李國(guó)良，林趙淼，張 鴻，許泳清，邱永祥，邱思鑫

(福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南方薯類觀測(cè)試驗(yàn)站，福州 350013)

光是影響植物生長(zhǎng)和發(fā)育最重要的環(huán)境因子之一，不僅可以為植物進(jìn)行光合作用提供輻射能量，而且可以作為信號(hào)分子調(diào)控其生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程[1]。位于紫外區(qū)的UV-B對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育具有雙重作用，高強(qiáng)度的UV-B對(duì)植物體產(chǎn)生損傷，影響植物正常的生理功能，是逆境因子；但低強(qiáng)度的UV-B可以調(diào)控植物光形態(tài)建成和生理反應(yīng)，是信號(hào)調(diào)控因子[2]。植物體內(nèi)含有多種可以感受光照并產(chǎn)生信號(hào)傳遞的光受體，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的植物光受體包括感受紅光和遠(yuǎn)紅光的光敏色素(phytochromes，phyA-E)、感受藍(lán)光/UV-A的隱花色素(cryptochromes，cry1和cry2)和向光色素(phototropins、phot1和phot2)[3-4]，以及感受中波紫外線(UV-B)的受體UVR8(UV RESISTANCE LOCUS8)[5]。自從擬南芥UVR8基因被第一個(gè)克隆鑒定以來(lái)，玉米[6]、番茄[7]、白樺樹(shù)[8]、胡楊[9]、蘋(píng)果[10]和紫花苜蓿[11]等越來(lái)越多植物的UVR8基因也被相繼克隆出來(lái)，并被證實(shí)與其體內(nèi)類黃酮物質(zhì)的合成調(diào)控密切相關(guān)。

甘薯屬于旋花科番薯屬植物，是中國(guó)傳統(tǒng)的糧食經(jīng)濟(jì)作物[12]。葉菜型甘薯是指以幼嫩莖葉等作為食用部位的一種蔬菜專用型甘薯品種。研究表明，甘薯莖葉含有豐富的蛋白質(zhì)、碳水化合物、氨基酸、維生素以及礦物質(zhì)等[13]。福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所于2016年育成了國(guó)內(nèi)第一個(gè)紫葉葉菜型甘薯品種‘福菜薯23號(hào)’，因其葉片含有大量花青苷類物質(zhì)而呈紫色，是研究甘薯花青素形成機(jī)理的優(yōu)良材料。已有研究表明，紫外光UV-B對(duì)植物花青素的積累有促進(jìn)作用，植物通過(guò)UVR8接收到UV-B信號(hào)后，引起了體內(nèi)MYB、bHLH和WD40等3種轉(zhuǎn)錄因子響應(yīng)，從而激活花青素合成途徑中的結(jié)構(gòu)基因，最終促進(jìn)花青素的合成[14-15]。目前，UV-B對(duì)甘薯葉片花青素合成是否具有相同的作用尚不清楚，本研究從‘福菜薯23號(hào)’中分離到IbUVR8的基因全長(zhǎng)序列，為深入研究IbUVR8在甘薯中的花青素合成調(diào)控作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所選育的葉菜型甘薯品種‘福菜薯23號(hào)’(紫葉)和‘福菜薯18號(hào)’(綠葉)、以及‘觀賞黃葉’(黃葉)3種不同葉色甘薯均種植于科研育種基地內(nèi)。為了研究3種葉色甘薯不同組織及脅迫處理后IbUVR8的表達(dá)，將生長(zhǎng)一致的3種葉色甘薯種植于培養(yǎng)盆中，放置在生長(zhǎng)室(28 ℃，70%濕度，14 h光照和10 h黑暗)中培養(yǎng)。

大腸桿菌E.coli JM109、TransStart Top Green qPCR SuperMix、RNA提取試劑、Trans 2K DNA Marker、pEASY-T1載體等購(gòu)自北京全式金生物科技有限公司。PCR擴(kuò)增引物(表1)和DNA測(cè)序由上海生工生物科技有限公司完成。其他常規(guī)化學(xué)藥品及試劑，除特別說(shuō)明外，均購(gòu)自Sigma公司或國(guó)產(chǎn)AR級(jí)試劑。

表1 試驗(yàn)中所涉及到的引物及其核苷酸序列

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 甘薯cDNA第一鏈的合成液氮研磨后, 參照TaKaRa RNAiso plus提取甘薯葉片的RNA。采用Thermo Fisher RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit合成甘薯cDNA第一鏈， 逆轉(zhuǎn)錄的程序?yàn)椋?2 ℃孵育60 min，72 ℃變性5 min， -20 ℃保存。

1.2.2IbUVR8保守序列的同源克隆根據(jù)NCBI公布的馬鈴薯UVR8序列，采用CODEHOP方法設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物。以‘福菜薯23號(hào)’cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)，最后再72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增得到DNA片段回收純化后，連接到pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化鑒定后測(cè)序。

1.2.3IbUVR8 3′和5′端的擴(kuò)增根據(jù)已知UVR8基因片段和3′-RACE原理，以‘福菜薯23號(hào)’cDNA為模板進(jìn)行IbUVR8的3′端的擴(kuò)增，設(shè)計(jì)2條巢式引物UVR8-F2和UVR8-F3。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min。取1 μL第一輪PCR產(chǎn)物作為第二輪PCR反應(yīng)的模板，以3′-F2和接頭為引物擴(kuò)增，將擴(kuò)增的DNA片段連接到T載體、轉(zhuǎn)化鑒定后測(cè)序。

按照5′-RACE原理，設(shè)計(jì)引物5′-oligo dG代替隨機(jī)引物，采用Thermo Fisher RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit合成甘薯cDNA第一鏈，逆轉(zhuǎn)錄的程序?yàn)椋?2 ℃孵育60 min， 72 ℃變性5 min，-20 ℃保存。

設(shè)計(jì)特異性引物5′-adapter和UVR8-R2，采用Touch down PCR：94 ℃變性30 s，72 ℃延伸3 min，共5個(gè)循環(huán)，94 ℃變性30 s，70 ℃退火30 s，72 ℃延伸3 min，共20個(gè)循環(huán)。將擴(kuò)增到的DNA片段連接到T載體、轉(zhuǎn)化鑒定后測(cè)序。

1.2.4 生物信息學(xué)分析基因序列的編碼區(qū)預(yù)測(cè)分析利用DNASTAR和NCBI的ORFfinder工具，同源性比較使用NCBI在線分析軟件Blast(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov)，多重序列比對(duì)使用DNAMAN軟件，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析利用在線分析軟件Protparam對(duì)IbUVR8蛋白的理化性質(zhì)進(jìn)行分析；ProtScale對(duì)IbUVR8蛋白進(jìn)行親水/疏水性分析；TMHMM 2.0進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和分析；COILS進(jìn)行卷曲螺旋預(yù)測(cè)和分析；SOPMA分析蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)；SWISS-MODEL進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)(https://www.expasy.org/)，系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)使用Cluster X2和MEGA5.1軟件構(gòu)建。

1.2.5IbUVR8在不同組織的表達(dá)分別取生長(zhǎng)1周后3種甘薯的根、莖和葉片，將所有樣品在液氮中冷凍并保存在-80 ℃的冰箱中以備后用。每個(gè)處理3次重復(fù)。

1.2.6 非生物脅迫下IbUVR8的表達(dá)特性甘薯生長(zhǎng)1周后開(kāi)始進(jìn)行脅迫處理：1)向土壤中添加0.5 mol/L NaCl 進(jìn)行鹽脅迫；2)向土壤中添加20%PEG6000 進(jìn)行滲透脅迫；3)將植物移至溫度為6 ℃的生長(zhǎng)室中進(jìn)行低溫脅迫；4)向土壤中添加100 mg/L CuSO4進(jìn)行重金屬脅迫；5)土壤中添加100 mg/L GA3處理。每種脅迫分別處理0、4、8 h，所有樣品在液氮中冷凍并保存在-80 ℃的冰箱中備用。每個(gè)處理3次重復(fù)。

1.2.7IbUVR8原核表達(dá)將IbUVR8通過(guò)同源重組構(gòu)建到原核表達(dá)載體pGEX-4T-1上，并轉(zhuǎn)化表達(dá)大腸桿菌BL21。然后進(jìn)行IPTG濃度和誘導(dǎo)溫度優(yōu)化，最終獲得IbUVR8蛋白，并進(jìn)行SDS-PAGE電泳。

2 結(jié)果與分析

2.1 IbUVR8的全長(zhǎng)cDNA克隆及生物信息學(xué)分析

2.1.1IbUVR8理化性質(zhì)分析試驗(yàn)結(jié)果顯示，從‘福菜薯23號(hào)’得到了全長(zhǎng)為1 539 bp的cDNA片段，經(jīng)NCBI-Blast分析表明，該序列為甘薯UVR8基因cDNA序列，并命名為IbUVR8，NCBI登錄號(hào)KT749986。該基因ORF長(zhǎng)度為1 329 bp，共編碼了441個(gè)氨基酸，相對(duì)分子量為47 745.20 Da，理論等電點(diǎn)為5.72。

2.1.2 IbUVR8蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)疏水作用是維持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)最重要的作用力，對(duì)蛋白質(zhì)的構(gòu)象穩(wěn)定性和功能具有重要意義。如圖1所示，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)IbUVR8蛋白有198個(gè)親水區(qū)域，67個(gè)疏水區(qū)域，蛋白平均疏水性為-0.362，為親水性蛋白。

圖1 IbUVR8親/疏水性分析Fig.1 IbUVR8 hydrophilicity and hydrophobicity analysis

利用TMHMM 2.0對(duì)IbUVR8蛋白進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)域的預(yù)測(cè)，如圖2所示，該蛋白在24～46aa位置有1個(gè)明顯的跨膜特征區(qū)域。蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)指的是蛋白質(zhì)骨架結(jié)構(gòu)中有規(guī)律重復(fù)的構(gòu)象，SOPMA分析IbUVR8二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋、延伸帶和無(wú)規(guī)卷曲各占13.12%、28.96%和57.92%。

圖2 IbUVR8的跨膜結(jié)構(gòu)域分析Fig.2 Transmembrane domain analysis of IbUVR8

SWISS-MODEL預(yù)測(cè)IbUVR8的三級(jí)結(jié)構(gòu)為類似擬南芥UVR8的結(jié)構(gòu)，均由7個(gè)片狀的β-螺旋縱向排列成環(huán)形結(jié)構(gòu)，中空形成流水通道(圖3)。WoLF PSORT預(yù)測(cè)IbUVR8亞細(xì)胞定位于細(xì)胞核。

圖3 IbUVR8的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.3 The predicted tertiary structure of IbUVR8

2.2 IbUVR8的同源性及進(jìn)化分析

蛋白序列對(duì)比結(jié)果顯示，甘薯UVR8與番茄、馬鈴薯UVR8親緣關(guān)系較近，序列相似性在85%以上；與擬南芥、蕪菁等親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，可分為兩個(gè)大類，序列相似性在70%以上，說(shuō)明UVR8的蛋白序列進(jìn)化相對(duì)保守(圖4、圖5)。

slUVR8. 番茄；stUVR8. 馬鈴薯；ibUVR8. 甘薯；bpUVR8. 白樺樹(shù)；atUVR8. 擬南芥；brUVR8. 蕪菁圖4 IbUVR8的聚類分析slUVR8. Solanum lycopersicum； stUVR8. Solanum tuberosum； ibUVR8. Ipomoea batatas； bpUVR8. Betula platyphylla； atUVR8. Arabidopsis thaliana； brUVR8. Brassica rapaFig.4 Cluster analysis of IbUVR8

UVR8在植物體內(nèi)的進(jìn)化十分保守，不僅是被子植物，且苔蘚植物、石松植物和綠藻植物與擬南芥UVR8氨基酸序列相似性都較高，尤其是關(guān)鍵氨基酸的位置和數(shù)目，包括鹽橋網(wǎng)絡(luò)中的色氨酸和精氨酸[16]。擬南芥UVR8具有吸收UV-B的特性，這個(gè)功能主要由色氨酸殘基(W233和W285)完成，IbUVR8對(duì)應(yīng)的色氨酸殘基為W240和W292。擬南芥UVR8中的R286和R338的氫鍵作用對(duì)二聚體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定十分重要，IbUVR8對(duì)應(yīng)為R293和R350[17]。

2.3 IbUVR8組織器官表達(dá)特性

qRT-PCR 結(jié)果顯示，IbUVR8在3種葉色甘薯中的表達(dá)趨勢(shì)一致，葉片表達(dá)量最高，莖段次之，根部表達(dá)量最低，且不同組織間的表達(dá)量差異顯著，表明葉片是紫外光UV-B的主要響應(yīng)部位。不同品種在同一組織部位表達(dá)量也有差異，黃葉甘薯葉片IbUVR8表達(dá)量高于另外兩個(gè)品種，推測(cè)黃葉甘薯對(duì)紫外光UV-B比另外兩種甘薯更加敏感(圖6)。

小寫(xiě)字母表示同一品種不同組織間在0.05水平差異顯著，大寫(xiě)字母代表同一組織不同品種間在0.05水平差異顯著圖6 IbUVR8在3種甘薯不同組織中的表達(dá)Different normal letters indicate significant difference in different tissues for the same variety at 0.05 level; different capital letters indicate significant difference in the same tissue for different varieties at 0.05 levelFig.6 Expression of IbUVR8 in different tissues of three leaf-colored sweet potato varieties

2.4 IbUVR8在非生物脅迫下的表達(dá)特性

在不同脅迫處理下，IbUVR8的表達(dá)結(jié)果如圖7所示，低溫、干旱和鹽脅迫處理下，3種不同葉色甘薯的IbUVR8表現(xiàn)趨勢(shì)一致，均上調(diào)表達(dá)，但品種間在同一脅迫時(shí)間有顯著性差異，如‘福菜薯23號(hào)’在干旱脅迫8 h的IbUVR8表達(dá)量顯著高于其他兩個(gè)品種，‘福菜薯18號(hào)’在鹽脅迫8 hIbUVR8表達(dá)量顯著低于另外兩個(gè)甘薯品種。激素GA3處理下，在‘福菜薯18號(hào)’和‘觀賞黃葉’中IbUVR8表現(xiàn)為先上調(diào)后下降，‘福菜薯23號(hào)’表現(xiàn)為上調(diào)趨勢(shì)，脅迫8 hIbUVR8的表達(dá)量最大，且與另外兩種甘薯有顯著差異。在重金屬銅脅迫下，3種葉色甘薯IbUVR8表達(dá)差異較大，‘福菜薯18號(hào)’的IbUVR8表達(dá)緩慢上調(diào)，‘福菜薯23號(hào)’表現(xiàn)為先上調(diào)后下降，脅迫4 h表達(dá)量最大；‘觀賞黃葉’表現(xiàn)為脅迫8 hIbUVR8表達(dá)量迅速上升到最大值，造成3種葉色甘薯表達(dá)差異的可能是對(duì)銅鹽的敏感性不同所致。

小寫(xiě)字母表示同一品種不同脅迫時(shí)間在0.05水平差異顯著，大寫(xiě)字母代表同一脅迫時(shí)間不同品種間在0.05水平差異顯著圖7 IbUVR8在非生物脅迫下的表達(dá)Different normal letters indicate significant difference at different stress time points for the same variety at 0.05 level; different capital letters indicate significant difference at the same time point for different varieties at 0.05 levelFig.7 Expression of IbUVR8 under abiotic stress

2.5 IbUVR8原核表達(dá)

將IbUVR8構(gòu)建到原核表達(dá)載體pGEX-4T-1上，并轉(zhuǎn)化表達(dá)大腸桿菌BL21。經(jīng)過(guò)IPTG濃度和誘導(dǎo)溫度優(yōu)化后，在0.5 μmol/L IPTG、16 ℃誘導(dǎo)14 h后，獲得IbUVR8-GST融合蛋白，經(jīng)SDS-PAGE電泳顯示GST蛋白為29 kD，IbUVR8-GST大小約為80 kD(圖8)。

M. Marker；1. BL21(pGEX-4T-1)誘導(dǎo)的GST蛋白；2. BL21(IbUVR8-pGEX-4T-1)未誘導(dǎo)蛋白；3. BL21(IbUVR8-pGEX-4T-1)誘導(dǎo)的IbUVR8-GST融合蛋白圖8 IbUVR8 SDS-PAGE電泳圖M. Marker; 1. BL21 (pGEX-4T-1)-induced GST protein; 2. BL21 (IbUVR8-pGEX-4T-1) uninduced protein; 3. BL21 (IbUVR8-pGEX-4T-1)-induced fusion proteinFig.8 IbUVR8 SDS-PAGE electropherogram

3 討 論

UV-B輻射調(diào)控植物形態(tài)發(fā)生是一個(gè)復(fù)雜的信號(hào)調(diào)節(jié)系統(tǒng)。UV-B信號(hào)通路分為特異性和非特異性兩類，特異性信號(hào)通路與植物形態(tài)建成相關(guān)，而非特異性信號(hào)通路大多與脅迫信號(hào)相關(guān)[18]。UVR8是目前植物體內(nèi)唯一發(fā)現(xiàn)的一種特異性吸收UV-B的光受體，自然狀態(tài)下的UVR8為二聚體，在接收到UV-B信號(hào)后解聚成單體與COP1結(jié)合，并激活下游的bZIP轉(zhuǎn)錄因子HY5，誘導(dǎo)多個(gè)代謝通路基因的表達(dá)[5, 19-20]。擬南芥UVR8由440個(gè)氨基酸殘基組成，其中，W285和W233為UVR8蛋白的關(guān)鍵發(fā)色團(tuán)，R286和R338對(duì)維持UVR8的片層結(jié)構(gòu)穩(wěn)定十分重要[16]。甘薯UVR8則由441個(gè)氨基酸殘基組成，具有與擬南芥相同的色氨酸發(fā)色團(tuán)和片層結(jié)構(gòu)，表明UVR8功能氨基酸區(qū)域和蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)化保守。早期研究發(fā)現(xiàn)擬南芥突變體uvr8-1表現(xiàn)為對(duì)UV-B敏感，查爾酮合酶(CHS)表達(dá)量低于野生型，推測(cè)擬南芥UVR8調(diào)控花青素合成基因的表達(dá)[5]；通過(guò)基因芯片技術(shù)證實(shí)擬南芥成熟葉片多個(gè)類黃酮合成途徑基因受到擬南芥UVR8的調(diào)控[21]；MYB13是近期發(fā)現(xiàn)的擬南芥UV-B信號(hào)通路另外一個(gè)正調(diào)控因子，UV-B信號(hào)誘導(dǎo)MYB13在子葉中特異地表達(dá)，并與UVR8形成復(fù)合體，促進(jìn)MYB13結(jié)合類黃酮合成途徑基因如CHS、CHI和FLS的啟動(dòng)子[22]。擬南芥中的RUP1和RUP2是兩個(gè)負(fù)調(diào)控因子，通過(guò)與UVR8蛋白的C27片段結(jié)合來(lái)抑制UVR8復(fù)合體的形成，并促進(jìn)UVR8恢復(fù)成二聚體，影響其下游調(diào)控基因[23]。因此，推測(cè)IbUVR8可能通過(guò)多個(gè)路徑影響體內(nèi)類黃酮合成基因的表達(dá)，但是否與擬南芥通過(guò)相同的調(diào)控路徑則需要進(jìn)一步研究。

研究證實(shí)UV-B脅迫與其他非生物脅迫因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路存在交互作用[24]。植物中非特異性UVR8信號(hào)途徑能夠與ABA途徑聯(lián)合作用來(lái)增強(qiáng)植物的抗旱性和抗高劑量UV-B輻射[25]。UV-B通過(guò)UVR8信號(hào)通路有效抑制高溫誘導(dǎo)的植物熱形態(tài)發(fā)生[26]。脫落酸(abscisic acid, ABA)和NaCl處理影響了白樺BpUVR8啟動(dòng)子的活性，導(dǎo)致BpUVR8表達(dá)量快速上升[8]。UV-B、鎘、低溫和鹽脅迫均誘導(dǎo)了蘿卜芽RsUVR8表達(dá)量升高，外源添加H2O2和硝普鈉(NO供體)也能誘導(dǎo)RsUVR8表達(dá)升高，這種反應(yīng)被H2O2清除劑和NO清除劑抑制[27]。本研究表明，IbUVR8表達(dá)具有組織特異性，在葉片中的表達(dá)量最高，葉片是UV-B信號(hào)直接接收部位。IbUVR8也受到低溫、干旱和鹽脅迫等的表達(dá)，呈現(xiàn)上升趨勢(shì)；在GA3和Cu2+的脅迫下，但由于品種的耐性差異，導(dǎo)致不同品種IbUVR8表達(dá)趨勢(shì)有所差異，研究表明UV-B可以通過(guò)改變赤霉素信號(hào)來(lái)影響擬南芥的根生長(zhǎng)[28]，外源施加赤霉素是否影響植物體內(nèi)UVR8響應(yīng)UV-B信號(hào)通路則需要進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究從甘薯中克隆獲得了IbUVR8基因序列，并進(jìn)行了逆境脅迫應(yīng)答分析和原核蛋白表達(dá)，研究結(jié)果為深入研究IbUVR8基因的功能及利用IbUVR8進(jìn)行甘薯葉花青素合成調(diào)控研究奠定了基礎(chǔ)。