傅卓然，李卓蘊(yùn)，陳 燕，張舒婷，賴鐘雄，林玉玲

(福建農(nóng)林大學(xué) 園藝植物生物工程研究所，福州 350002)

生長(zhǎng)素是人們最早發(fā)現(xiàn)的一類植物激素，在植物生長(zhǎng)發(fā)育過程中具有重要的調(diào)節(jié)作用[1]。生長(zhǎng)素早期響應(yīng)基因包括3大基因家族：GH3(gretchen hagen 3)、Aux/IAA(auxin/indole-3-aceticacid)和SAUR (small auxin up-regulated RNA)，其中SAUR是最大的基因家族[2]。1987年，SAUR基因在大豆(GlycinemaxL.)下胚軸首次被鑒定出[3]，隨后又在黃瓜(CucumissativusL.)[1]、柑橘(CitrusreticulataL.)[2]、水稻(Oryzasativa)[4]、擬南芥(ArabidopsisthalianaL.)[5]和番茄(SolanumlycopersicumL.)[6]中相繼報(bào)道。盡管在很多植物種中對(duì)SAUR基因家族做了鑒定和表達(dá)分析，但其功能的研究目前處于早期階段，只有部分家族成員進(jìn)行了功能解析[7]。SAUR作為生長(zhǎng)素早期響應(yīng)基因，廣泛參與了植物根系發(fā)育、下胚軸伸長(zhǎng)與葉片向光生長(zhǎng)等過程[8-10]。除此之外，SAUR家族成員在植物響應(yīng)干旱、低溫與鹽脅迫中起重要作用[1, 11]。在擬南芥中，過表達(dá)AtSAUR41可以使下胚軸表皮細(xì)胞顯著增長(zhǎng)[12]，AtSAUR36可以通過調(diào)節(jié)生長(zhǎng)素來加快葉片衰老[13]。過表達(dá)OsSAUR39會(huì)降低水稻植株生長(zhǎng)素合成和轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因的表達(dá)，導(dǎo)致生長(zhǎng)素含量降低，表明OsSAUR39對(duì)生長(zhǎng)素的合成和轉(zhuǎn)運(yùn)起到負(fù)調(diào)控作用[14]。低溫脅迫可以上調(diào)楊樹中SAUR12、SAUR34、SAUR54、SAUR67、SAUR91和SAUR97的表達(dá)[15]。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一類長(zhǎng)度大于200 nt，沒有長(zhǎng)的開放閱讀框且不具有編碼蛋白能力的非編碼RNA[16]。lncRNAs雖然缺乏蛋白質(zhì)編碼能力，但lncRNAs 可以通過順式(cis-acting, cis)或反式(trans-acting, trans)的方式調(diào)控靶基因的表達(dá)水平。研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA參與調(diào)控激素信號(hào)、逆境脅迫響應(yīng)、生長(zhǎng)代謝和生殖發(fā)育等一系列重要生物途徑[17]。Tan等[18]構(gòu)建了耐旱及敏旱甘藍(lán)型油菜(BrassicanapusL.)lncRNA-mRNA的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，篩選出在干旱中參與植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的lncRNAs，并驗(yàn)證了lncRNAs對(duì)其靶基因的正調(diào)控關(guān)系。在番茄中，lnc39042與其靶基因SPL100協(xié)同作用，提高番茄的抗病性[19]。在沙棘(HippophaerhamnoidesL.)中鑒定出了與果實(shí)發(fā)育相關(guān)的差異表達(dá)的lncRNA，并發(fā)現(xiàn)lnc1和lnc2可以通過抑制SPL9和MYB14的表達(dá)從而負(fù)調(diào)控花青素的合成[20]。在楊樹(PopulusL.)中，lnc12可以負(fù)調(diào)控靶基因PeSAUR72，過表達(dá)lnc12后導(dǎo)致生根缺陷，而PeSAUR72過表達(dá)可以彌補(bǔ)過表達(dá)lnc12造成的生根缺陷[21]。

龍眼(DimocarpuslonganLour.)屬于無患子科(Sapindaceae)龍眼屬(Dimocarpus)，是熱帶、亞熱帶名貴果樹之一[22]。研究發(fā)現(xiàn)，龍眼果實(shí)品質(zhì)和產(chǎn)量與胚胎發(fā)育情況密切相關(guān)。因此，對(duì)龍眼胚胎發(fā)育機(jī)理進(jìn)行深入的研究對(duì)龍眼產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重大意義[23]。在自然狀態(tài)下，龍眼早期胚胎發(fā)育研究存在取樣困難、材料同步性差和發(fā)育進(jìn)程不可控等不利因素，采用植物體細(xì)胞胚胎發(fā)生系統(tǒng)可替代常規(guī)途徑來解決這一不足[24]。本課題組前期工作基于龍眼‘紅核子’二代基因組，采用IlluminaHiSeq測(cè)序平臺(tái)對(duì)龍眼體胚發(fā)生早期的愈傷組織(embryogenic callus, EC)、不完全胚性緊實(shí)結(jié)構(gòu)(incomplete embryonic compact structure，ICpEC)及球形胚(globular embryo，GE)3個(gè)階段的樣本進(jìn)行l(wèi)ncRNA測(cè)序，通過預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)龍眼SAUR63與SAUR64(DlSAUR63和DlSAUR64)可同時(shí)作為L(zhǎng)TCONS_00038949、LTCONS_00038950及LTCONS_00038952(lnc38949、lnc38950和lnc38952)的靶基因[25]。因此，本研究擬在前期工作基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對(duì)DlSAUR63和DlSAUR64的CDS 序列進(jìn)行全長(zhǎng)克隆，與水稻、擬南芥的SAUR蛋白構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹；并對(duì)DlSAUR63和DlSAUR64進(jìn)行亞細(xì)胞定位驗(yàn)證；利用qRT-RCR技術(shù)檢測(cè)DlSAUR63、DlSAUR64和lncRNAs(lnc38949、lnc38950和lnc38952)在龍眼體胚發(fā)生早期階段表達(dá)模式，并對(duì)其在激素處理、鹽、干旱和溫度等非生物脅迫下的響應(yīng)模式進(jìn)行分析；通過熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)技術(shù)進(jìn)一步研究DlSAUR63與lnc38949在合子胚中的亞細(xì)胞定位。研究結(jié)果為后續(xù)解析DlSAUR63、DlSAUR64作為lncRNA的靶基因參與調(diào)控生長(zhǎng)素生物合成的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)，同時(shí)也為研究SAUR基因在龍眼體胚中生長(zhǎng)發(fā)育過程中的作用機(jī)制提供理論參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

DlSAUR63、DlSAUR64、lnc38949、lnc38950和lnc38952的基因序列、CDS序列與氨基酸序列下載于lncRNA數(shù)據(jù)庫[25]和本課題組公布的龍眼基因組數(shù)據(jù)庫[26](登錄號(hào)為PRJNA792504)。選用‘本氏’煙草(Nicotianabenthamiana)作為亞細(xì)胞定位的受體材料。熒光原位雜交所用的‘紅核子’龍眼合子胚材料于2021年4月17日采自福建農(nóng)林大學(xué)拓荒廣場(chǎng)?！t核子’龍眼胚性培養(yǎng)物(EC、ICpEC及GE)由賴鐘雄團(tuán)隊(duì)長(zhǎng)期繼代保存。將長(zhǎng)勢(shì)良好的龍眼EC材料接種到添加100、250與500 μmol·L-1赤霉素(gibberellin3, GA3)，50、100與200 μmol·L-1水楊酸(salicylic acid, SA)和茉莉酸甲酯(methyl jasmonate, MeJA)的液體培養(yǎng)基中，置于搖床25 ℃、120 r·min-1處理24 h。取長(zhǎng)勢(shì)良好的龍眼EC材料接種于添加150 mmol·L-1NaCl與10%的PEG4000的MS固體培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)，分別處理0、6、12和24 h。取生長(zhǎng)旺盛的龍眼EC接種于MS固體培養(yǎng)基上，分別放入15、25 及35 ℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)24 h。每種處理均設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)。將上述樣品取樣后用濾紙吸干，液氮速凍3～5 min后保存在實(shí)驗(yàn)室-80 ℃冰箱。

1.2 方 法

1.2.1 RNA的提取以及cDNA逆轉(zhuǎn)錄采用Trizol Up試劑盒(TransGen，北京，中國(guó)) 對(duì)上述材料進(jìn)行RNA的提取，具體方法參照說明書。采用超微量紫外分光光度計(jì)(Thermo Fisher Scientific，MA，USA)測(cè)定總RNA的OD值及濃度，OD值在1.8 ～ 2.2最佳。將龍眼EC、ICpEC和GE 3個(gè)階段的RNA各取1 μL進(jìn)行混合，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa，Japan)并參照說明書將其逆轉(zhuǎn)錄為克隆全長(zhǎng)所需的cDNA，實(shí)時(shí)熒光定量PCR所用的cDNA采用Hifair1st Strand cDNA Synthesis kit試劑盒(Yeasen，上海，中國(guó))逆轉(zhuǎn)錄得到。

1.2.2 龍眼SAUR63/64基因克隆利用DNAMAN軟件設(shè)計(jì)DlSAUR63與DlSAUR64特異性引物(表1)。引物由福州尚亞生物技術(shù)有限公司合成。以上述cDNA為模板克隆DlSAUR63與DlSAUR64基因的全長(zhǎng)，使用1%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)全長(zhǎng)產(chǎn)物進(jìn)行驗(yàn)證。將DlSAUR63與DlSAUR64基因CDS序列鏈接至pMD18-T載體上，具體方法參考說明書。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH-5α，將轉(zhuǎn)化后的菌液涂布至抗性培養(yǎng)基。將篩選得到的陽性克隆子菌液PCR驗(yàn)證并送至福州尚亞生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

表1 基因克隆及載體構(gòu)建引物序列

1.2.3 系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹水稻和擬南芥的SAUR氨基酸序列分別從RGAP[http://Rice Genome Annotation Project (uga.edu)]和TAIR(https://www.arabidopsis.org/index.jsp)中獲得。使用MEGA7.0軟件中的鄰接法(Neighbor-Joining, NJ)對(duì)擬南芥、水稻和龍眼(DlSAUR63和DlSAUR64)的SAUR蛋白序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹構(gòu)建(Bootstrap抽樣次數(shù)為1000)。利用網(wǎng)絡(luò)工具ITOL在線軟件(https://itol.embl.de/upload.cgi)可視化系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4 龍眼DlSAUR63/64基因亞細(xì)胞定位以測(cè)序正確的pCAMBIA1302-DlSAUR63和pCAMBIA1302-DlSAUR64的質(zhì)粒為模板，NcoⅠ-SAUR63-F、SpeⅠ-SAUR63R和NcoⅠ-SAUR64-F、SpeⅠ-SAUR64-R為引物擴(kuò)增目的片段(表1)。用NcoⅠ和SpeⅠ限制性核酸內(nèi)切酶酶切pCAMBIA1302-GFP空載。擴(kuò)增的目的片段經(jīng)過電泳檢測(cè)后回收，進(jìn)行同源重組后轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。將成功構(gòu)建的含有目的基因的融合表達(dá)載體命名分別為pCAMBIA1302-DlSAUR63-GFP與pCAMBIA1302-DlSAUR64-GFP。

提取表達(dá)載體pCAMBIA1302-DlSAUR63-GFP與pCAMBIA1302-DlSAUR64-GFP的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞，PCR驗(yàn)證陽性單克隆菌株。以pCAMBIA1302-GFP空載為對(duì)照將空載、pCAMBIA1302-DlSAUR63和pCAMBIA1302-DlSAUR64融合表達(dá)載體利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入煙草葉片中，套袋暗培養(yǎng)36 h。使用共聚焦顯微鏡(Olympus FV 1000)觀察‘本氏’煙草GFP熒光信號(hào)并拍照。

1.2.5DlSAUR63/64與lncRNAs表達(dá)模式分析通過DNAMAN6.0軟件設(shè)計(jì)龍眼DlSAUR63、DlSAUR64、lnc38949、lnc38950和lnc38952的qRT-PCR引物(表2)。UBQ為龍眼體胚發(fā)生早期3個(gè)階段的內(nèi)參基因，F(xiàn)e-SOD為激素處理及鹽、干旱和溫度等非生物脅迫的內(nèi)參基因。使用Light Cycler 480 qRT-PCR儀器檢測(cè)，按照2-ΔΔCt法計(jì)算DlSAUR63、DlSAUR64、lnc38949、lnc38950和lnc38952的相對(duì)表達(dá)量，不同取樣點(diǎn)設(shè)置3個(gè)技術(shù)重復(fù)，共進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。用SPSS進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)和Fisher最小顯著性差異檢驗(yàn)組間差異，并通過Prism8.0.2軟件制圖。

表2 龍眼lncRNAs及其靶基因引物與探針序列信息

1.2.6DlSAUR63與lnc38949在合子胚中的熒光原位雜交探針(表2)用Primer5軟件設(shè)計(jì)，由上海萊哲生物技術(shù)有限公司合成。常規(guī)脫蠟后將切片置于甲酰胺(35 mL)+5×SSC(35 mL)的濕盤中。30% H2O 和純甲醇混合物在室溫下處理10 min。用DEPC清洗3次；將切片放在濕盒中，室溫下將0.2mol·L-1鹽酸滴在組織上15 min，用DEPC水清洗2次。在分子雜交儀中用蛋白酶K涂抹組織，提高探針的結(jié)合效率。用0.2%甘氨酸洗滌1 min，終止蛋白酶K的作用(準(zhǔn)備使用)。用PBS洗2次后用4%多聚甲醛PFA固定組織10 min。再用PBS洗3次，每次1 min。用乙酸酐(pH=8.0)在室溫下洗2次。用PBS洗5次。用5×SSC pH 7.5洗2次，每次1 min。將切片放在一個(gè)濕盤中，在65 ℃下預(yù)雜交1 h。用500 μg·L-1FAM /CY3標(biāo)記的陰性探針覆蓋切片，在65 ℃黑暗中反應(yīng)48 h。在室溫下用2 × SSC(pH=7.5)洗1次，1 min。甲酰胺加4 × SSC(pH=4.5)的1∶1混合物在60 ℃洗3次，每次20 min。在室溫下用PBS洗5次，每次1 min。將DAPI 稀釋500倍，對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色5min。用PBS洗3次，每次5 min。滴加防抖劑并蓋上蓋子。載玻片密封后，用熒光顯微鏡(Nikon Eclipse Ci)進(jìn)行觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 DlSAUR63/64基因克隆

將龍眼體胚早期3個(gè)階段的cDNA混樣后作為模板(表1)，對(duì)DlSAUR63和DlSAUR64進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，分別擴(kuò)增出384和312 bp，與預(yù)期目的片段長(zhǎng)度相符(圖1)。將克隆得到的目的片段連接到pMD18-T載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑取陽性克隆子進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證和測(cè)序。使用DNAMAN6.0將測(cè)序結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組中的DlSAUR63和DlSAUR64的CDS序列進(jìn)行比對(duì)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DlSAUR63比對(duì)結(jié)果完全相同，DlSAUR64比對(duì)結(jié)果為僅有一個(gè)堿基的差異(圖1，B、C)。

A.PCR擴(kuò)增；B.DlSAUR63；C.DlSAUR64圖1 DlSAUR63與DlSAUR64 CDS擴(kuò)增與序列比對(duì)A. Amplification of PCR；B. DlSAUR63；C. DlSAUR64 Fig.1 CDS amplification and sequence alignment of DlSAUR63 and DlSAUR64

2.2 DlSAUR63/64基因編碼蛋白的系統(tǒng)發(fā)育分析

為研究龍眼DlSAUR63和DlSAUR64與擬南芥和水稻SAUR蛋白的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，對(duì)其氨基酸序列比對(duì)并構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果(圖2)顯示，139個(gè)SAUR家族蛋白被分為Subfamibly Ⅰ、Subfamibly Ⅱ和Subfamibly Ⅲ 3個(gè)亞族。Subfamibly Ⅰ蛋白成員最多含有109個(gè)，Subfamibly Ⅱ含有22個(gè)成員，Subfamibly Ⅲ含有8個(gè)成員。此外，大多數(shù)的水稻OsSAUR和擬南芥AtSAUR分別在不同分支中大量聚集。DlSAUR63、DlSAUR64與同為雙子葉植物的擬南芥的AtSAUR42和AtSAUR48處于同一分支，親緣關(guān)系較近；而與單子葉水稻的SAUR成員距離較遠(yuǎn)，說明與水稻進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)。

At. 擬南芥；Os. 水稻圖2 DlSAUR63、DlSAUR64和其他物種系統(tǒng)發(fā)育樹At. Arabidopsis thaliana L；Os. Oryza sativaFig.2 Phylogenetic tree of DlSAUR63, DlSAUR64 and related genes in other species

2.3 DlSAUR63與DlSAUR64蛋白亞細(xì)胞定位

利用在線軟件TargetP1.1Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)對(duì)DlSAUR63與DlSAUR64進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)。結(jié)果(圖3)顯示，DlSAUR63蛋白最有可能定位到細(xì)胞核、胞外基質(zhì)和葉綠體；DlSAUR64蛋白最有可能被定位于葉綠體。

亞細(xì)胞定位結(jié)果表明，pCAMBIA1302-GFP空載侵染煙草表皮細(xì)胞后整個(gè)細(xì)胞內(nèi)都有綠色熒光(圖3，I-L)。融合表達(dá)載體pCAMBIA1302-DlSAUR63侵染的煙草葉片在細(xì)胞核和細(xì)胞外基質(zhì)檢測(cè)到綠色熒光信號(hào)，沒有與葉綠素自發(fā)熒光重疊，說明DlSAUR63定位于在細(xì)胞核和細(xì)胞外基質(zhì)，但不定位在葉綠體(圖3，A-D)。而pCAMBIA1302-DlSAUR64主要在葉綠體中呈明顯的綠色，并與葉綠體自發(fā)熒光重疊，說明DlSAUR64定位在葉綠體(圖3，E-H)。

2.4 DlSAUR63/64 與lncRNAs在龍眼體胚發(fā)生早期的表達(dá)分析

前期研究發(fā)現(xiàn)，SAUR63、SAUR64同時(shí)作為3個(gè)lncRNAs(lnc38949，lnc38950和lnc38952)的靶基因[25]。根據(jù)預(yù)測(cè)信息發(fā)現(xiàn)，lnc38949、lnc38950和lnc38952對(duì)靶基因DlSAUR63與DlSAUR64的調(diào)控方式均為cis調(diào)控。其中DlSAUR63、DlSAUR64位于lnc38949鄰近上游10 kb，位于lnc38950與lnc38952鄰近下游20 kb(圖4)。

3個(gè)lncRNAs分別順式調(diào)控靶基因DlSAUR63和DlSAUR64；EC. 胚性愈傷組織；ICpEC. 不完全胚性緊實(shí)結(jié)構(gòu)；GE. 球形胚圖4 lncRNAs靶基因預(yù)測(cè)與體胚發(fā)生早期的表達(dá)分析Three lncRNAs cis regulate target genes DlSAUR63 and DlSAUR64, respectively; EC. Embryogenic callus; ICpEC. Incomplete embryonic compact structure; GE. Globular embryoFig.4 Prediction of target genes of lncRNAs and expression analysis of early somatic embryogenesis

利用qRT-PCR技術(shù)進(jìn)一步了解DlSAUR63、DlSAUR64和3個(gè)lncRNAs在龍眼體胚發(fā)生早期的表達(dá)模式。結(jié)果如圖4所示，DlSAUR63、DlSAUR64與3個(gè)lncRNAs在龍眼體胚發(fā)生早期均有表達(dá)，且在ICpEC階段表達(dá)最高，推測(cè)其可能在ICpEC階段的形態(tài)建成起重要作用。結(jié)合轉(zhuǎn)錄組中的FPKM值分析表明，DlSAUR63、lnc38949、lnc38950和lnc38952表達(dá)趨勢(shì)與轉(zhuǎn)錄組相同，但DlSAUR64表達(dá)趨勢(shì)與轉(zhuǎn)錄組不同。

2.5 DlSAUR63/64與lncRNAs在激素處理下的表達(dá)模式分析

由上文可知，在龍眼體胚發(fā)生早期過程中3個(gè)lncRNAs正調(diào)控其靶基因DlSAUR63、DlSAUR64。采用qRT-PCR進(jìn)一步分析DlSAUR63、DlSAUR64和lncRNAs在不同濃度、不同激素下的表達(dá)模式。結(jié)果表明(圖5)，DlSAUR63、DlSAUR64與3個(gè)lncRNAs對(duì)不同激素處理下不同濃度的響應(yīng)模式存在差異。GA3處理下，DlSAUR63與3個(gè)lncRNAs在100和500 μmol·L-1上調(diào)表達(dá)，在500 μmol·L-1時(shí)表達(dá)量達(dá)到峰值。推測(cè)DlSAUR63、DlSAUR64與3個(gè)lncRNAs在龍眼體胚早期階段參與GA3信號(hào)通路。在SA處理下，DlSAUR63、lnc38949和lnc38952的表達(dá)均受到抑制，而DlSAUR64在50 μmol·L-1上調(diào)表達(dá)，隨后隨著SA濃度升高其表達(dá)水平逐漸降低，lnc38950則在100和500 μmol·L-1上調(diào)表達(dá)。在MeJA處理下，DlSAUR63在MeJA濃度為50 μmol·L-1時(shí)表達(dá)量最高，濃度為100 μmol·L-1時(shí)表達(dá)量最低；DlSAUR64、lnc38949和lnc38950均在200 μmol·L-1處表達(dá)量最高，DlSAUR64的表達(dá)量與MeJA的濃度正相關(guān)且與lnc38952呈現(xiàn)負(fù)調(diào)控。DlSAUR63、DlSAUR64和3個(gè)lncRNAs在不同激素處理下呈現(xiàn)不同的調(diào)控模式，表明DlSAUR63、DlSAUR64和3個(gè)lncRNAs在龍眼體胚發(fā)生早期的過程中可能存在相對(duì)復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制。

不同小寫字母表示同一基因不同濃度處理間在0.05水平的顯著性差異圖5 不同激素處理下DlSAUR63/64與lncRNAs表達(dá)模式分析Different normal letters indicate significant difference with hormone treatments at 0.05 level for same geneFig.5 Expression patterns of DlSAUR63/64 and lncRNAs under different hormone treatments

2.6 DlSAUR63/64與lncRNAs在不同脅迫下的表達(dá)分析

采用qRT-PCR檢測(cè)DlSAUR63、DlSAUR64與3個(gè)lncRNAs在鹽、干旱和溫度脅迫下的表達(dá)模式。結(jié)果表明，在不同時(shí)間NaCl處理下，DlSAUR63、DlSAUR64與3個(gè)lncRNAs的表達(dá)模式不同(圖6)。在6 h時(shí)3個(gè)lncRNAs均上調(diào)表達(dá)，DlSAUR63、DlSAUR64均下調(diào)表達(dá)，可能存在負(fù)調(diào)控模式；在12 h，僅lnc38950上調(diào)表達(dá)，DlSAUR63、DlSAUR64、lnc38949和lnc38952均下調(diào)表達(dá)；24 h，lnc38950顯著性上調(diào)表達(dá)，DlSAUR64顯著下調(diào)表達(dá)。以上結(jié)果表明DlSAUR63、DlSAUR64與3個(gè)lncRNAs在鹽脅迫處理下存在復(fù)雜的調(diào)控模式。

不同小寫字母表示同一基因不同脅迫處理間在0.05水平的顯著性差異圖6 不同脅迫處理下DlSAUR63/64與lncRNAs表達(dá)模式分析Different lowercase letters represent significant difference between different stress treatments of the same gene at 0.05 levelFig.6 Expression patterns of DlSAUR63/64 and lncRNAs under different stress treatments

DlSAUR63、DlSAUR64與3個(gè)lncRNAs在10% PEG4000處理下的表達(dá)結(jié)果顯示：DlSAUR63基因在不同時(shí)間10% PEG4000處理下表達(dá)略有上調(diào)，其響應(yīng)不明顯。在干旱處理后期(12～24 h)，lnc38949、lnc38950和lnc38952上調(diào)表達(dá)，而DlSAUR64下調(diào)表達(dá)，推測(cè)它們之間可能存在負(fù)調(diào)控模式，從而參與干旱脅迫的信號(hào)通路的調(diào)控。

不同溫度(15、25和35 ℃)處理下，DlSAUR63、DlSAUR64、lnc38949和lnc38950均在35 ℃處理下表達(dá)上調(diào)，僅lnc38952在35 ℃處理下表達(dá)下調(diào)，提示溫度對(duì)龍眼DlSAUR63、DlSAUR64、lnc38949和lnc38950基因的表達(dá)存在顯著影響。

2.7 DlSAUR63與lnc38949熒光原位雜交

通過預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，利用石蠟切片技術(shù)研究基因定位和表達(dá)很難獲得完整的體胚結(jié)構(gòu)。相反，合子胚可以作為獲得完整胚胎結(jié)構(gòu)的理想材料。由于體細(xì)胞胚和合子胚的發(fā)育過程非常相似，使用RNA熒光原位雜交技術(shù)檢測(cè)龍眼合子胚富集簇標(biāo)記基因DlSAUR63與lnc38949的定位和表達(dá)(圖7)。結(jié)果表明，DlSAUR63與lnc38949在合子胚內(nèi)部或表皮富集部位相同，定位一致，且lnc38949的表達(dá)均高于DlSAUR63的表達(dá)。DlSAUR63與lnc38949在龍眼合子胚細(xì)胞中的非特異性定位和表達(dá)與大多數(shù)內(nèi)皮細(xì)胞簇中富含簇的標(biāo)記基因的非特異性表達(dá)高度相似，表明標(biāo)記基因不僅存在于體胚中，且在合子胚中可能具有功能多樣性。

圖7 熒光原位雜交檢測(cè)lnc38949及靶基因DlSAUR63 在合子胚中的亞細(xì)胞定位Fig.7 Subcellular localization of lnc38949 and target gene DlSAUR63 in zygotic embryos

3 討 論

3.1 DlSAUR63/64進(jìn)化特性分析

3.2 DlSAUR63/64及l(fā)ncRNAs可能通過響應(yīng)激素信號(hào)調(diào)控龍眼早期體胚發(fā)生過程

目前關(guān)于SAUR基因作為lncRNA的靶基因參與植物體胚發(fā)生還未見報(bào)道。對(duì)于SAUR基因在植物體胚發(fā)生中的研究報(bào)道也相對(duì)較少。椰子(CocosnuciferaL.)SAUR基因在胚性愈傷組織(90～120 d)中的表達(dá)高于初始培養(yǎng)(30～60 d)和體細(xì)胞胚階段(150～180 d)[34]；咖啡(CoffeaL.)CaSAUR12和CaSAUR18是在體細(xì)胞胚胎發(fā)育的各個(gè)時(shí)期均高表達(dá)的成員，且CaSAUR12是唯一一個(gè)在非胚性細(xì)胞和胚胎發(fā)育階段都顯示出上調(diào)表達(dá)的成員，推測(cè)該基因在某種程度上與生長(zhǎng)素誘導(dǎo)的細(xì)胞生長(zhǎng)和擴(kuò)張有關(guān)[35]。本研究通過轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析及qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)DlSAUR63、DlSAUR64、lnc38949、lnc38950和lnc38952均在ICpEC階段高表達(dá)，表明lncRNA可能通過正調(diào)控SAUR基因的表達(dá)在球形胚早期分化中發(fā)揮功能。

植物生長(zhǎng)發(fā)育過程中受到眾多激素的調(diào)控，各種基因可能通過響應(yīng)激素的應(yīng)答參與植物生長(zhǎng)發(fā)育過程，如胚胎發(fā)生過程。赤霉素(GA3)作為一種常見的植物激素，參與高等植物生長(zhǎng)發(fā)育的各個(gè)階段且具有重要的調(diào)控作用[36]。研究表明，10 μmol·L-1的GA3可以顯著提高印度娃兒藤(TylophorafloribundaMiquel)體細(xì)胞胚的發(fā)生率[37]。在棉花(Gossypiumspp)體外培養(yǎng)的胚珠上外源添加GA3，可以促進(jìn)棉花纖維的伸長(zhǎng)和促進(jìn)棉花胚珠的膨大[38-39]。水楊酸(SA)是一種與植物抗逆相關(guān)的激素，在植物生長(zhǎng)和發(fā)育中也發(fā)揮較為重要作用[40]。添加適量濃度的SA可以促進(jìn)姜花(HedychiumcoronariumKoen)和胡蘿卜(Daucuscarotavar.sativaHoffm.)體胚發(fā)生[41-42]。茉莉酸甲酯(MeJA)廣泛分布在植物中，影響根的生長(zhǎng)、果實(shí)成熟和非生物脅迫的反應(yīng)等過程[43]。研究發(fā)現(xiàn)，MeJA 濃度為1 μmol·L-1左右時(shí)能促進(jìn)雜交鵝掌楸(LiriodendronL.)體胚發(fā)生和體胚成熟[44]；MeJA作為花青素誘導(dǎo)劑可以有效誘導(dǎo)橡膠樹(Heveabrasiliensis)在體胚中的花青素積累[45]。以上結(jié)果表明，GA3、SA和MeJA等激素信號(hào)能夠調(diào)控植物體胚發(fā)生過程[46]。本研究通過qRT-PCR結(jié)果顯示GA3處理下3個(gè)lncRNAs及其靶基因表達(dá)量上調(diào)；SA處理下除lnc38950表達(dá)量上調(diào)外，lnc38949、lnc38952及靶基因DlSAUR63與DlSAUR64表達(dá)量下調(diào)。MeJA處理下lnc38949、lnc38950及靶基因DlSAUR64表達(dá)量上調(diào)。該結(jié)果提示DlSAUR63、DlSAUR64作為lnc38949、lnc38950、lnc38952的靶基因可能通過響應(yīng)GA3、SA和MeJA等激素信號(hào)，進(jìn)而在龍眼體胚發(fā)生早期的過程中發(fā)揮功能。

3.3 DlSAUR63/64及l(fā)ncRNAs可能響應(yīng)鹽、干旱和溫度脅迫過程

SAUR基因通過多種調(diào)控機(jī)制在植物響應(yīng)脅迫的過程中發(fā)揮重要作用。小麥(TriticumaestivumL.)TaSAUR75和TaSAUR78通過調(diào)控離子通道蛋白基因的表達(dá)，提高轉(zhuǎn)基因植株中與抗逆相關(guān)基因的表達(dá)，有效地增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因植株對(duì)旱、鹽和低溫脅迫的抗性[47-48]。擬南芥AtSAUR19基因可提高植物對(duì)干旱脅迫的敏感性[49]。過表達(dá)Mul-SAUR15基因后擬南芥對(duì)PEG脅迫和NaCl脅迫的敏感性增強(qiáng)[27]。本研究發(fā)現(xiàn)，在NaCl處理下，除lnc38950表達(dá)為上調(diào)趨勢(shì)外，DlSAUR63、DlSAUR64與lnc38949、lnc38952總體呈現(xiàn)下調(diào)表達(dá)趨勢(shì)。在PEG4000處理下lnc38949、lnc38950、lnc38952的上調(diào)表達(dá)，DlSAUR64下調(diào)表達(dá)。在溫度脅迫下，除lnc38952下調(diào)表達(dá)外，lnc38949、lnc38950及靶基因DlSAUR63與DlSAUR64總體呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)趨勢(shì)。該結(jié)果表明，DlSAUR63、DlSAUR64和3個(gè)lncRNAs能響應(yīng)鹽、干旱及溫度等非生物脅迫過程。但lncRNAs對(duì)其調(diào)控的機(jī)制可能不同，其具體的響應(yīng)機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

SAUR基因是生長(zhǎng)素早期響應(yīng)基因，對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育至關(guān)重要。本研究通過克隆DlSAUR63、DlSAUR64的CDS序列并分析DlSAUR63、DSAUR64的進(jìn)化特性，發(fā)現(xiàn)其與擬南芥SAUR親緣關(guān)系較近。此外，DlSAUR63、DlSAUR64作為3個(gè)lncRNAs的潛在靶基因，可能在球形胚形成早期發(fā)揮功能，且可能通過響應(yīng)GA3、SA、MeJA、鹽、干旱及溫度等非生物脅迫在龍眼體胚發(fā)生過程中發(fā)揮功能。該研究結(jié)果為后續(xù)解析DlSAUR63、DlSAUR64作為lncRNAs的靶基因通過參與生長(zhǎng)素生物合成途徑在龍眼體胚發(fā)生過程的作用機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。