董 琦 楊晶瑩 熊子洋 肖移生

江西中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，江西省南昌市 330004

太赫茲波(Terahertz wave, THz)是20世紀(jì)80年代中后期才被正式命名的、頻率范圍在0.1～10THz、波長范圍在0.03～3mm、介于微波與紅外光波之間的一種電磁波。THz具有強(qiáng)穿透、低能性特點(diǎn),對許多介電材料和非極性物質(zhì)都有良好的穿透性，且其能量在meV數(shù)量級、是普通X射線的幾百分之一。目前，國際上普遍認(rèn)為THz是一種有很多獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)的新輻射源，會給通信、航天、電磁武器、國防、天體研究、無損安檢、生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域帶來深遠(yuǎn)的影響[1]。

已有研究發(fā)現(xiàn)，RNA、DNA、蛋白分子等重要生物分子的空間構(gòu)象、振動能級和氫鍵能等都處于THz段，故生物體被THz穿透過程時會產(chǎn)生多種獨(dú)特的響應(yīng)[2-4]。THz對腫瘤細(xì)胞有怎樣的影響目前尚未見相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用體外培養(yǎng)小鼠肺癌細(xì)胞(Lewis細(xì)胞)，研究其被THz輻射后的增殖、生長情況。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料、試劑與儀器 Lewis細(xì)胞(我院謝斌教授惠贈，引自ATCC，編號36470TM)；胎牛血清(Gibco公司產(chǎn)品)；高糖DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司產(chǎn)品)；四甲基偶氮唑鹽(MTT)、Trypan blue(臺盼藍(lán))試劑及Hoechst 33342熒光劑(碧云天公司產(chǎn)品)；752分光光度計(jì)為上海醫(yī)用分析儀器廠的產(chǎn)品；熒光顯微鏡為OLYMPUS公司產(chǎn)品。

太赫茲波輻射儀(上?？登t(yī)療科技有限公司)，本儀器是由復(fù)旦大學(xué)、中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院費(fèi)倫教授團(tuán)隊(duì)研發(fā)的太赫茲波輻射儀，可調(diào)控太赫茲波發(fā)射強(qiáng)度，擁有專利技術(shù)(專利號：ZL032311672)。太赫茲波輻射儀基本參數(shù)如下：功率：AV25W，外部可更換保險(xiǎn)絲為：Φ5×20mm F 0.5A 250V，重量：2 100g，外形尺寸：280mm×240mm×90mm，工作條件：15～40℃，相對濕度<80%，工作溫度：高檔：(40±3)℃；低檔：(33±3)℃，電源電壓的適用范圍：交流～220V 50Hz或60Hz，定時范圍[(5～60)±2]min，儲存條件：-40～55℃，相對濕度<93%，輻射頭 16只，輻射頭固定托 16只，電源線1根。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及太赫茲波輻射干預(yù) Lewis細(xì)胞復(fù)蘇后用含10%胎牛血清DMEM(高糖)培養(yǎng)液于37℃、5% CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。當(dāng)培養(yǎng)瓶內(nèi)細(xì)胞長滿至85%時，用0.125%的胰酶消化，進(jìn)行傳代培養(yǎng)，每3d換液傳代1次。

將生長良好的Lewis細(xì)胞分成正常對照組、THz低輻射組(相當(dāng)能量10meV級)、THz中輻射(100meV)組、THz高輻射(300meV)組。各THz輻射組的細(xì)胞于傳代培養(yǎng)第2天開始，每天上午9點(diǎn)和下午3點(diǎn)分別接受相應(yīng)劑量的THz輻射(每次輻射30min，2次/d)，共3d。

1.3 細(xì)胞增殖抑制率測定(MTT法) 本實(shí)驗(yàn)每組設(shè)10個復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)10次，同時配以空白組(僅加培養(yǎng)液)。到時間點(diǎn)后，96孔培養(yǎng)板的各孔加入MTT液20μl/孔，4h后終止培養(yǎng)，棄去上清，加入DMSO(100μl/孔)，振蕩使結(jié)晶物溶解，用自動酶標(biāo)儀波長570nm處測吸光度值(D570)，計(jì)算增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率(%)=(1-實(shí)驗(yàn)組平均吸光度值/對照組平均吸光度值)×100%。

1.4 Trypan blue染色細(xì)胞直接計(jì)數(shù)法 Trypan blue是一種具有陽離子特性的染料，活細(xì)胞拒染，死細(xì)胞被染成藍(lán)色。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，以1∶4的比例加入0.4%臺盼蘭使其終濃度為0.1%，染色1min后將長有神經(jīng)細(xì)胞的蓋玻片反蓋在載玻片上，5min之內(nèi)在光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)死細(xì)胞及活細(xì)胞數(shù)。隨機(jī)計(jì)數(shù)200個細(xì)胞以上，計(jì)算死細(xì)胞率(%)=死細(xì)胞數(shù)/(活細(xì)胞數(shù)+死細(xì)胞數(shù))×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)10次。

1.5 Hoechst33342熒光染色檢測 本實(shí)驗(yàn)每組設(shè)10個復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)10次。到時間點(diǎn)后，各孔加入終濃度為10μg/ml的Hoechst33342并于37℃孵育30min，再加入終濃度為1%的多聚甲醛于暗處固定細(xì)胞30min。暗處離心棄上清，取細(xì)胞涂片并用封片液封片于載玻片上。熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。在高倍鏡下隨機(jī)計(jì)數(shù)200個細(xì)胞并照相。計(jì)算凋亡率：凋亡率(%) = 凋亡細(xì)胞數(shù)/計(jì)數(shù)的細(xì)胞總數(shù)×100%。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 正常對照組的Lewis細(xì)胞生長良好，貼壁好，細(xì)胞密集，胞體透亮。THz低輻射對細(xì)胞生長影響不明顯，狀態(tài)良好，培養(yǎng)體系中死細(xì)胞極少；隨著THz輻射量加大，中、高劑量組的細(xì)胞生長狀態(tài)欠佳，數(shù)量增加緩慢，部分細(xì)胞皺縮，培養(yǎng)體系中懸浮少量死細(xì)胞，以THz高劑量組更明顯(圖1)。

圖1 THz對 Lewis細(xì)胞的影響(×400)

2.2 MTT檢測結(jié)果 THz低輻射組D值與正常對照組接近，說明THz低輻射對Lewis細(xì)胞無明顯抑制作用。THz中、高輻射兩組的D值明顯低于正常對照組D值(P<0.01)，表明增大THz輻射量能抑制細(xì)胞增殖。見表1。

表1 THz輻射對Lewis細(xì)胞生長抑制作用

2.3 Trypan blue染色計(jì)數(shù)結(jié)果 THz輻射實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，經(jīng)Trypan blue染色，正常對照組及THz低輻射組的死細(xì)胞數(shù)量少，兩組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。THz中、高輻射兩組的死細(xì)胞增多，且THz高輻射組更明顯；THz中、高輻射組分別與正常對照組比較，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。見表2。

表2 THz輻射對Lewis細(xì)胞生長的影響

2.4 Hoechst33342熒光檢測結(jié)果 Hoechst33342是特異性DNA染料，能透過細(xì)胞膜與DNA上A-T鍵結(jié)合，在紫外線激發(fā)下發(fā)出藍(lán)色熒光，根據(jù)細(xì)胞核的形態(tài)、染色質(zhì)狀態(tài)及熒光強(qiáng)度做判斷。熒光顯微鏡下，活細(xì)胞的核呈彌散均勻熒光；凋亡細(xì)胞的核或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見濃染致密的顆粒、塊狀熒光，如果見到3個或3個以上的DNA熒光碎片被認(rèn)為是凋亡細(xì)胞。 正常對照組及THz低輻射組僅見微量的凋亡細(xì)胞，兩組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。THz中、高輻射兩組的細(xì)胞凋亡率升高，分別與正常對照組比較，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)，這表明THz輻射也可誘導(dǎo)Lewis細(xì)胞凋亡。見表2、圖2。

圖2 THz對 Lewis細(xì)胞影響的熒光圖(×400)

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)生物大分子間的信息應(yīng)答、精確調(diào)控對生物分子集體振動模式引起的分子構(gòu)象、分子結(jié)構(gòu)及分子環(huán)境等變化都非常敏感。許多化合物分子內(nèi)振動模式的頻率對應(yīng)于THz范圍，比如氫鍵作用力、范德瓦爾斯力、偶極—偶極作用力、晶格振動和一些分子內(nèi)集體骨架振動等[1]。但THz對腫瘤細(xì)胞的影響尚未見報(bào)道，故了解THz對腫瘤細(xì)胞的影響具有較強(qiáng)的科學(xué)意義。

本實(shí)驗(yàn)采用體外培養(yǎng)Lewis細(xì)胞，研究其被THz輻射后的增殖、生長及凋亡等影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)THz低輻射對Lewis細(xì)胞生長、增殖幾乎無影響；THz中、高輻射能明顯抑制Lewis細(xì)胞生長、增殖，且高輻射更明顯。此外THz中、高輻射也能誘導(dǎo)Lewis細(xì)胞凋亡，故THz中、高輻射誘導(dǎo)Lewis細(xì)胞凋亡是其抑制Lewis細(xì)胞生長、增殖的機(jī)制之一。陳中等[5]采用類似的研究方法，即運(yùn)用不同劑量的THz輻射K562細(xì)胞(人白血病細(xì)胞)，亦發(fā)現(xiàn)相當(dāng)于中、高劑量THz能明顯抑制細(xì)胞存活；結(jié)合本研究結(jié)果，可提示THz具有較好的抑制腫瘤細(xì)胞存活、抗腫瘤細(xì)胞增殖的作用。從THz誘導(dǎo)Lewis細(xì)胞凋亡效果來看，以中輻射誘導(dǎo)效果更好，高輻射效果反而下降，筆者推測其原因可能THz高輻射會引起細(xì)壞死，這可為THz技術(shù)治療腫瘤提供了思路。

因RNA、DNA、蛋白分子等重要生物分子的空間構(gòu)象、振動能級和氫鍵能等都處于THz段，如核苷酸鏈的振動模式轉(zhuǎn)變成為結(jié)構(gòu)振動模式，堿基對以集體振動為主[2-4]，故筆者推測THz也影響了腫瘤細(xì)胞的分子構(gòu)象、分子結(jié)構(gòu)、分子間作用力等，從而影響了Lewis細(xì)胞的生長、增殖。但THz對生物大分子的空間構(gòu)象、振動能級和氫鍵能等有何具體影響有待深入研究。另外，有研究報(bào)道，太赫茲波輻射對小鼠后，可影響其造血功能，能增加小鼠血液中紅細(xì)胞、血紅蛋白的含量，可刺激骨髓細(xì)胞粒單系克隆形成[6]。因此，筆者推測Lewis細(xì)胞的氫鍵能、分子間作用力等生物結(jié)構(gòu)與正常細(xì)胞有不同，這可能是今后抗腫瘤方向新的突破口，其詳細(xì)機(jī)制有待深入研究。