胡葉帥，唐曉萌，王志君，黃月英，王曉君，宋洪杰（海軍軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)海醫(yī)院藥學(xué)部,上海 200433）

復(fù)方玉紅栓是長(zhǎng)海醫(yī)院特色醫(yī)院制劑，處方由磺胺嘧啶、鹽酸達(dá)克羅寧、苦參、檳榔、松香、紫草、白芷等中西藥組成，臨床使用有30 多年歷史。該藥具有消炎[1]、止痛[2]及止血[3]等作用，用于治療混合痔內(nèi)出血、內(nèi)痔水腫脫垂、單純內(nèi)痔出血等，臨床療效顯著，但目前質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅對(duì)2 種化學(xué)藥鹽酸達(dá)克羅寧和磺胺嘧啶進(jìn)行鑒別和含量測(cè)定，其他成分未制定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，有待提升。本研究建立了苦參、松香、白芷的TLC 鑒別方法，同時(shí)建立測(cè)定磺胺嘧啶和鹽酸達(dá)克羅寧含量的HPLC 方法，實(shí)現(xiàn)更好地控制本品質(zhì)量、提高療效穩(wěn)定性和可靠性、增強(qiáng)臨床使用的安全性目的。

1 材 料

1.1 儀器

島津高效液相色譜儀（包括LC-20AD 泵、SPD-M20A 二極管陣列檢測(cè)器、CBM-20A 控制器和LC solution 工作站，日本島津公司）；Goodsee-20E 型薄層成像系統(tǒng)（上?？普苌萍加邢薰荆?；BT124S 電子天平（北京賽多利斯儀器有限公司）；UV2550 紫外分光光度計(jì)（日本島津公司）；DL-720A 超聲波清洗器（上海之信儀器有限公司）；HWS24 型電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科技有限公司）；硅膠G 薄層板（上海東方藥品科技實(shí)業(yè)有限公司，規(guī)格10 cm×10 cm，批號(hào)：20190426）；硅膠GF254薄層板（上海東方藥品科技實(shí)業(yè)有限公司，規(guī)格10 cm×10 cm，批號(hào)：20141129）。

1.2 試藥

復(fù)方玉紅栓（本院自制，規(guī)格：每粒重1.4g，磺胺嘧啶25 mg、含鹽酸達(dá)克羅寧5 mg；包裝：7 粒/盒，批號(hào)：200 518、190 531、190 225），松香酸（批號(hào)A25F6C1，含量大于90%，上海源葉生物科技有限公司），磺胺嘧啶（批號(hào)100 026-201 404，含量99.7%），鹽酸達(dá)克羅寧（批號(hào)100 423-201 102、含量99.8%），苦參堿（批號(hào)110 805-201 709，含量99.6%），白芷藥材（批號(hào)120 984-200 602），苦參藥材（批號(hào)121 019-201 604）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈為色譜純，其余所用化學(xué)試劑均為分析純，水為蒸餾水。

2 方法和結(jié)果

2.1 TLC 鑒別

2.1.1 白芷

取本品7 粒（批號(hào)200 518），加乙醇200 ml，水浴加熱使溶解，放冷至室溫，抽濾，濾液揮至無(wú)醇味后，加0.1 mol/L 鹽酸溶液100 ml，加熱使溶解，靜置分層，取上層溶液，加0.1 mol/L 氫氧化鈉溶液100 ml，萃取，取下層溶液，用鹽酸調(diào)節(jié)pH 值至5，加石油醚（30～60 ℃）50 ml 萃取2 次[4]，合并石油醚層揮干，殘?jiān)右掖? ml 使溶解，作供試品溶液；同法制備缺白芷的陰性溶液；另取白芷藥材0.5 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。取上述3 種溶液各10 μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以石油醚（60～90 ℃）-乙醚（6∶5）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出晾干，置紫外燈（365 nm）下檢視。結(jié)果供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色斑點(diǎn)，陰性對(duì)照在此相應(yīng)位置無(wú)斑點(diǎn)。薄層色譜圖見(jiàn)圖1A。

2.1.2 松香

取本品1 粒（批號(hào)200518），加乙醇100 ml[5]，水浴加熱使溶解，冷藏1 h，取出過(guò)濾，取濾液揮干，殘?jiān)右掖? ml 使溶解，取上清液作供試品溶液；同法制備缺松香的陰性溶液；另取松香酸對(duì)照品適量，加乙醇溶解制成每1 ml 含松香酸1 mg 的溶液，作對(duì)照品溶液。取上述3 種溶液各10 μl，分別點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上，以石油醚（60～90 ℃）-乙酸乙酯-冰醋酸（8∶2∶0.1）為展開(kāi)劑[6]，展開(kāi)，取出晾干，置紫外燈（254 nm）下檢視。結(jié)果供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色斑點(diǎn)，陰性對(duì)照在此相應(yīng)位置無(wú)斑點(diǎn)。薄層色譜圖見(jiàn)圖1B。

圖1 復(fù)方玉紅栓的TLC 圖

2.1.3 苦參

取本品14 粒（批號(hào)200 518），加0.1mol/L 鹽酸溶液100 ml，水浴加熱使溶解，分取下層溶液，同法操作2 次合并下層溶液，加2 mol/L 氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH 值至9，加三氯甲烷50 ml 萃取2 次[7]，取三氯甲烷層揮干，殘?jiān)右掖? ml 使其溶解，作供試品溶液；同法制備缺苦參的陰性溶液；另取苦參藥材1 g，同法制成對(duì)照藥材溶液；取苦參堿適量，加乙醇溶解制成每1 ml 含苦參堿0.5 mg 的溶液，作對(duì)照品溶液。取上述4 種溶液各10 μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以環(huán)己烷-乙酸乙酯-二乙胺（5∶4∶0.5）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出晾干，噴以稀碘化鉍鉀試液顯色[8]，置日光燈下檢視。結(jié)果供試品色譜中，在與對(duì)照藥材和對(duì)照品色譜相應(yīng)位置上，顯相同顏色斑點(diǎn)，陰性對(duì)照在此相應(yīng)位置無(wú)斑點(diǎn)。薄層色譜圖見(jiàn)圖1C。

2.2 HPLC 法同時(shí)測(cè)定磺胺嘧啶和鹽酸達(dá)克羅寧含量

2.2.1 色譜條件

SHIMADZU C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為甲醇(A)-0.02 mol/L 磷酸二氫鉀溶液(B)，用磷酸調(diào)節(jié)pH 值至3.3，梯度洗脫（0～6.0 min，25 %B；6.0～25.0 min，50 % B；25.0～30.0 min，25 % B）；流速：1.0 ml/min；柱溫：室溫；檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm；進(jìn)樣量：20 μl。

2.2.2 溶液制備

（1）對(duì)照品溶液：取磺胺嘧啶對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 ml 含磺胺嘧啶0.25 mg 的溶液，作為儲(chǔ)備液1；取鹽酸達(dá)克羅寧對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 ml 含鹽酸達(dá)克羅寧0.25 mg的溶液，作為儲(chǔ)備液2；精密量取儲(chǔ)備液1 和儲(chǔ)備液2 適量，加流動(dòng)相稀釋制成每1 ml 含磺胺嘧啶50 μg、鹽酸達(dá)克羅寧10 μg 的混合對(duì)照品溶液。

（2）供試品溶液：取本品10 粒（批號(hào)200518），切碎，取約0.7 g（相當(dāng)于磺胺嘧啶12.5 mg，鹽酸達(dá)克羅寧2.5mg），精密稱定，置50 ml 量瓶中，加甲醇25 ml，90 ℃水浴加熱5 min，放冷，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，冷藏靜置1 h，濾過(guò)，取續(xù)濾液放至室溫，再精密量取續(xù)濾液5 ml，置25 ml 量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度、搖勻，作供試品溶液。

（3）陰性樣品溶液：根據(jù)處方制備不含磺胺嘧啶和鹽酸達(dá)克羅寧的陰性樣品，再按（2）項(xiàng)下方法制成陰性對(duì)照溶液。

2.2.3 專屬性試驗(yàn)

分別取“2.2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照液各20 μl 注入液相色譜儀，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，結(jié)果見(jiàn)圖2。結(jié)果表明，在混合對(duì)照品色譜相應(yīng)位置上，供試品溶液色譜圖中均具有相同保留時(shí)間的色譜峰，而陰性對(duì)照液在此處均無(wú)吸收峰，表明檢驗(yàn)方法的專屬性良好。

圖2 復(fù)方玉紅栓HPLC 色譜圖

2.2.4 線性關(guān)系考察

分別精密量取“2.2.2”項(xiàng)下（1）的儲(chǔ)備液1 和儲(chǔ)備液2 適量，用流動(dòng)相稀釋，配制磺胺嘧啶系列濃度為12.40、24.80、49.60、74.40、99.20 μg/ml，鹽酸達(dá)克羅系列濃度2.56、5.12、10.24、15.36、20.48 μg/ml的混合對(duì)照品溶液。按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件，進(jìn)樣20 μl，記錄峰面積，以對(duì)照品濃度（C）為橫坐標(biāo)，峰面積（A）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸分析，得到磺胺嘧啶和鹽酸達(dá)克羅寧的回歸方程分別為A鹽酸達(dá)克羅寧=77 680c+44 018（r=0.999 9），線性范圍2.56～20.48 μg/ml；A磺胺嘧啶=72 528C+2 862.9（r=0.999 9），線性范圍12.40～99.20 μg/ml。結(jié)果表明磺胺嘧啶和鹽酸達(dá)克羅寧在相應(yīng)范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取"2.2.2"項(xiàng)下（1）的混合對(duì)照品溶液20 μl，按"2.2.1"項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6 次；同法操作，每天進(jìn)樣1 次，共進(jìn)樣6 d，分別記錄，按峰面積計(jì)算得磺胺嘧啶和鹽酸達(dá)克羅寧的日內(nèi)精密度分別為0.07 %和0.58 %（n=6），日間精密度分別為1.60 %和1.65 %（n=6）。結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

分別取同一供試品溶液（批號(hào)200 518），在0、1、2、4、8、12 h 按"2.2.1"項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，按峰面積計(jì)算得磺胺嘧啶和鹽酸達(dá)克羅寧的RSD 分別為0.74 %和0.92 %（n=6），表明供試品溶液在12 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取本品（批號(hào)200 518），按“2.2.2”項(xiàng)下（2）的方法制備供試品溶液6 份，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄峰面積，計(jì)算磺胺嘧啶和鹽酸達(dá)克羅寧的RSD 分別為1.90 %和1.58 %（n=6），表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.8 回收率試驗(yàn)

按處方工藝制備磺胺嘧啶和鹽酸達(dá)克羅寧標(biāo)示量為80%、100%、120%的3 種樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下（2）的方法制備供試品溶液各3 份，并按“2.2.1”項(xiàng)下條件測(cè)定，計(jì)算平均回收率，結(jié)果表明磺胺嘧啶和鹽酸達(dá)克羅寧的平均回收率分別為（99.10±0.48）%、（99.54±0.68）%（n=9）。

2.2.9 含量測(cè)定

取3 個(gè)批號(hào)樣品，分別按“2.2.2”項(xiàng)下（2）的處理方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定峰面積，代入回歸方程計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 磺胺嘧啶和鹽酸達(dá)克羅寧的含量測(cè)定結(jié)果(±s,n=3)

表1 磺胺嘧啶和鹽酸達(dá)克羅寧的含量測(cè)定結(jié)果(±s,n=3)

3 討論

3.1 薄層色譜鑒別

復(fù)方玉紅栓是以混合脂肪酸甘油酯作為油脂性基質(zhì)的栓劑，中藥成分在處方中含量少，以原藥材總量計(jì)僅為4 %，油脂性基質(zhì)占比90 %，藥物受基質(zhì)影響很大，若操作過(guò)程中油脂性基質(zhì)未完全除去，中藥有效成分提取不完全，實(shí)驗(yàn)時(shí)易發(fā)生斑點(diǎn)拖尾甚至沒(méi)有斑點(diǎn)顯現(xiàn)，嚴(yán)重影響鑒別的專屬性和靈敏度，所以在操作過(guò)程中去除干擾的油脂性基質(zhì)和選擇合適提取方法至關(guān)重要[9]。根據(jù)待測(cè)藥材的成分特性，本研究在參考文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上建立了白芷、松香、苦參3 種中藥材的提取和TLC 鑒別方法，所建立的方法可以用于復(fù)方玉紅栓制劑中3 種藥材的鑒別。本研究還嘗試建立紫草和檳榔的TLC 鑒別方法，但兩者在處方中所占比例更少，大量混合脂肪酸甘油酯嚴(yán)重干擾兩味藥材的提取，因此尚未建立它們特征性的鑒別方法。

3.2 HPLC 法同時(shí)測(cè)定磺胺嘧啶和鹽酸達(dá)克羅寧含量

目前尚未見(jiàn)有同時(shí)測(cè)定磺胺嘧啶和鹽酸達(dá)克羅寧的研究報(bào)道。本研究采用甲醇-0.02 mol/L 磷酸二氫鉀溶液（用磷酸調(diào)節(jié)pH 值至3.3）為流動(dòng)相，建立了梯度洗脫條件，同時(shí)測(cè)定兩者的含量。對(duì)色譜條件考察時(shí)發(fā)現(xiàn)，隨著0.02 mol/L 磷酸二氫鉀溶液比例增加，鹽酸達(dá)克羅寧出峰時(shí)間提前，但峰形不對(duì)稱影響測(cè)定準(zhǔn)確性，經(jīng)過(guò)摸索最終確定本實(shí)驗(yàn)洗脫比例[10]。研究中考察了兩種成分的提取條件，發(fā)現(xiàn)不同的提取溫度和時(shí)間影響提取效率，鹽酸達(dá)克羅寧不穩(wěn)定[11]，遇熱易發(fā)生降解，本實(shí)驗(yàn)摸索了水浴溫度90 ℃，提取5 min 的條件，既保證了有效成分提取完全又防止了鹽酸達(dá)克羅寧的降解。

本研究首次建立了松香、苦參、和白芷的薄層色譜鑒別方法，此方法操作性強(qiáng)，斑點(diǎn)顯色清晰；用HPLC 法同時(shí)測(cè)定磺胺嘧啶和鹽酸達(dá)克羅寧，此方法的準(zhǔn)確性、重現(xiàn)性好，符合快速測(cè)定要求。本研究為該制劑全面控制藥品質(zhì)量和臨床療效提供了重要依據(jù)。