1’-H),5.43(t,J=9.4 Hz,1H),5.32～5.15(m,3H),4.86(q,J=7.8 Hz,2H),4.39(d,J=11.4 Hz,1H),4.28(t,J=6.5 Hz,1H),4.21-4.09(m,1H),4.08-3.84(m,4H),2.01(m,J=37.0,26.0,6.6 Hz,7(CH3),21H)。核磁共振碳譜（carbon-13 nuclear magnetic resonance，13CNMR）(101 MHz,DMSO-d6)δ(ppm):170.27,169.89,169.52,169.37,169.18,169.01,156.62,148.95,141.18,138.85,125.53,100.05,79.16,75.80,73.92,71.62,70.27,69.68,69.64,68.85,67.08,62.33,60.94,54.88,20.59,20.48,20.33,20.28,20.24,20.11。常規(guī)的高分辨質(zhì)譜（high resolution mass spectrometry，HRMS）(ESI+)m/z:Calc.for C30H37FN2O19:748.197 6[M+Na]+;Found:748.197 5[M+Na]+。

3-全乙?；樘腔?5-FU（Ⅰb）：UV(CH3OH):λmax=270 nm(575 7)。1HNMR(400 MHz,DMSO-d6)δ(ppm):11.21(s,1H,NH),7.89(m,J=21.2,5.4 Hz,1H,5-H),6.12(d,J=9.3 Hz,1H,1’-H),6.03-5.87(m,1H),5.40-5.19(m,2H),5.13(m,J=9.6,3.6 Hz,1H),4.96-4.74(m,2H),4.46-4.19(m,2H),4.01(m,J=28.8,9.4 Hz,4H),3.79(m,J=22.3,9.7 Hz,4H),2.23-1.76(m,7(CH3),21H)。13C NMR(101 MHz,DMSO-d6)δ(ppm):170.20,169.87,169.49,169.32,169.27,169.04,157.27,156.38,149.80,148.04,129.87,124.34,99.80,75.71,72.63,70.42,69.69,68.81,67.71,67.09,62.21,60.93,54.88,20.61,20.45,20.41,20.33,20.27,20.25,20.19。HR MS(ESI+)m/z:Calc.for C30H37FN2O19:748.197 6[M+Na]+;Found748.1975[M+Na]+。

1.3 體外毒性及抗腫瘤活性實驗

1.3.1 細胞株 本研究選擇正?？谇唤琴|(zhì)形成細胞NOK進行目標化合物體外毒性研究，選擇代表性人乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV）陰性口腔鱗狀細胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）細胞Cal-27及HPV陽性OSCC細胞UM SCC-47進行目標化合物抗腫瘤活性研究，上述3種細胞均來自四川大學口腔疾病研究國家重點實驗室。

1.3.2 體外毒性及抗腫瘤活性的測定 通過CCK-8法測定細胞生存率，以評價目標化合物的體外毒性及抗腫瘤活性。分別收集生長良好的NOK細胞、Cal-27細胞和UM SCC-47細胞，重懸、計數(shù)，調(diào)整細胞濃度為5×104個/mL，以100μL/孔接種于96孔板中。等待4～6 h細胞貼壁，孔板分別分組并加入100μL含不同濃度（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7μmol·mL-1）化合物Ⅰa或Ⅰb的培養(yǎng)基，設置空白培養(yǎng)基作為對照。37°C孵育，在24 h及72 h進行檢測。加入含10%CCK-8試劑的培養(yǎng)基，孵育1 h后在450 nm波長條件下檢測吸光度值。以每個孔板實驗組與對照組吸光度值的百分比表示細胞生存率。每組設計≥3個副孔，結(jié)果取平均值，實驗獨立重復3次。

1.4 統(tǒng)計學方法及計算方法

1.4.1 統(tǒng)計學方法 所有實驗數(shù)據(jù)均由SPSS 10.0軟件分析，并經(jīng)χ2檢驗，P<0.05記為差異有統(tǒng)計學意義。

1.4.2 計算方法 由SPSS軟件計算得到的化合物的半數(shù)有毒濃度（50%toxic concentration，TC50）值，半數(shù)抑制濃度（50%inhibitory concentration，IC50）值以及藥物選擇指數(shù)（selection index，SI）。計算公式SI=TC50/IC50，SI大于1.00為有效，指數(shù)越大則安全范圍越大。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)構(gòu)表征

HRMS、1HNMR、13CNMR檢測發(fā)現(xiàn)化合物的精確分子量和碳氫個數(shù)歸屬分別與Ⅰa和Ⅰb匹配。二維核磁譜1H-13C異核多量子相干譜（heteronucle‐ar multiple quantum correlation，HMQC）和1H-13C異核多鍵相關(guān)譜（heteronuclear multiple bond cor‐relation，HMBC）檢測結(jié)果見圖2。通過1H-13C HMQC核磁譜對碳原子和氫原子的位置進行歸屬，發(fā)現(xiàn)化合物Ⅰa C’-H1’和C6-H6的一一對應關(guān)系（圖2 A），化合物Ⅰb C1’-H1’的對應關(guān)系（圖2 B）；通過1H-13C HMBC核磁譜中的碳氫空間耦合關(guān)系，發(fā)現(xiàn)化合物Ⅰa C6與H1’、C1’與H6間存在空間耦合，說明Ⅰa為N-1位取代（圖2C）；而化合物Ⅰb的C6與H1’、C1’與H6由于空間距離相隔較遠，通過HMBC沒有觀察到相應的C-H空間耦合作用，說明Ⅰb為N-3位取代（圖2D）。

圖2 目標化合物Ⅰa、Ⅰb的二維核磁譜Fig 2 Two-dimensional nuclear magnetic resonanceof thetarget compoundsⅠa andⅠb

綜上，筆者成功合成了N-1位及N-3位乳糖基取代的5-FU核苷衍生物Ⅰa、Ⅰb，并通過NMR、HRMS等分析技術(shù)確定了化合物Ⅰa、Ⅰb的化學結(jié)構(gòu)。

2.2 體外毒性及抗腫瘤活性實驗結(jié)果

如圖3所示，Ⅰa處理24 h以及72 h后對于NOK細胞均未見明顯的細胞毒性，Ⅰb處理24 h后在較低濃度時（<0.5μmol·mL-1）也未表現(xiàn)出明顯細胞毒性。

圖3 目標化合物對3種細胞的體外抑制率Fig 3 Inhibition rate of target compounds on three cell lines in vitro

其中0.7μmol·mL-1濃度Ⅰa、Ⅰb處理24 h后對NOK細胞生長的抑制率分別為30.28%及50.68%，均較5-FU的抑制作用弱（68.22%）（P<0.05）。

另外，Ⅰa、Ⅰb對于2種OSCC細胞均具有一定抗腫瘤活性，且Ⅰb的抗OSCC活性均要優(yōu)于Ⅰa，其中0.7μmol·mL-1濃度Ⅰb處理Cal-27細胞以及UM SCC-47細胞24 h后的抑制率分別為81.20%、80.19%；但是兩種化合物分別處理24 h以及72 h的抗OSCC活性均未見明顯的差異（P<0.05）。

表1顯示了由SPSS軟件計算得到的目標化合物Ⅰa、Ⅰb及5-FU對NOK細胞的TC50值、對兩種OSCC細胞的IC50值以及SI。比較Ⅰa、Ⅰb與5-FU的TC50值，其24、72 h毒性分別減小2.13倍、1.26倍和264.58倍、9.42倍。計算SI值可知，Ⅰa、Ⅰb對Cal-27細胞及UM SCC-47細胞的抑制效果幾乎全部有效，其中24 h處理后的Ⅰa、Ⅰb及72 h處理后的Ⅰa對于正常細胞均較OSCC細胞具有明顯低毒性。如圖4所示的細胞形態(tài)學改變更直觀地反映了該結(jié)果。通過比較不同目標化合物處理的同株細胞，發(fā)現(xiàn)Ⅰb的IC50均低于Ⅰa，對于24 h及72 h處理后的Cal-27細胞，Ⅰa的IC50分別是Ⅰb的4.27倍及5.04倍；而對于UM SCC-47細胞，兩種化合物IC50倍數(shù)差異稍小，24 h及72 h處理后的差異分別為1.47倍及2.38倍。另外，Ⅰa對Cal-27的IC50均高于對UM SCC-47，在處理24 h及72 h時分別為1.36倍和1.28倍；而Ⅰb對Cal-27的IC50均低于對UM SCC-47，處理24 h及72 h后分別為2.13倍與1.65倍。

圖4 目標化合物處理后3種細胞的形態(tài)學變化Fig 4 Themorphological changesof the threecell linesafter treatment with thetarget compounds

表1 目標化合物對三種細胞的TC50、IC50及SI值Tab 1 IC50，TC50 and SI value of the target compounds on three cell lines

3 討論

大量研究表明，嘧啶核苷合成中，反應溶劑極性對不同位置取代的核苷產(chǎn)物的形成有很大影響。在1,2-二氯乙烷等非極性或弱極性溶劑中，催化劑易與嘧啶N-1位形成σ-絡合物，阻礙糖基取代核苷N-1位，同時消耗催化劑，導致產(chǎn)物以N-3位為主；而在乙腈等極性溶劑中，則以N-1位核苷為主。同樣，在本研究中，以乙腈為溶劑，主要生成N-1位5-FU乳糖苷衍生物；而以1,2-二氯乙烷作為溶劑，可能由于全乙?；樘桥c5-FU N-3位空間位阻的原因，最后得到的N-3位與N-1位產(chǎn)物比例接近1∶1，N-3位產(chǎn)物作為主產(chǎn)物，產(chǎn)率略大于N-1位產(chǎn)物。

CCK-8法檢測結(jié)果表明：化合物Ⅰa、Ⅰb的體外毒性均低于5-FU，在較高濃度時其對正常角質(zhì)形成細胞的抑制作用顯著低于5-FU，且其中Ⅰa的毒性較Ⅰb更低。化合物Ⅰa、Ⅰb均具有一定抗腫瘤活性，其中Ⅰb的抗腫瘤活性比Ⅰa好，其在較高濃度時的抗OSCC細胞增殖活性與5-FU接近。Ⅰa與Ⅰb間毒性及抗腫瘤活性的差異可能與其N-1位及N-3位上糖基鏈接位點差異及構(gòu)型有關(guān)；而對于目標化合物Ⅰa、Ⅰb與5-FU間毒性及抗腫瘤活性的差異，筆者認為與所得化合物糖基部分的乙?；Ｗo基有關(guān)?；衔铫馻、Ⅰb作為5-FU乳糖苷前體藥物，其糖苷鍵與傳統(tǒng)單糖糖苷鍵連接的差異導致其降解速率更為緩慢，因此釋放5-FU濃度的速率較慢，較低濃度下其抗腫瘤活性較等摩爾濃度5-FU弱，表現(xiàn)為其SI較5-FU更低。筆者猜測目標化合物第一步裂解可能存在5-FU-乳糖或5-FU半乳糖苷-半乳糖兩種方式，最終裂解得到5-FU及糖基產(chǎn)物后可能表現(xiàn)出更明顯的抗腫瘤活性。值得一提的是，在合成的化合物中，意外得到一種未知化合物，由于產(chǎn)率極低，無法進行后續(xù)的結(jié)構(gòu)鑒定，筆者猜測應為N1,N3-二全乙?；樘腔?5-FU。所以，提高化合物Ⅰb和未知化合物產(chǎn)率，對糖基部分進行脫保護和結(jié)構(gòu)優(yōu)化以及經(jīng)嘧啶核苷磷酸化酶處理，有可能得到抗腫瘤活性更好的化合物，進一步的實驗正在進行中。

4 結(jié)論

本研究為了降低5-FU毒性，引入了全乙?；樘腔煤唵胃咝У姆椒ǔ晒铣闪司哂腥樘腔揎椀?-FU先導化合物Ⅰa、Ⅰb，并通過HRMS、1HNMR、13CNMR、HMQC以及HMBC證實了其分別為N-1位及N-3位取代結(jié)構(gòu)。對目標化合物的體外毒性進行驗證，發(fā)現(xiàn)化合物Ⅰa、Ⅰb均較5-FU毒性降低，差異具有統(tǒng)計學意義；對目標化合物抗腫瘤活性進行驗證，發(fā)現(xiàn)Ⅰa、Ⅰb在兩種OSCC細胞中均具有一定抗腫瘤活性，其中Ⅰb在較高濃度表現(xiàn)出顯著的抗口腔鱗癌細胞增殖活性。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。